Den etablerade tekniken för att ympa primära invasiva orthotopic blåscancer implanterad kräver laparotomi och mobilisering av urinblåsan. Detta förfarande orsakar betydande sjuklighet på mössen, är tekniskt utmanande och tidskrävande. Vi utvecklade därför en hög precision, perkutan tillvägagångssätt använder ultraljud.
Orthotopic blåscancer xenografter är guldmyntfoten för att studera molekylära cellulära manipulationer och nya terapeutiska medel in vivo. Lämpliga cellinjer inokuleras antingen genom intravesikal instillation (modell av nonmuscle invasiv tillväxt) eller intramural injektion i blåsväggen (modell av invasiv tillväxt). Båda förfarandena är komplicerade och mycket tidskrävande. Dessutom har den ytliga modell sina brister på grund av bristen på cellinjer som är tumörframkallande efter tillförseln. Interna injektion, å andra sidan, är behäftad med invasivitet av förfarandet och den associerade sjukligheten för värdmusen.
Med dessa brister i åtanke, ändrade vi tidigare metoder för att utveckla en minimalinvasiv metod för att skapa orthotopic blåscancer implanterad. Med hjälp av ultraljud har vi framgångsrikt utfört perkutan ympning av cancer i urinblåsan cellinjer UM-UC1, UM-UC3 och UM-UC13 i 50 atymiska nakna. Vi har kunnat visa att denna metod är tidseffektivt, exakt och säker. Med denna teknik är initialt ett utrymme skapas under blåsans slemhinna med PBS, och tumörceller injiceras sedan in i detta utrymme i ett andra steg. Tumörtillväxten kontrolleras med jämna mellanrum med mareld imaging och ultraljud. Den genomsnittliga tumörvolymerna ökat stadigt i alla utom en av våra 50 möss under studieperioden.
I vår institution, denna nya metod, som gör att cancer i urinblåsan xenograft ympning i en minimalinvasiv, snabb och mycket exakt sätt, har ersatt den traditionella modellen.
Cancerforskning är beroende av djurmodeller av human cancer med hjälp av cellinjer som härrör från patientens tumör för att fördjupa vår förståelse av tumörbiologi. För in vivo-tillväxtanalys under olika behandlingsstrategier murina orthotopic blåscancer modeller förblir referensstandard 1,2. Ympningen av humana blåscancerceller i immunförsvagade möss (xenograftmodell) förlitar sig på intravesikal instillation ("intravesikal model") 3,4,5 eller direkt injektion i blåsväggen ("intramural model") 6,7. Båda teknikerna kan också utföras på råttor 8,9.
Intravesikal instillation inducerar bildandet av tumörer på urothelial ytan av urinblåsan, som sedan kan bli föremål för efterföljande intravesikal instillation av nya behandlingsmedel. Emellertid är antalet cellinjer som är tillförlitligt tumorogen när de levereras via denna metod begränsas end en av dessa cellinjer, KU7, har nyligen visats vara HeLa 4,10. Intravesikal instillation är också tidskrävande på grund av nödvändiga uppehållstider, och det framkallar ofta tumörtillväxt i angränsande delar av urinvägarna, inklusive urinröret, urinledaren och njurbäckenet 11. Vidare leder intravesikal instillation ofta till tumörtillväxt på golvet i blåsan där urinledarna in i blåsan, och detta kan orsaka övre vägsobstruktion och åtföljande njursvikt.
Primära invasiva blåscancer xenotransplantat som är lämpliga för systemisk behandling är skapade genom direkt injektion av tumörceller in i blåsväggen 12. Trots att många cellinjer växer tillräckligt i denna modell, är dess begränsning av invasiv av modellen i samband med behovet av en buksnitt 13. Modellen är också en utmaning att lära sig på grund av tekniska svårigheter att injicera cellerna exakt in i muskelväggenav urinblåsan.
En ny metod för att fastställa orthotopic primär invasiv blåscancer implanterad i möss har utvecklats i vår avdelning för att åtgärda befintliga brister i det "intramural modellen". Vi kunde optimera perkutan, ultraljud-guidad injektion av urinblåsan cancerceller i främre blåsväggen vilket resulterar i denna nya teknik för att lyckas ersätta den etablerade invasiva modell. Dessutom har vi potentiellt förbättrad noggrannhet och reproducerbarhet "intramural modellen".
Nästan alla stora framsteg inom cancerterapi kräver tester i djurmodeller innan man inleder kliniska studier. Djurmodeller av cancer är viktiga verktyg som gör det möjligt för forskare att studera tumörbiologi in vivo. Orthotopic xenograft modeller förblir guldmyntfoten 1,2 och fortsätter att erbjuda den mest flexibilitet (i urval av cellinjer) och ha den mest praktiska verktyget.
Den illustrerade förfarandet är en minimalt invasiv modifiering av orthotopic modell som tidigare beskrivits av Dinney et al. 12 Vi etablerade xenotransplantattumörer genom ultraljud guidad perkutan injektion av tre olika cellinjer med en teknisk framgång på 100%. Under kontinuerlig uppföljning, 98% av mössen visade konstant ökning av tumörvolym.
Genom att utföra en minimalinvasiv teknik kunde vi ta itu med befintliga begränsningar i intramural modell. Förutom respecting djurskydd, den reducerade invasivitet av detta förfarande bidrar också till reproducerbarhet för experiment in vivo genom att minska antalet av kirurgiska komplikationer. Det är mycket tid effektivt för att undvika en buken laparotomi och tillhörande behov av tillslutning av sår. Vi kunde minska avsevärt förfarandet tid per djur till 3,4 min (± 1,6). Dock är den främsta fördelen med vår nya strategi dess riktighet. Högupplösande ultraljud, tillåter oss att visualisera det utrymme som skapas av saltlösning injektion under slemhinnan i urinblåsans vägg. Detta första steg injektion underlättar tumörcellinjektion i ett andra steg och minimerar risken för tumörcells spill. Detta står i kontrast till den teknik för intramural injektion efter laparotomi, där det är omöjligt att visualisera nålens placering och det finns alltid ett element av osäkerhet om det exakta djupet av injektion. Också, eftersom vi ympa tumörceller strikt i främre blåsväggen, tumör growth på den bakre blåsväggen undviks. Därefter graden av obstruktiva komplikationer på grund av tumörtillväxt i närheten av de uretär mynningar är extremt sällsynt. Denna åtföljande effekt tillåter längre tillväxt-och behandlingsperioder.
Den största begränsningen av ultraljud-styrda tumörympning är behovet av lämplig teknisk utrustning. Därför utförandet av detta förfarande kommer troligen att begränsas till centra som är specialiserade på djurmodeller av cancer hos människor. Detta bör uppmuntra samarbeten mellan forskargrupper utanför dessa institutioner och med expertis i en sådan roman djur modellering.
Även beroende av förtrogenhet med ultraljud och lite fingerfärdighet, är lätt att lära sig under kompetent undervisning denna modell. Nyckel steget i förfarandet är att skapa en konstgjord utrymme submukosalt i blåsväggen med saltlösning. När detta utrymme skapas utan perforering of slemhinneskiktet, förblir den stabil under flera minuter. Ledning av den andra nålen in i detta utrymme för att inokulera tumörcellerna är relativt enkel. Huvud komplikation under skapandet av submukosala utrymmet är perforering av nålen in i urinblåsan lumen. Skapandet av en submukosala utrymme är dock fortfarande möjlig. Nålen måste dras långsamt in i blåsväggen och koksaltlösning injiceras precis när slemhinneskiktet flippar över nålspetsen. Efter denna manöver submukosala utrymmet är mindre stabil (koksaltlösning kommer att fly till urinblåsan lumen inom 30-60 sek) och injektion av tumörcellerna måste genomföras snabbt. Spill av tumörceller in i blåsan lumen kan förekomma i dessa fall med perforering av slemhinnan. Trots förlusten av tumörceller från intramural rymden kan leda till en minskad tumörvolymen under uppföljningen, vi har aldrig observerat någon intravesikal tumörupptag.
En annan potentiell complication är spill av tumörceller till peritonealhålan genom injektionskanalen. Vi observerade bara en intraperitoneal tumörcellspridning på 50 djur, och detta skedde i en av våra första försök. Vi tillskriver detta till injektion av en alltför stor tumörcellsuspensionsvolym. Detta stöds av det faktum att reducera volymen 50-40 pl gav ingen ytterligare intraperitoneal spill.
Denna minimalt invasiva ympning av murina orthotopic blåscancer xenograft representerar en innovativ modifiering av befintliga "intramural modell", gynnar både utredaren och djuren lika. Fördelarna med denna modell uppmuntra dess anpassning till andra organ såsom njure, prostata och lever för att fastställa orthotopic xenograft tumörer i ett minimalt invasivt sätt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för Eliana Beraldi för att utföra viral transduktion av tumörcellinjer och Ben Deeley för hans undervisning om användning av det lilla djuret ultraljud plattform.
Projektet fick stöd av den tyska stiftelsen System (DFG, JA 2117/1-1: 1), den kanadensiska Cancerfonden Research Institute och en mentor Physician Scientist Award från Vancouver Coastal Health Research Institute. Det ultraljud plattform finansierades av det kanadensiska institutet för innovation.
Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
IVIS Lumina III | Caliper Life Science |