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Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Published: April 21, 2014 doi: 10.3791/51116
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

Summary

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Abstract

Los cardiomiocitos de corazones enfermos son sometidos a procesos de remodelación de complejos que implican cambios en la estructura celular, contracción de acoplamiento excitación y corrientes iónicas de membrana. Esos cambios son probable que sea responsable del aumento del riesgo arritmogénica y las alteraciones contráctiles conducen a la disfunción sistólica y diastólica en pacientes cardíacos. Sin embargo, más información sobre las alteraciones de la función de los miocitos en enfermedades cardíacas ha llegado a partir de modelos animales.

Aquí describimos y validar un protocolo para aislar miocitos viables desde pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a operaciones de cirugía cardiaca. El protocolo se describe en detalle. Mediciones electrofisiológicas y de calcio intracelulares se presentan para demostrar la viabilidad de un número de mediciones de células individuales en cardiomiocitos ventriculares humanos obtenidos con este método.

El protocolo informó élre pueden ser útiles para futuras investigaciones sobre las bases celulares y moleculares de las alteraciones funcionales del corazón humano en la presencia de diferentes enfermedades cardiacas. Además, este método puede ser usado para identificar nuevas dianas terapéuticas a nivel celular y para probar la eficacia de nuevos compuestos en cardiomiocitos humanos, con valor de traslación directa.

Introduction

La disección de las propiedades electrofisiológicas del miocardio ha progresado notablemente después el desarrollo de técnicas para el solo aislamiento de miocitos cardiacos. También se han hecho posible los avances recientes en la comprensión de la excitación cardíaca contracción de acoplamiento (EC-Acoplamiento) por la capacidad de aislar los cardiomiocitos viables individuales que conservan todas las propiedades fisiológicas del tejido intacto. Métodos de fijación Patch se emplean rutinariamente para estudiar la función y la modulación farmacológica de las corrientes de iones sarcolema cardíaco. Grabaciones de la dinámica del calcio intracelular con Ca 2 + tintes sensibles también se llevan a cabo regularmente en los miocitos cardíacos individuales de una variedad de modelos sanos y enfermos, proporcionar datos vitales sobre la fisiología de la CE-acoplamiento, así como en las alteraciones patológicas de la intracelular de Ca 2 + homeostasis que conlleva un deterioro mecánico y aumento de la carga de las enfermedades cardíacas arritmogénica. Información de estos estudios es fundamental para la comprensión de los efectos mecánicos y electrofisiológicos de las drogas en el ámbito clínico. Sin embargo, hay diferencias entre especies específicas en las corrientes transmembrana y en las proteínas CE-acoplamiento que dan cuenta de las características específicas de potencial de acción cardíaco y la mecánica cardíaca. Por lo tanto, mientras que los estudios de miocitos aislados de mamíferos no humanos han dilucidado las propiedades biofísicas y funciones fisiológicas de los canales iónicos transmembrana específicos y proteínas CE-acoplamiento, que no proporcionan necesariamente modelos pertinentes de miocitos cardiacos humanos. Por lo tanto, el aislamiento de miocitos viables de miocardio humano es esencial para entender completamente la fisiopatología de las enfermedades cardíacas y validar nuevos enfoques terapéuticos.

Tejido auricular humano es fácilmente disponible como apéndices auriculares son a menudo descartados durante los procedimientos quirúrgicos. Estudios cuantitativos iniciales de los potenciales de acción cardiaco humanos adultos y cu iónicarrents emplean células auriculares enzimáticamente aislados 1-4. Las grabaciones de los potenciales o corrientes a partir de células humanas adultas ventriculares aislados de acción han sido posteriormente reportado 3,5-10. La mayoría de estos estudios se han utilizado células obtenidas de corazones explantados y utilizados ya sea colagenasa de perfusión de un segmento de la arteria coronaria o la exposición de cantidades relativamente grandes de tejido extirpado a la colagenasa para obtener células aisladas. Estos estudios permiten una caracterización detallada de un número de corrientes de iones transmembrana de los cardiomiocitos ventriculares humanos de corazones sanos y de pacientes con insuficiencia cardiaca terminal. Grabaciones de L-tipo Ca 2 + actual (I Ca-L) 5-7, corriente hacia el exterior de potasio transitoria (I) 8, la corriente de entrada del rectificador de potasio (I κ1) 8, los diferentes componentes de la corriente de potasio rectificadora retardada (I κ ) 9 han sido reportados. Avances y refinación deel procedimiento de aislamiento 10, permite una caracterización clara de la base iónica del aumento del potencial arritmogénica en la insuficiencia cardíaca terminal, que comprende la acción potencial de prolongación 11, retrasó después de despolarizaciones 12 y aumentó divertido corriente 13 que conduce a la despolarización diastólica y latidos prematuros.

Miocitos cardíacos adultos normalmente están aislados de animales pequeños por perfusión retrógrada de todo el corazón con diferentes mezclas de enzimas, una técnica que produce altos rendimientos de Ca 2 +-células tolerantes 14. Aislamiento de miocitos cardiacos a partir de fragmentos de tejido es inherentemente menos éxito probablemente a causa de la limitación del acceso de las enzimas a miocitos individuales en comparación con la alcanzada por la perfusión de las arterias coronarias. Debido a la limitada disponibilidad de los corazones de donantes no utilizadas, la única forma práctica de obtener células ventriculares humanos normales sobre una base regular es por digestio enzimátican de los fragmentos muy pequeños a menudo tejidos extirpados durante los procedimientos quirúrgicos electivos. El único modelo de enfermedad humana que se ha caracterizado a fondo a nivel celular es la insuficiencia cardíaca terminal, debido a la accesibilidad a los corazones trasplantados. Sin embargo, la insuficiencia cardíaca terminal se produce en una minoría de los pacientes y a menudo implica una vía común de la remodelación severa de las células del miocardio, que es relativamente independiente de la causa subyacente 15. La capacidad de evaluar la función de los cardiomiocitos individuales de los pacientes en una etapa anterior no no de la enfermedad es crucial para entender la patofisiología específica de diferentes enfermedades hereditarias o adquiridas. La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es un ejemplo elocuente. HCM es un frecuente (1/500 personas) condición cardiaca hereditaria caracterizada por hipertrofia cardiaca, aumento de alteraciones de riesgo y contráctiles arritmogénicas debido a la obstrucción del tracto de salida y la disfunción diastólica 16. Los cardiomiocitos de corazones HCM undergo unos complejos procesos de remodelación que implican cambios en la estructura celular (hipertrofia, desorganización miofibrilar) y CE-Acoplamiento 17. Sin embargo, la mayoría de la información de la disfunción de los miocitos en HCM ha venido de modelos animales transgénicos. Dado que sólo una minoría de pacientes con MCH evoluciona hacia la insuficiencia cardíaca terminal y requiere de un trasplante cardíaco, el corazón de HCM son muy rara vez están disponibles para el aislamiento de células con los métodos estándar. Sin embargo, al menos el 30% de los pacientes con MCH presentan síntomas obstructivos debido al flujo de sangre del tracto de salida alteración hipertrofia septal masiva durante la sístole (HCM) 18. La opción terapéutica disponible más eficaz para el alivio de la obstrucción en la MCH es la miectomía septal quirúrgica: durante este procedimiento quirúrgico, una porción de tamaño variable del tabique superior se elimina por vía aórtica trans. Esta porción de tabique hipertrofiado es, por tanto, disponible para el aislamiento de células del tejido fresco.

Un método para el aislamiento de ventricula humanar miocitos de pequeñas muestras endomiocárdicas individuales, transvenosos biopsia se ha desarrollado y publicado previamente 19. Hemos implementado un método para aislar miocitos septales individuales de las muestras de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a cirugía cardíaca, incluyendo pacientes con HCM sometidos miectomía septal y los pacientes sometidos a procedimientos de reemplazo de válvulas. Además de una descripción detallada del protocolo de aislamiento, electrofisiológicos representativa y Ca 2 + fluorescencia se presentan las mediciones, lo que demuestra la viabilidad de los miocitos ventriculares aislados humanos y la viabilidad de patch clamp e intracelulares de Ca 2 + Estudios.

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Protocol

Los protocolos experimentales sobre el tejido humano fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Careggi Hospital (2006/0024713; renovada mayo de 2009). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito.

1. Soluciones y Preparación del equipo

Las soluciones se describen en la Tabla 1. Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de células se encuentra en la Figura 1.

Solución CP DB KB Tuberculosis PS EB1 EB2
Reactivo (mM) KH 2 PO 4 50
MgSO4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosina 5
glucosa 140 10 20 10 10 10
manitol 100
taurina 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl 2 </ Td> 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
De NaHCO3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-piruvato 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
ácido succínico 5
EGTA 0.5
K 2-ATP 2
ácido pirúvico 5
creatina 5
KMES 115
Enzimas (U / ml) La colagenasa Tipo V 250 </ Td> 250
Proteasa Tipo XXIV 4
pH 7.4 KOH 7,3 NaOH 7.1 KOH 7.35 NaOH 7.2 KOH 7,3 NaOH 7,3 NaOH

. Tabla 1 Las soluciones utilizadas para la recogida de muestras, el aislamiento de células y caracterización funcional de los miocitos CP = solución cardiopléjica.; DB = tampón de disociación; KB = solución de Kraft-Brühe; TB = tampón de Tyrode; PS = solución de la pipeta; EB1 = tampón de enzima 1; EB2 = tampón de enzima 2.

  1. Preparar cardioplégica solución (CP). Solución de CP se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 1 semana.
  2. Preparar Ca 2 + libre de tampón de disociación (DB). Esta solución se debe usar en el día.
  3. Preparar Kraft-Brühe (KB) solución. Solución KB se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 1 Week.
  4. Preparar Ca 2 +-tampón Tyrode libre (TB). Esta solución se debe usar en el día.
  5. Filtrar todas las soluciones usando filtros de jeringa antes de su uso.
  6. Preparar el dispositivo de digestión (Figura 2), un recipiente de raspado hecho de dos cepillos enfrentadas de elastómero de silicona, uno de los cuales hace girar por un motor eléctrico. El dispositivo de la digestión es por encargo. Los detalles sobre el dispositivo de la digestión son en la Figura 8; imágenes del dispositivo son en las figuras 2 C y 2D. Lavar la cámara de tejido con etanol al 70% y agua.

2. Recopilación y procesamiento de muestras de miocardio

  1. Verter 40 ml de solución cardiplegic (CP) en un tubo de 50 ml y almacenarlo en el hielo para el transporte de muestras desde la sala operativa para el laboratorio de aislamiento de células.
  2. Recoger la muestra de miocardio ventricular de la sala operatoria inmediatamente después de la escisión, lávelo con heladaSolución de PC y guárdelo en el tubo. Utilice especímenes endocárdicos escindió del tabique ventricular entre superior durante la cirugía a corazón abierto, la ponderación> 100 mg.
  3. Rápida transferencia de la muestra al área de laboratorio; iniciar el procesamiento de la muestra dentro de los 10 min de la escisión de la muestra.
  4. Mientras se mantiene la muestra en tampón enfriado con hielo CP, retire con cuidado la capa fibrótica del endocardio con tijeras finas bajo un microscopio estereoscópico; después, cortar el tejido miocárdico para piezas pequeñas (2-3 mm de largo). Dependiendo de tamaño de la muestra de tejido, cortar una cantidad total de miocardio ventricular entre 100 mg y 1 g para cada aislamiento.
  5. Al terminar de picar carne de tejidos, la transferencia de los trozos de miocardio en el dispositivo de la digestión, con hielo limpio solución CP frío. Evitar llenar todo el volumen entre los dos cepillos de silicio (3-4 ml) con trozos de miocardio, usando no más que 1 g de tejido total.

3. Lavado y digestión de Miocardio Trozos

  1. En popaer los trozos se transfieren a la cámara de raspado del dispositivo de digestión, cambiar el tampón CP en la cámara de frío Ca 2 +-tampón de disociación libre (DB).
  2. Coloque el dispositivo de digestión en un baño termostático, a fin de que la cámara para estar en contacto con el agua caliente en el baño (Figura 1). Ajuste el baño maría a 37,5 ° C y encenderlo, a fin de elevar lentamente la temperatura de la cámara de tejido. Encienda el motor del dispositivo de la digestión, el establecimiento de la velocidad de rotación a 1 revolución / segundo.
  3. Realizar 3 ciclos de lavado con DB, cambiando la solución en la cámara limpia con DB cada 8 min. La DB se calienta (37 ° C) y oxígeno saturado antes de entrar en contacto con los trozos de miocardio.
  4. Preparar tampón de enzima 1 (EB1) mediante la adición de 250 U / ml de colagenasa Tipo V y 4 U / ml de proteasa tipo XXIV solución DB. Prepare el tampón de la enzima 2 (EB2) mediante la adición de 250 U / ml de colagenasa tipo V a la solución de base de datos. Calentamiento (37 ° C) y oxygenate EB1 y EB2.
  5. Realizar dos ciclos de 12 min de la digestión en el dispositivo de la digestión de rotación con 100% EB1 oxigenada (a 37 ° C). En cada ciclo, usar ~ 3 ml de EB1. Eliminar la solución por aspiración de la pipeta y desecharla después de cada ciclo.
  6. Preparar 6 tubos de 15 ml para la recogida de células y ~ 80 ml de solución KB frío (4 ° C) para eluir los tampones.
  7. Lleve a cabo un primer ciclo de digestión de 15 minutos con 3 ml 100% EB2 oxigenada a 37 ° C. Después de que el ciclo de digestión, recoger la solución que contiene los primero miocitos disociadas en un tubo de 15 ml y diluir la suspensión celular con 12 ml de solución KB frío. Guarde la plana tubo a temperatura ambiente.
  8. Diluir la solución EB2 restante con una cantidad igual de DB con el fin de reducir a la mitad la concentración de colagenasa V para los siguientes ciclos de digestión.
  9. Lleve a cabo otros ciclos 5 12 min de digestión con 3 EB2 ml a 37 ° C; después de cada uno de ellos recoger de los miocitos que contiene tampón en un tubo cónico de 15 ml y sediluir con 12 ml de solución de KB. Guarde los tubos de células que contiene 6 a temperatura ambiente durante 30 min.

4. Resuspensión celular y Ca 2 + Readaptación

  1. Añadir 1 mg de albúmina / ml de suero bovino (BSA) a 20 ml de tampón de Ca 2 +-Tyrode libre (TB). Se filtra la solución.
  2. Centrifugar los seis tubos cónicos de miocitos que contiene a 100 xg durante 5 minutos a la fuerza para resolver los miocitos. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en cada tubo con una cantidad variable (1-3 ml, dependiendo del rendimiento) de BSA que contiene la TB a TA.
  3. Aumente gradualmente concentración de Ca2 + en el tampón de células que contiene añadiendo pequeñas alícuotas de 100 mmol / L de solución de CaCl2. En los primero y segundo pasos concentración de Ca2 + se eleva hasta 50 mmol / L y 100 mmol / L, respectivamente. Los siguientes pasos Ca 2 + de adición se llevan a cabo cada 5 min y la concentración se eleva por 100 mol / L en cada paso tOA concentración final de 0,9 mmol / L.
  4. Evaluar el rendimiento del procedimiento de aislamiento. Transferir 0,5 ml de solución de los miocitos que contiene en la cámara de fondo de vidrio de un microscopio. Evalúe 15 campos microscópicos aumento de 10x objetivo y calcular el porcentaje de miocitos sanos (por ejemplo, células con forma de bastón con estrías claras y sin inclusiones importantes, Figura 2). El rendimiento esperado es de alrededor de 20%.

5. Evaluación funcional de los cardiomiocitos aislados.

El siguiente protocolo es un ejemplo de la evaluación funcional de los cardiomiocitos humana incluyendo registros simultáneos de los potenciales de acción y intracelular de Ca 2 + flujos.

  1. Preparar la solución de la pipeta (PS) para los experimentos de patch clamp en la configuración de parche perforado. La solución puede ser almacenada a -20 ° C durante hasta 3 meses.
  2. Añadir 1,8 mmol / L CaCl2 al Ca 2 + tampón Tyrode libre (TB). Usí esta solución para superfusion de los cardiomiocitos durante los experimentos de patch clamp / fluorescencia.
  3. Transferencia de 1 ml de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml y añadir 10 mmol / L de Fluoforte y 10 l Powerload Concentrado. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, ajuste el tubo en posición vertical y salir de la celda que conformarse con 5 min; resuspender las células en Ca 2 + que contiene la tuberculosis.
  4. Transferir 0,25 ml de suspensión de células a una pequeña (0,5 ml), microscopio de temperatura controlada montado cámara de registro, superfused por gravedad con un sistema de microperfusor se calentó a una velocidad de flujo de 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C).
  5. El uso de un extractor de micropipeta, preparar pipetas patch clamp con un diámetro de la punta de 3 a 5 micras y una resistencia de 3 a 4,5 M cuando se llena con PS.
  6. Añadir anfotericina B a un lote de PS (250 mg / ml) y utilizarla para rellenar los electrodos.
  7. Seleccione una celda en forma de barra con estrías claras, libre de inclusiones, form el sello giga y esperar 5 a 10 minutos, hasta que la resistencia de acceso es inferior al 20 MΩ.
  8. Obtener los potenciales de acción en el modo de pinza de corriente utilizando pulsos cortos (<3 ms) a diferentes frecuencias de estimulación (0,2 Hz, 0,5 Hz y 1 Hz, 1 min en cada frecuencia). Durante la fase de grabación, encender iluminación de campo brillante a 492 ± 3 nm y detectar Fluoforte fluorescencia a 505-520 nm. Adquirir la fluorescencia y la membrana señales potenciales utilizando Digidata 1440A y software de ordenador pClamp 10.0. Repita la secuencia de la grabación varias veces si es necesario; sin embargo, mantener el tiempo de grabación total por debajo de 15 min para cada celda.

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Representative Results

Se empleó el método descrito anteriormente para caracterizar las anormalidades funcionales de cardiomiocitos aislados del tabique interventricular de pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH) que se sometieron a la operación miectomía, en comparación con los pacientes no quirúrgicos que fallan no hipertróficas 21. Los resultados que figuran en esta sección se derivan de que el trabajo 21 y se muestra aquí como un ejemplo de cómo esta técnica se puede utilizar para caracterizar las alteraciones de la función celular miocárdica en condiciones de enfermedades cardiacas.

Una muestra quirúrgica representante de un paciente con MCH se muestra en la Figura 2A. Muestras quirúrgicas fueron muy variables en cuanto a tamaño y el grosor de las rayas fibroso del endocardio. La cantidad de tejido miocárdico que utilizamos para cada procedimiento de aislamiento a partir de muestras de HCM fue de alrededor de 1 g. En lugar de ello, la cantidad de tejido utilizado para las muestras de control era más pequeña (100-500 mg.), Debido LoweR disponibilidad de tejido. El rendimiento fue significativamente mayor cuando se procesaron muestras de control con respecto al HCM, probablemente debido a la cantidad relativa de células miocárdicas viables dentro del tejido se reduce en la miocardiopatía hipertrófica del miocardio y la fibrosis endomiocárdica se aumenta 22. De estas observaciones se concluyó que la cantidad requerida de tejido para obtener células viables puede ser variable dependiendo de la ausencia o presencia de enfermedad miocárdica.

Las muestras se cortaron en pequeños trozos como se muestra en la Figura 2B. Después, los trozos se transfirieron a la cámara del dispositivo de digestión (Figura 2C) y se utilizaron para el aislamiento de células individuales como se describe anteriormente (Figura 2D). Fotomicrografías representativas de una suspensión de células obtenida mediante el procedimiento de aislamiento de células descrito a partir de una muestra de septo interventricular se muestran en las Figuras 3A y 3B; imágenes ampliadas de un solo ca ventricularrdiomyocytes se representan en las Figuras 3C-3F. Los cardiomiocitos a partir de muestras de HCM se utilizaron para las grabaciones simultáneas de los potenciales de acción y de Ca2 + intracelular variaciones como se describe en la sección de protocolo. Trazas simultáneas representativo que muestra voltaje de la membrana (arriba) y intracelular de Ca 2 + (abajo) durante la estimulación a 3 frecuencias diferentes se muestran en la Figura 4: estas trazas se registraron a partir de una sola cardiomiocitos aislados a partir de una muestra de la MCH.

Resultados de los estudios de pinzamiento zonal mostraron que la duración potencial de acción (APD) se registraron a diferentes frecuencias de estimulación se prolonga notablemente en los cardiomiocitos de los pacientes con MCH (cardiomiocitos HCM) en comparación con los controles (Figura 5A y 5B). Para comprobar el mantenimiento de las respuestas fisiológicas en miocitos aislados, hemos probado los efectos de isoproterenol, usado a 10-7 M (Figura 5C): β-adrenerGIC estimulación produce el acortamiento AP espera en los miocitos de control. Desde prolongado APD conduce a un mayor riesgo de temprano después de despolarizaciones (EAD) 23, la aparición de los EAD, detecta despolarizaciones espontáneas durante la fase de meseta del PA, se midió. En cardiomiocitos HCM, EADS fueron significativamente más frecuentes en comparación con los controles (Figura 5D). Rastro Representante mostrando múltiples EAD se muestra en la Figura 5E

Para probar si más largos anomalías actuales APD y de iones pueden afectar a los mecanismos de acoplamiento excitación-contracción de los cardiomiocitos de HCM, las propiedades de Ca 2 + intracelular variaciones fueron evaluados durante la estimulación. La amplitud de Ca 2 + transitorios evocados en las condiciones actuales-clamp fueron similares en comparación con el control HCM cardiomiocitos (Figura 6A). Por el contrario, la cinética de Ca 2 + transitoria, fueron significativamente más largos en la MCH (figura6B). Además, intracelular diastólica concentración de Ca2 + fue marcadamente mayor en comparación con el control HCM cardiomiocitos (Figura 6C) y aumentó de manera más prominente en aumento en la frecuencia de estimulación.

En particular, los cardiomiocitos aislados con este método a partir de muestras ventriculares humanos también se han empleado con éxito para otras aplicaciones, incluidas las grabaciones de fijación de voltaje de las corrientes transmembrana específicos (Figura 7A), intracelular de Ca 2 + y / o celular acortando grabaciones durante la estimulación de campo eléctrico (figura 7B) y la evaluación de la estructura fina del sarcolema usando microscopía confocal y etiquetas fluorescentes unidas a la membrana (Figura 7C).

Figura 1 Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de aislamiento celular.

Figura 2
Figura 2. Procesamiento de las muestras para el aislamiento de células ventriculares. (A) Imagen representativo que muestra una muestra del miocardio ventricular de un paciente con MCH que se sometió a operación de miectomía septal. Calibración barra = 5 mm. (B) Los trozos de corte ventricular con tejidos de una ventriculares pieza quirúrgica, que se utilizarán para el aislamiento de células. La barra de calibración = 5 mm. (C) Las imágenes del dispositivo de digestión. El dispositivo comprende una cámara de digestión con dos cepillos de silicio: el cepillo superior es capaz de girar cuando es movido por un motor (D) Imagen que muestra el dispositivo de la digestión en el baño termostatizado durante la digestión enzimática de tejido ventricular.. p>

Figura 3
Figura 3. Cardiomiocitos ventriculares humanos aislados. (AB) El panel muestra microfotografías de dos campos de microscopio (10x objetivo) que muestran suspensiones cardiomiocitos representativas. De nota, aproximadamente el 30% de las células son de forma de vástago y mostrar estrías claras. La barra de calibración = 100 m. (CE) Imágenes representativas de 3 cardiomiocitos humanos aislados de una muestra de un paciente con HCM (40x objetivo). La barra de calibración = 20μm. (F) La imagen muestra un cardiomiocitos ventriculares humanos tocados por la punta de la pipeta parche para grabaciones. La barra de calibración = 20μm.

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Figura 4. Grabación simultánea de potencial de membrana y de calcio intracelular. Traza representativo que muestra el potencial de membrana (arriba) y intracelular de calcio (a continuación) registró a partir de un solo miocito aislado a partir de una muestra de HCM. El miocitos se estimula a través de la pipeta parche a 0,2 Hz, 0,5 Hz y 1 Hz.

La figura 5
Figura 5. Alteraciones de los potenciales de acción en cardiomiocitos ventriculares de muestras de HCM. (A) Representante superpone potenciales de acción suscitó a 0.2 Hz, 0,5 Hz y 1 Hz de un miocito control (izquierda, huellas grises) y una miocitos HCM (derecha, rastros negros ). (B) Promedio de la duración potencial de acción en el 90% de la repolarización (APD90%) en HCM (n = 81) ycardiomiocitos de control (n = 29) en las tres frecuencias de estimulación probados. (C) Incidencia de EAD en cardiomiocitos de pacientes con MCH y muestras de control. (D) Superpuesta potenciales de acción a 0,5 Hz de un miocito control en ausencia (trazo continuo) y en la presencia de 10 -7 M de isoproterenol. (E) traza representativo que muestra el potencial de membrana de un cardiomiocitos a partir de un paciente de HCM mostrando varios despolarizaciones espontáneas que se producen durante la fase de meseta (temprano después de las despolarizaciones, EADS), marcadas por las flechas. Los estímulos están marcados por líneas cortas por debajo de la traza. ** = P <0,01 test t no apareado. Todos los paneles de la figura se modifican con el permiso de Coppini et al. 2012 21.

La figura 6
Figura6. Alteraciones de los transitorios de calcio en los cardiomiocitos ventriculares de muestras de HCM. (A) Representante superpone transitorios de calcio provocadas durante la estimulación en el 0,2 Hz a través de la pipeta de parche en un miocito control (gris) y una célula de HCM (negro). Cabe destacar que la amplitud de Ca 2 + transitorios no difiere entre las dos células (B) cinética de Ca 2 + transitorios en HCM (n = 42) y control (n = 24): los cardiomiocitos. Tiempo de estímulo a pico transitorio (TP ), se muestra el tiempo de pico a 50% de disminución (T50%) y el tiempo de pico a 90% decadencia de transitorio (T90%). (C) rastros largos representativos que muestran intracelular de Ca 2 + durante la estimulación a las 3 frecuencias diferentes en HCM y miocitos de control, destacando el aumento de Ca 2 + diastólico a altas frecuencias de estimulación en el miocito HCM. (D) Normal diastólica Ca 2 + en el HCM (n = 42) y control (n = 24) en cardiomiocitos 3 ra ritmo diferentetes. ** = P <0,01 test t no apareado. Todos los paneles de la figura se modifican con el permiso de Coppini et al. 2012 21.

La figura 7
.. Figura 7 Aplicaciones adicionales experimentales utilizando miocitos ventriculares humanos (A) Izquierda: representante superpone trazas que muestran L-tipo Ca 2 + actual registrada bajo fijación de voltaje a diferentes tensiones de membrana con un protocolo específico (ver 21 para más detalles). Derecha: normal L-tipo Ca 2 + densidad pico de corriente de 18 células aisladas a partir de muestras de HCM en diferente membrana. Tensiones. (B) intracelular de Ca 2 + rastrear grabado desde un miocito ventricular durante la estimulación del campo eléctrico a 1 Hz. (C) Confocal imagen de un cardiom ventricularyocyte partir de una muestra de HCM teñido con un colorante fluorescente unido a la membrana (Di-3-ANEPPDHQ). Es de destacar que la densidad de ttubules es baja, lo que sugiere la remodelación de la membrana morfológica en HCM.

Figura 8
Figura 8. El dispositivo de la digestión. (AB) Componentes del dispositivo de digestión. Un motor giratorio de velocidad variable está conectado a un primer brazo de plástico, que está conectado a un segundo uno. El segundo brazo de plástico es extraíble y conectado a la escobilla superior. Cepillos están hechos con elastómero de silicona. Un molde negativo de PTFE, con 100 agujeros espaciados ~ 1,5 mm se utiliza para emitir los cepillos de silicona líquida. El espacio interior del molde tiene 1,9 cm de diámetro y es de 6 mm de espesor, la producción de cepillos del mismo tamaño. Los orificios situados en un lado del molde se realizan con el fin de producir cerdas largas 8 mm cuando los cepillosse emitan y se retira del molde. Después de la silicona líquida se pone en el molde, por lo menos 48 h se necesitan para el endurecimiento completo. Cepillos están montados dentro de un tubo de vidrio (diámetro interior = 2 cm; grosor de 2 mm) y la cámara cilíndrica formada por los dos cepillos y las paredes de vidrio sellado herméticamente por dos juntas tóricas de caucho. Cepillos necesitan ser empujados uno a otro; el inferior se pega en una base de plástico, mientras que la superior está pegado al extremo de plástico del brazo del motor y por lo tanto es capaz de girar. (C) vistas de la escobilla superior ampliada. De nota, el cepillo debe ser pegada al extremo del brazo del motor con el fin de que gire (D) Los componentes de la cámara se muestran en su posición final. El espacio entre los dos cepillos (Cámara real) es de ~ 2 cm de ancho y 7-8 mm de altura; Este espacio se adapta fácilmente 3-4 ml de tampón, excepto hasta 1 g de tejido miocárdico.

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Discussion

Hemos descrito y validado un método para aislar miocitos viables a partir de muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. A partir de los protocolos descritos anteriormente que había sido utilizado con éxito para células aisladas a partir de muestras quirúrgicas auriculares, la técnica para permitir la separación de los miocitos viables individuales de miocardio ventricular enferma fue desarrollado y afinado. Los primeros informes mostraron que el aislamiento de los cardiomiocitos individuales de trozos de tejido auricular y ventricular con discapacidad selectivamente repolarización corrientes de potasio, lo que resulta en la alteración de las propiedades electrofisiológicas y las respuestas a los estímulos fisiológicos 8,24, mientras que la entrega de la enzima que contiene tampón a través de la perfusión coronaria no perjudicó retraso rectificador corrientes en las células del aislante 25. Desafortunadamente, el aislamiento de los miocitos ventriculares humanos a partir de muestras quirúrgicas de miocardio ventricular no se puede realizar por perfusión coronaria desde la integridad de las ramas coronariasse pierde, en desacuerdo con corazones explantados. Los cardiomiocitos aislados de trozos de miocardio utilizando nuestro método muestran una clara adaptación de duración potencial de acción en respuesta a los cambios de la frecuencia de estimulación o β estimulación adrenérgica. Para que este tipo de respuestas que se produzca, se requiere la integridad de los canales de potasio rectificador retardados 26-28, lo que sugiere la integridad general de los canales que no se ve afectada por nuestro método de aislamiento. Además, las células aisladas con nuestros métodos no sólo muestran respuestas electrofisiológicas normales (Figuras 3 y 4), pero también muestran los transitorios de calcio de la forma y la duración prevista (Figuras 3 y 5) y la organización sarcomérica regular (Figura 2) y las propiedades de acortamiento (no se muestra), lo que sugiere que la integridad estructural global de las células se conserva por este procedimiento de aislamiento. El principal avance de este método respecto a los anteriorestécnicas es proporcionado por el dispositivo de la digestión de nuevo diseño, que ofrece agitación mecánica suave de trozos de tejido, lo que permite la separación de células individuales sin daños excesivos. Por otra parte, el uso del dispositivo de la digestión nos permitió empleamos una menor concentración de enzimas en el tampón de aislamiento de células; en particular, estamos utilizando una concentración mucho más baja de la proteasa no selectiva en comparación con los métodos de informes anteriores 24. El dispositivo está hecho a medida en nuestro laboratorio: esquemas de construcción se presentan en la Figura 8.

El diseño y la estructura simple hace que sea muy fácil de replicar para un resultado exitoso de este protocolo. La leyenda de la Figura 8 también se describen los procedimientos necesarios para la producción de los cepillos de silicona y la construcción de la cámara de raspado. Debido a las ventajas del dispositivo de digestión, un número relativamente alto de células viables se puede obtener a partir de una cantidad relativamente baja de tejido ventricular (tan bajo como 100 mg).Un método publicado previamente 19 se muestra para proporcionar un calcio miocitos tolerantes a partir de pequeñas biopsias (incluso <20 mg). Sin embargo, el rendimiento de los miocitos reportado fue muy baja y los autores no mostró si las células aisladas con ese método eran factibles para la caracterización del ciclo del calcio intracelular y la función contráctil. Esta técnica es potencialmente aplicable a muchos pacientes quirúrgicos, ya que las pequeñas porciones del tabique interventricular se extirpan con frecuencia durante los procedimientos de sustitución de la válvula (por ejemplo. Reemplazo de la válvula aórtica). Sin embargo, el punto crucial para obtener un aislamiento exitoso es un rápido inicio del procedimiento después de la toma de muestra de la sala de operaciones. Por lo tanto, se requiere para el laboratorio de células para estar en estrecha proximidad a la clínica de la cirugía cardíaca, a fin de que esta técnica para ser fructífero. Además, una actividad de la enzima adecuada también es extremadamente importante para un aislamiento exitoso. Dado que la actividad de la proteasa no selectiva Of cada lote de colagenasa por lo general no se ha probado completamente, cada lote es probable que se realice de manera diferente durante el aislamiento celular. Por lo tanto, es esencial para afinar la concentración final de la colagenasa con el fin de lograr los mejores resultados. Sugerimos observando suspensión de células en el microscopio en cada ciclo, con el fin de asegurarse de que las células viables empiezan a aparecer en el ciclo 3 aparición temprana de células sugiere que la actividad enzimática excesiva y pide a la reducción de la concentración de enzima.; aparición de células después de ciclo de 3 sugiere la actividad enzimática insuficiente. En nuestra experiencia, este es el indicador más eficaz de la concentración de la enzima correcta.

Hemos utilizado con éxito este método para obtener cardiomiocitos individuales del tabique inter-ventricular de pacientes con MCH con obstrucción del tracto de salida del ventrículo izquierdo someterse miectomía septal quirúrgica, así como de no fallan los pacientes quirúrgicos no hipertróficas 21. Los resultados de ese documentomuestran que los miocitos aislados con este método se pueden emplear para la completa evaluación electrofisiológica con las técnicas de patch clamp, mientras que al mismo tiempo la evaluación de anomalías CE de acoplamiento, mediante el registro de la dinámica del calcio intracelulares con colorantes fluorescentes. El procedimiento de grabación aquí descrito nos permitió recogemos varios parámetros fisiológicos de células con una única grabación de cada célula, produciendo de este modo una gran cantidad de datos con un número limitado de células y muestras. Gracias a estas ventajas, este método ha sido utilizado con éxito para caracterizar las anormalidades funcionales específicos de cardiomiocitos ventriculares de pacientes con MCH, en comparación con los pacientes no hipertróficas 21. Anomalías de las corrientes de iones y duración potencial de acción, así como las anomalías cinéticas od intracelular de Ca 2 + en bicicleta fueron identificados claramente con esta técnica, con una alta reproducibilidad. Además, hemos demostrado que el tratamiento con un inhibidor selectivo de finales de Na + vs. placebo en pacientes con MCH de 29 años, que se encuentra actualmente en curso.

Disponibilidad espécimen cardiaca humana es relativamente modesto, incluso en centros especializados, y esto puede limitar una amplia aplicabilidad de esta técnica. Sin embargo, la calidad de la información que se puede obtener directamente a partir de muestras de pacientes sobre los cambios relacionados con la enfermedad en función de los cardiomiocitos es comparable a la que puede conseguirse a partir de modelos animales de la MCH y otras enfermedades cardiacas. Dadas las amplias diferencias entre elfisiología de los miocitos cardíacos humanos y murinos, los datos de la evaluación funcional de los miocitos humanos puede ser muy valiosa. Como conclusión, creemos que las futuras aplicaciones de esta técnica pueden contribuir de manera significativa al conocimiento de las enfermedades cardíacas, ya que nuestro protocolo proporciona la posibilidad de realizar una serie completa de evaluaciones funcionales directamente sobre las células a partir de muestras de pacientes, con el valor de la traducción inmediata.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea (PEIF Proyecto 241577 "gran corazón", 7 º Programa Marco Europeo, CP), Menarini Internacional Luxemburgo Operaciones (AM), Teletón GGP07133 (CP) y Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

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References

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Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

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