Neisseria meningitidis är en mänsklig specifik patogen som infekterar blodkärlen. I detta protokoll mänskliga mikrokärl införes i en mus genom ympning av mänsklig hud på immunförsvagade möss. Bakterier fäster stor utsträckning för att de mänskliga kärl, som leder till kärlskador och utveckling av den purpuric utslag oftast observerats i mänskliga fall.
Neisseria meningitidis orsakar en allvarlig, ofta dödlig sepsis när den kommer in i människans blodomlopp. Infektion leder till omfattande skador i blodkärlen som leder till kärl läcka, utveckling av purpuric utslag och eventuell vävnadsnekros. Att studera patogenesen för denna infektion har tidigare begränsats av det mänskliga specificiteten hos bakterierna, vilket gör in vivo-modeller svår. I detta protokoll, beskriver vi en humaniserad modell för denna infektion där mänsklig hud, innehåller dermala mikrokärl, ympas med nedsatt immunförsvar möss. Dessa fartyg anastomos med musen cirkulationen samtidigt som deras mänskliga egenskaper. När införs i denna modell, N. meningitidis vidhäftar enbart till de humana kärlen, vilket resulterar i omfattande kärlskador, inflammation och i vissa fall utveckling av purpuric utslag. Detta protokoll beskriver ympning, infektion och utvärderingssteg av denna modell i context av N. meningitidis-infektion. Tekniken kan tillämpas på många mänskliga specifika patogener som infekterar blodet.
Meningokock sepsis är en ofta dödlig blod född infektion som orsakas av bakteriell patogen Neisseria meningitidis. Meningokock sepsis patienter ofta uppvisar en petekier eller purpuric utslag på huden som tidigare har associerats med kärl förstörelse orsakad av cirkulerande bakterier och bakterieprodukter 1. Hud biopsier från kliniska patienter visar bakterier som följer med mikrokärl, ofta fyller kärlen 2. Bortsett från bakterier, omfattande trombos, koagulering, trängsel och vaskulär läcka ses i purpuric områdena 3-5. Denna kärlskada kan leda till omfattande nekros av huden och omgivande vävnader, vilket resulterar i debridering och även amputation i meningokock överlevande. Att förstå hur infektion orsakar detta kärlskador är viktigt att optimera strategier för förebyggande och behandling. Den största delen av forskning på meningococcal sepsis har utförts in vitro påhumana cellinjer på grund av den mänskliga specificiteten för N. meningitidis. Många aspekter av infektion har studerats in vitro inklusive bakteriell vidhäftning, värdcellrespons samt cytokinrespons 6-9. Typ IV pili (TFP) har varit inblandade i den stora vidhäftningsorganell för N. meningitidis på båda epitelceller och endotelceller 10. Det har också visat sig att vidhäftningen av N. meningitidis till värdceller är skjuvspänningen beroende och därför tros vara relaterad till blodflöden i mikrocirkulation 11. Detta tyder på de dynamiska spänningarna bakterierna möter in vivo är avgörande för patogenes. Det är dock mycket svårt att modellera mikromiljön av små kärl in vitro.
Vidhäftningen receptorn för Neisseria TFP är fortfarande okänd och därför inte kan förutses knock-in strategier för att uppnå bakteriell vidhäftning i en djurmodell för tillfället. CD46 har föreslagits vara den TFP-receptorn och transgena djur producerades för att fungera som musmodeller. Däremot infektion hos dessa djur inte leda till omfattande infektion eller hudutslag utveckling 12,13. Andra djurmodeller som har beskrivits för bakteriemi aspekt av Neisseria infektion beakta bakteriell preferens för humant transferrin som en järnkälla 14,15. Antingen komplettering humant transferrin eller uttrycker det från en transgen som resulterar i en ökad bakteriehalten i blodet under en längre tidsperiod, men denna modell uppvisar ingen bakteriell adhesion eller utslag utveckling 16,17.
I detta protokoll, beskriver vi en humaniserad musmodell där människohud, däribland den dermala mikrocirkulation, transplanteras till nedsatt immunförsvar möss 18,19. Detta resulterar i funktionella mänskliga kärl, perfunderade med musen cirkulationen. Kombinerat med humant transferrin tillskott, denna mOdel står för minst två av de humana specifika aspekter av N. meningitidis, dvs humant endotel och humant transferrin, i en in vivo miljö. N. meningitidis införs intravenöst i denna modell hålla sig specifikt till den mänskliga endotel, som producerar en patologi som liknar det som rapporterats i kliniska patienter, inklusive kärlskador och purpuric utslag utveckling 18.
Djurmodeller är oerhört viktigt att bakteriell patogenes forskning. Det är omöjligt att helt efterlikna miljön in vivo i cellkultur och det blir uppenbart att värdpatogen växelverkan påverkas av många dynamiska faktorer. Den mänskliga specificitet några kliniskt viktiga patogener, såsom N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes och Salmonella typhi har begränsat användningen av in vivo-modeller för dessa infektioner. Men som vi börjar förstå vilka smittsamma steg är involverade i specificitet, humaniserade modeller är under utveckling. Protokollet som beskrivs här är en demonstration av detta med införandet av mänskliga mikrokärl i möss, vilket möjliggör omfattande in vivo-infektion med N. meningitidis, vilket leder till kärlskador och ibland utvecklingen av purpuric utslag.
Med användning av denna modell,Vi har kunnat fastställa att de vidhäftande egenskaperna hos TFP är inblandade i vaskulär kolonisering in vivo med hjälp av bakteriella mutanter och att kärlskador reduceras i frånvaro av vidhäftningen 18. Tidigare har cirkulerande bakterieprodukter varit inblandad i denna skada, men våra resultat tyder på en avgörande roll för lokal vidhäftning och kärl kolonisering. Detta öppnar nya möjligheter för utveckling av mål ny behandling. Om vidhäftningen av patogena bakterier skulle kunna blockeras farmaceut det skulle kunna förhindra utvecklingen av hudskador och leda till bättre resultat för meningokock överlevande i termer av vävnadsnekros, debridering och amputationer. Arbetet har också visat komplexiteten av infektionen och medverkan av immunförsvaret och koagulationskaskaden. Vi identifierade mänskliga cytokin signalering i serum hos infekterade möss, trots den relativt lilla mängden mänsklig endotel nuvarande 18.Detta indikerade en signifikant cytokin-respons, tillsammans med infiltrationen av mus-immuna cellpopulationer in i området.
Djurmodeller kan naturligtvis aldrig helt replikera sjukdomar hos människan och alla resultat samlat från dem måste beaktas med detta i åtanke. Till exempel i denna modell blodet och cirkulerande celler är från mus och vi kan inte bortse från att de kan bete sig olika på mänskliga celler. En fördel med denna emellertid, såsom visat i vårt föregående publicering 18, är förmågan att differentiera signalering som härrör från humant endotel från den hos de cirkulerande musceller. Den nedsatt immunförsvar bakgrund av de möss som användes i denna modell skulle också göra det möjligt att allogen överföring av humana immuncellpopulationer, lägga till ytterligare en "humanisering" aspekten. Den immunförsvagade bakgrund av mössen kan emellertid maskera en roll för NK, T-eller B-celler, som alla saknar eller defekta i denna modell. Den relativt schort tidsram (24 tim) som används i denna modell gäller främst den medfödda respons, men för långsiktiga infektioner och utveckling av immunitet andra alternativ kan behöva undersökas.
Huden är en viktig infektions plats för N. meningitidis men har en relativt liten mängd mänskliga kärl innebär också att extrapolera data till en systemisk infektion som involverar många organ är svårt. Även denna modell möjliggör studier av huden lesion utveckling, är viktiga steg för meningokockinfektion såsom epitel-och blod-hjärn korsning inte. Behövs för att ta itu med dessa aspekter av infektionsvidareutveckling av dessa humaniserade modeller. Trots att den här modellen erbjuder en stor potential för många mänskliga specifika patogener, särskilt de som riktar blodkärlen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla medlemmar i Dumenil labbet, särskilt Silke Silva för kritisk läsning av manuskriptet. Operationen avdelning på Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr David Maladry. Michael Hivelin och Dr Patrick Bruneval, patologi Institutionen vid HEGP. Djuret anläggningen på PARCC, som leds av Elizabeth Huc. Detta arbete stöddes av följande bidragsorgan: Marie Curie IEF stipendium nej. 273.223 (KM), ASPETS-Avenir Grant från INSERM, CODDIM utrustning bidrag (Ile de France Region), FRM (fondation pour la recherche médicale) utrustning bidrag, det IBEID Laboratory of excellence konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) bidrag " Buggar-i-flow ". Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
(Rompun 2%) | |||
Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
Lacrigel | |||
Tronothane | Lisa Pharma | ||
GC agar Base | Conda | 1106 | |
Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
OCT tissue tek | Sakura | 4583 |