Summary
Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.
Abstract
Neisseria meningitidis verursacht eine schwere, oft tödliche Sepsis, wenn es den menschlichen Blutkreislauf gelangt. Die Infektion führt zu umfangreichen Schäden der Blutgefäße, was zu Gefäß Leck, der Entwicklung von Purpura Hautausschläge und eventuelle Gewebe Nekrose. Untersuchung der Pathogenese dieser Infektion wurde zuvor durch das menschliche Spezifität der Bakterien, die in-vivo-Modellen erschwert beschränkt. In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Modell für diese Infektion in der die menschliche Haut, Hautmikrogefäße enthält, wird auf immungeschwächten Mäusen gepfropft. Diese Gefäße anastomosieren mit der Maus Zirkulation unter Wahrung ihrer menschlichen Eigenschaften. Einmal in diesem Modell, N. eingeführt meningitidis haften ausschließlich die menschlichen Gefäße, was zu umfangreichen Gefäßschäden, Entzündungen und in einigen Fällen die Entwicklung der Purpura. Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation, Infektion und Auswertungsschritte dieses Modells in der context von N. meningitidis-Infektion. Die Technik kann zu zahlreichen Menschen spezifische Krankheitserreger, die in den Blutstrom zu infizieren angewendet werden.
Introduction
Meningokokken-Sepsis ist eine häufig tödlich Blut geboren Infektion, die durch den bakteriellen Erreger Neisseria meningitidis verursacht. Meningokokken-Sepsis-Patienten oft mit Petechien oder Purpura auf ihrer Haut, die zuvor mit Gefäßzerstörung durch zirkulierende Bakterien und bakterielle Produkte 1 verursacht in Verbindung gebracht wurde Gegenwart. Hautbiopsien von Patienten zeigen klinische Bakterien mit Mikrogefäßen verbunden sind, oft füllt die Gefäße 2. Abgesehen von den Bakterien, ausgedehnten Thrombose, Gerinnung, Staus und Gefäß Leck in den Regionen Purpura 3-5 gesehen. Diese Gefäßschäden können zu ausgedehnten Nekrosen der Haut und der umgebenden Gewebe führen, was Debridement und sogar Amputation in Meningokokken-Überlebenden. Zu verstehen, wie diese Infektion verursacht Gefäßschäden ist wichtig, Prävention und Behandlungsstrategien zu optimieren. Der Großteil der Forschung auf Meningokokken-Sepsis wurde in vitro durchgeführt ammenschlichen Zelllinien aufgrund der Spezifität des menschlichen N. meningitidis. Viele Aspekte der Infektion wurden in vitro einschließlich bakterieller Adhäsion, Wirtszellantwort sowie Cytokinantwort 6-9 untersucht. Typ-IV-Pili (TFP) haben als Haupt Haftung für Organelle N. in Verbindung gebracht meningitidis sowohl Epithel-und Endothel-Zellen 10. Es wurde auch gefunden, daß die Haftung von N. gezeigten meningitidis an Wirtszellen ist Schubspannung abhängig und wird daher angenommen, um den Blutfluss Raten in der Mikrogefäß 11 bezogen werden. Dies legt nahe, die dynamischen Belastungen die Bakterien stellen in vivo sind entscheidend für die Pathogenese. Es ist jedoch sehr schwierig, die Mikroumgebung der kleinen Gefäße in vitro-Modell.
Die Haftung Rezeptor für Neisseria TFP noch unbekannt und somit Knock-in Strategien zur bakteriellen Adhäsion in einem Tiermodell zu erzielen kann zu diesem Zeitpunkt nicht in Betracht gezogen werden. CD46 wurde vorgeschlagen, sein TFP-Rezeptor und transgenen Tieren produziert wurden als Maus-Modelle handeln. Allerdings bedeutet Infektion bei diesen Tieren nicht um umfangreiche Infektionen führen oder die Entwicklung 12,13 Ausschlag. Andere Tiermodelle, die für die Bakteriämie Aspekt der Neisseria-Infektion beschrieben wurden, berücksichtigen die bakterielle Vorliebe für menschliches Transferrin als Eisenquelle 14,15. Entweder Ergänzung menschliches Transferrin oder von einem Transgen zu einer erhöhten Bakterienlast im Blut über einen längeren Zeitraum zum Ausdruck, aber dieses Modell zeigt keine bakterielle Adhäsion oder Hautausschlag Entwicklung 16,17.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Mausmodell, in dem die menschliche Haut, einschließlich der dermalen Mikrogefäß, auf immungeschwächten Mäusen 18,19 transplantiert. Dies führt zu Funktions menschlichen Gefäße, mit der Maus Zirkulation durchblutet. In Kombination mit humanem Transferrin Ergänzung, diese modell letzteres mindestens zwei der menschlichen spezifische Aspekte N. meningitidis, dh menschlichen Endothel-und Humantransferrin, in einer in vivo Umgebung. N. meningitidis eingeführt intravenös in diesem Modell haften spezifisch für das menschliche Endothel Herstellung einer Pathologie, die ähnlich zu dem, was in der klinischen Patienten, einschließlich Gefäßschäden und Purpura Entwicklungs 18 angegeben ist.
Protocol
1. Risiken und Berechtigungen
- Lokale Ethik-Kommissionen müssen alle Tier Protokolle genehmigen. Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien von den Französisch und europäischen Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 und 2001-131 und etablierte durchgeführt EU-Richtlinie 2010/63/UE) und von der lokalen Ethikkommission Comité d'en matière d'Ethique Expérimentation Animale, Universite Paris Descartes, Paris, Frankreich zugelassen. No: CEEA34.GD.002.11.
- Für die menschliche Haut, geschrieben wurde, informierte Patient Zustimmung erhalten und alle Verfahren wurden durchgeführt, nach Französisch nationalen Richtlinien und durch die lokale Ethikkommission, Comité d'Bewertung Ethique de l'INSERM IRB 00003888 00005881 FWA, Paris, Frankreich Stellungnahme zugelassen: 11-048 .
- N. meningitidis ist ein potenziell schädlichen menschlichen Krankheitserreger und alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung der orga genommen werdennismus. Zu diesen Vorsichtsmaßnahmen gehören die Impfung und Arbeiten unter Biosafety Level 2 Bedingungen.
2. Skin Graft
- Sammeln der menschlichen Haut so nah wie möglich Pfropfen. Die Mehrheit der Haut in dieser Arbeit kommt von Schönheitsoperationen, die die Bauchbereich. Andere Quellen, wie Brust-, Bein-und sogar Fläche mit Erfolg verwendet worden.
- Bereiten Sie die Probe menschlichen Haut durch die Reinigung der Hautoberfläche mit 70% EtOH und es flach liegend auf einem gut gereinigten Oberfläche, vorzugsweise unter einem Fluss Kapuze.
- Schneiden 200-400 um Scheiben von der Spitze der Haut mit einem Dermatom mit vorgegebenen Dicke.
- Überprüfen Sie die Haut Scheiben für Integrität und schneiden sie in 2 cm x 2 cm große Quadrate, dann in PBS (ohne zweiwertigen Kationen), wenn sie sofort oder bei 4 ° C in DMEM Pfropfen mit 10% Serum für die kurzfristige Lagerung (3-12 h ).
- Betäuben 6-8 Wochen alten SCID.bg Mäuse (etwa 20 g) mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injeCTED ip
- Sobald die Mäuse narkotisiert werden, überprüfen Sie die Schmerzreaktion durch Ausführen einer Zehe Prise, ein Standardverfahren zur Gründung Schmerzreflex. Gel auf die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern Hornhaut und rasieren die linke Seite des Tieres hinter der Schulter, wo das Implantat platziert wird. Halten Sie die Maus warm an einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens.
- Nach prepping Maus für Chirurgie, reinigen Sie die rasierte Fläche mit 70% EtOH.
- Anwenden lokaler Betäubung topisch auf die Transplantationsstelle (Tronothane) und bereiten die Transplantationsstelle durch vorsichtiges Entfernen der Oberflächenschicht der Haut von Mäusen mit einem Paar von gebogenen Schere. Achten Sie darauf, um die zugrunde liegende Gefäßsystem zu stören.
- Haut in einem Bereich ein wenig kleiner als der Bereich der menschlichen Haut Scheibe zu entfernen.
- Haut entfernen Scheibe von PBS (oder DMEM) und legen über Transplantatbett, Sicherstellung der epidermalen Seite nach oben zeigt. 2,8-2,10 Schritte sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, wodurch das Transplantat Bett nicht austrocknet.
- Richten Sie eine Eckeoder Kante und fix mit Gewebekleber. Den Rest der Haut vorsichtig Scheibe passen, um das Transplantat Bett, indem kleine Mengen von Gewebekleber an den Rändern. Immer trimmen die menschliche Haut zu Größe eher als machen das Transplantat Bett größer.
- Die Haut Ziehen Sie nicht zu fest auf das Transplantatbett, wie die Maus Haut ist sehr flexibel.
- Stellen Sie sicher, dass das Transplantat wird mit Gewebekleber in jeder Ecke befestigt.
- Reinigen Sie den Bereich mit einer Jod-Lösung.
- Tragen Sie eine Band-Aid mit dem Polsterbereich über dem Transplantat. Stellen Sie sicher, dass die Band-Aid ist fest, aber nicht zu eng, und dass das Tier die Atmung nicht beeinträchtigt wird.
- Befestigen Sie das Band-Aid mit Dressing Band.
- Lassen Sie das Tier auf einer warmen Oberfläche zu erholen.
- Einmal wach, bringen Sie das Tier in seinen Käfig. Tiere untergebracht sind 2-3 pro Käfig.
- Überprüfen Sie regelmäßig Mäuse während der Wiederherstellung auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden. 10-14 Tage nach der Transplantation, entfernen Sie das Band-Aid, darauf achten, daß das Transplantat zu stören. Nach unserer Erfahrung ist die postoperative Schmerz minimal. Dennoch Tiere sollten jeden Tag vor allem in den Tagen nach der Operation überwacht werden. Kriterien für die Schmerzen oder Leiden sind die folgenden.
- Gewichtsverlust über 10%
- Erscheinungsbild, Pelz, Bucklige Position, die Augen
- Erhöhte Atmung oder Herzfrequenz
- Verminderte oder ungewöhnliche Bewegungen.
- Anstieg der Körpertemperatur
- Wurden Anzeichen von Schmerzen festgestellt werden paracetamole oral verabreicht (300 mg / kg, alle 4 h). Humane Endpunkte werden streng auf, wenn die Schmerzen länger haften.
- Wenn das Transplantat trocken aussieht Babyöl gelten alle 2-3 Tage, um die Haut geschmeidig zu halten.
- Das Transplantat ist bereit für Experimente 21 Tage nach Transplantats.
3. Infektion
- Der Tag vor der Infektion, bereiten Bakterienstamm durch Ausstreichen auf GCB-Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika. Wachsen über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Bakterienpräparat
- Inkubiere unter Schütteln für 2 h im Brutschrank (37 ° C in 5% CO 2) mit losem Deckel, bis eine Bakteriendichte von ungefähr 0,1 OD 600.
- Zentrifugieren Sie die Bakterien für 3 min 15.000 Umdrehungen pro Minute.
- Überstand entfernen und Resuspension in PBS, dann wieder zentrifugiert.
- Wiederholen Sie den Waschschritt (2.2.4-2.2.5) zweimal.
- Resuspendieren Bakterienpellet in PBS.
- Messen OD 600.
- Einen Kultur entweder OD 600 0,1 (10 8 CFU / ml) oder OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). Von diesem bekannten Konzentration verdünnen bis 10 7 CFU / ml. Versuchen Sie, Bakterien so nah an Einspritzzeit wie möglich vorzubereiten.
- Wiegen Mäusen.
- Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert ip
- Einmal eingeschlafen, cTeufel, dass die Schmerzreaktion ist von einem Zehen Prise fehlt, halten die Mäuse warm mit einem Heizkissen und legte Augensalbe auf, um das Trocknen zu verhindern.
- Geben Sie jedem Maus 8 mg Humantransferrin, in Kochsalzlösung oder PBS, ip injiziert
- Nehmen Sie einen kleinen Tropfen Blut aus dem Schwanz und verteilt auf einer Agar-Platte, um zu überprüfen Blut ist steril vor der Infektion.
- Injizieren von 100 &mgr; l 10 7 CFU / ml Bakterienkultur (10 6 CFU gesamt) intravenös über die retroorbitale oder Schwanzvene. Messungen der CFU genommen 5 Minuten nach der Injektion sind konsistent, unabhängig von der Injektionsstelle.
- Nach ein paar Minuten, schnipp das hintere Ende und breitete Blutprobe auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika mit einer 10-fachen Verdünnung, um den Blut CFU etablieren unmittelbar nach der Infektion.
- Verschließen Sie den Schwanz mit Gewebekleber.
- Nach der Injektion verdünnt das Bakterieninokulum und verteilt auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika zu CFU etablieren.
- Lassen Sie den Mäusenauf einem Heizkissen erholen, bis sie nach oben und bewegt sich
- Nach 6 Stunden nach der Infektion ziehen Sie eine kleine Menge Blut aus dem Schwanz, verdünnen und Platte CFU bei 6 h zu etablieren.
- Alle Agar-Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht.
4. Sacrifice
- Bei dem gewählten Zeitpunkt der Infektion, Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert ip
- Einmal eingeschlafen, halten Sie die Maus warm mit einem Heizkissen.
- Wenn der Schmerz-Reflex hat (toe-Pinch) gegangen, schnipp Ende des Schwanzes und ziehen Blut.
- Verbreiten Sie Blut auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika; 5 ul direkte und 10 ul 1:10 Verdünnung zu CFU etablieren.
- Sacrifice der Maus durch Genickbruch.
- Nachdem dabei die Maus nach allen relevanten institutionellen und ethischen Richtlinien, bestätigen Tod durch Mangel an Herzschlag. Machen Sie eine Mittellinienschnitt, durch Brustkorb geschnitten und einen Einschnitt in der mündlichent.
- Sammeln Sie so viel Blut wie möglich aus dem Herz / Brustraum und in einem sterilen Röhrchen.
- Organen (z. B. Leber, Milz, Gehirn) zu entfernen, in einen sterilen Platte.
- Entfernen Sie die Hauttransplantation und einen Teil der Haut von Mäusen in den sterilen Teller.
- Entsorgen Sie die Maus Körper.
- Nachdem das gesammelte Blut wurde für 15 min gerinnen, es Zentrifuge 15 min bei 3.000 Umdrehungen pro Minute.
- Entfernen von Plasma aus Blut und bei -80 ° C für spätere Analysen, zB zur Erkennung von Zytokin-ELISA oder FACS-basierten Methoden.
5. Orgel CFU Grafen
- Wiegen Homogenisieren Röhrchen mit 500 ul PBS jeweils vor der Einnahme von Biopsie-Proben.
- Nehmen Sie 4 mm Biopsieproben aus jedem Gewebe mit einer sterilen Biopsie Punch.
- Platz in Biopsien vorgewogen Homogenisieren Röhrchen mit 500 ul PBS. Homogenisieren Hautproben mit 2-mm-Perlen, verwenden kleinere Perlen für andere Organe.
- Legen Sie die restlichen tFragen in 4% Paraformaldehyd (PFA) und bei 4 ° C für die Mikroskopie (siehe unten).
- Wiegen Homogenisieren Röhrchen mit den Biopsien Biopsie Gewichtes (für die spätere Berechnung der KBE / mg Gewebe).
- Proben homogenisieren.
- Homogenisieren Leber, Milz und Gehirn, bei 6.000 rpm für 30 sek.
- Homogenisieren Hautproben bei 6.000 rpm für 30 sec und bei Bedarf wiederholen.
- Verbreiten Verdünnungen von jedem Homogenisieren Rohr auf Agarplatten und über Nacht wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 bis Organ Keimzahlen herzustellen.
6. Histologie / Immunhistochemie
- Fixierung
- Fix die Gewebe in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C Die Fixierung Schritt kann mehr sein, wenn die Speicherung über längere Zeiträume legen die Gewebe in 0,25% PFA.
- Spülen Sie die Gewebe in PBS und dann in 20% Saccharose-Lösung legen und zurück auf 4 ° C über Nacht oder bis der Gewebe in der Lösung versenkt.
- In PBS waschen Gewebe, auf Größe geschnitten und in Oktober-Lösung (entweder in Form eines Gewebes oder einer Grundplatte geklebt).
- Frieren schnell die Gewebe auf einer Petrischale schwimmend in flüssigem Stickstoff.
- Nach dem Einfrieren setzen die Gewebe auf Trockeneis vor der Übertragung auf -80 ° C für die Lagerung.
- Slicing
- Gewebe entfernen von -80 ° C übergeführt und bei -20 ° C in einem Kryostaten äquilibrieren.
- Scheibengewebe mit einer Dicke von etwa 10-15 um und setzen auf beschichtete Objektträger-Mikroskopie.
- Speicher gleitet bei -20 ° C, bis sie benötigt.
- Die Färbung
- Lassen Sie Folien auf Raumtemperatur kommen.
- Zeichnen Sie rund um die Scheibe auf der Folie mit einem hydrophoben Stift. Warten Sie 5-10 min.
- Rehydrate / Wasch Scheibe in PBS für 5 min, zweimal wiederholen.
- Permeabilisieren Scheibe in 0,1% Triton in PBS für 10 min.
- In PBS 2-3x Waschen für 5 min.
- Blockieren in PBS0,1% Triton 1% BSA für zwischen 10-60 Minuten, je nach den Antikörper oder Flecken verwendet werden.
- Entfernen Blockierungspuffer und fügen primäre Antikörper verdünnt in Blockpuffer erforderlich. Inkubieren bestimmte Zeit. (Oft 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C).
- In PBS 2-3x Waschen für 5 min.
- Bewerben sekundären Antikörper gegebenenfalls in bock Puffer verdünnt; DAPI wird typischerweise in diesem Schritt enthalten. Inkubieren bestimmten Zeit, oft 1-2 Stunden Raumtemperatur in der Dunkelheit.
- In PBS 2-3x Waschen für 5 min.
- Berg in Fade Schutz Montage Medien mit einem Deckglas und Dichtung mit Nagellack.
- Bild gefärbten Objektträger sofort oder bei 4 ° C
- Führen Bildgebung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskopie oder mit Filter / angemessen Fluorophore verwendeten Laser eingestellt.
- Histologie
- Die Objektträger verwendet für die Histologie auf Raumtemperatur kommen.
- Stain Folien mit sotandard Hämatoxylin / Eosin-Färbung Protokoll.
- Legen Sie die Folien in der Folienträger.
- Bringen Sie mit den Objektträgern zwischen den Lösungen in der folgenden Reihenfolge:
- 2 Sek. in fließendem Leitungswasser.
- 3 min in Hämatoxylinlösung gefiltert.
- 10 Sek. in fließendem Wasser.
- 10 Sek. in destilliertes Wasser.
- 10 sec in 100% Ethanol.
- 2 sec in Eosin gefiltert.
- 10 Sek. in fließendem Wasser.
- 10 sec in Ethanol 100%
- 2 min in Xylol x 3 (Bad I, II, III).
- Übertragen Sie sofort und fügen einige Tropfen Leim Fixierung auf jedes Rutschen, Platz Deckglas auf, entfernen Sie Luftblasen, trocknen lassen für ein paar Stunden.
- Bild gleitet unter einem Standard-Weißlicht-Mikroskop.
Representative Results
Keimzahlen
Der N. meningitidis-Stamm in dieser repräsentativen Ergebnisse verwendet, ist N. meningitidis 8013 Klon 12, eine Serogruppe C klinischen Isolat, Ausdruck einer Klasse-I-SB pilin, Opa -, OPC -, PilC1 + / + 20 PilC2. Der Stamm war so konstruiert, dass das grün fluoreszierende Protein (GFP) von einer chromosomalen Insertion 18 auszudrücken. Bakterienkolonie-Bildungseinheit Zählwerte durch Zählung der Anzahl der Kolonien auf den Agarplatten und Berechnen entweder CFU / ml Blut oder CFU / mg Gewebe aus den bekannten Volumina plattiert etabliert. Blutbild zeigte, dass 5 Minuten nach iv Injektion von 10 6 CFU Bakterien war ein Durchschnitt von 1,5 × 10 5 CFU / ml im Blut zirkuliert (Fig. 1A). Nach 6 Stunden die Zählungen im Durchschnitt 4,8 x 10 4 KBE / ml. Nach 24 Stunden waren die durchschnittlichen zählt 2,4 x 10 4 KBE / ml, aber in dieser Gruppe von 10 Mäusen, 5 hattekeine nachweisbaren zirkulierenden Bakterien, während die anderen 5 relativ hohe Zählungen (Fig. 1A). Keimzahlen von den Hautproben genommen zeigen die Mehrzahl der Mäuse mit erheblichen Zählungen in der menschlichen Haut, durchschnittlich 2,1 x 10 4 KbE / mg Gewebe in 6 h und 4,4 × 10 2 KBE / mg Gewebe in 24 h (Fig. 1B) . Die kontralateralen Maus Hautproben zeigten keine Bakterienzahl bei 24 Stunden und nur einer sehr geringen Anzahl an 6 Stunden, was die starke Präferenz für N. meningitidis zu den menschlichen Gefäße in der transplantierten Haut (Abbildung 1B). Im Allgemeinen waren die Bakterienzahl in den anderen Organen abgetastet, obwohl 2 Tiere zeigen Zählungen, die eine Kontamination durch das Blut zugeschrieben werden können, wie sie mit hoher Umlaufbakterienzahlen (Abbildung 1C) korreliert tat sehr niedrig nicht nachweisbar. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Rolle von Virulenzfaktoren in vivo zu bestimmen, beispielsweise der Typ IV pili. Bakterienstämme mit definierten Mutationen im Gen PILD 21, was zu einem Stamm fehlt TFP sowie die pilC1-Gen 8, ohne die vorgeschlagene Tfp "Adhäsin" wurden in das Modell eingeführt. Diese Mutationen ergaben keine bakterielle Adhäsion im menschlichen Hauttransplantat und bestätigt die entscheidende Rolle spielen TFP Adhäsion in vivo (Fig. 1D).
Immunhistochemie / Histologie
In diesen Experimenten verwendeten wir N. meningitidis-Stämme, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, um Fluoreszenzdetektion ohne sekundäre Färbung zu ermöglichen. Menschliche Gefäße wurden mit einem Marker für menschliche Endothel gefärbt, entweder CD31 (PECAM-1) oder das Lectin Ulex Europaeus Agglutinin (UEA) 18,22. Der UEA wurde Rhodamin konjugiert wodurch ein Färbungsschritt (Fig. 2A-C). Zellkerne können zu färbened mit DAPI zur Identifizierung Gewebestrukturen (Fig. 2A-B). Histologie wurde unter Verwendung eines Standard-Hämatoxylin / Eosin-Färbung. Die epidermalen / dermalen Grenze der Haut war deutlich erkennbar. Entzündungen, Thrombose und Gefäßleck wurden auf Schiffe in der Nähe dieser Grenze 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2D) konzentriert. Thrombose war in mehreren kleinen Hautgefäße, die oft von Staus und Entzündungen einher sichtbar. Austritt von roten Blutkörperchen aus in das Gewebe sehen konnte, was auf eine weit reichende Gefäßschäden. Die Histopathologie der transplantierten Haut in nicht-infizierten Mäusen normal erschien ohne Entzündung zu unterscheiden 18. In etwa 30% der Infektionen bakteriellen Adhäsion in der Haut führt zur Entwicklung von makroskopisch nachweisbare Purpura (Fig. 2E und 2F).
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Fig. 1 ist. CFU zählt. (A) Bakterienkeimzahlen pro ml Blut in 5 min, 6 h und 24 h nach Infektion. (B) Bakterielle CFU zählt von Hautproben Vergleich der menschlichen Haut (HS) und Maus-Haut (MS) sowohl bei 6 Stunden und 24 Stunden nach der Infektion. (C) Bakterienkeimzahl von anderen Organen aufgenommen 24 Stunden nach der Infektion. (D) Vergleich der Bakterienkeimzahlen aus Mensch und Maus Hautproben bei 24 Stunden nach der Infektion von Mäusen, die mit dem Wildtyp infizierten N. genommen meningitidis 2C43 Fleck (WT), einen Stamm mit einer Mutation in dem Gen PILD (PILD) oder einem Stamm mit einer Mutation in der pilC1-Gens (pilC1). Alle Diagramme werden als Rohdaten mit Median gezeigt. Abbildung von 18 Melican et al. Modifiziert"_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Mikroskopie. (A) Projektion eines konfokalen Stapel, die einen menschlichen Mikrogefäß mit Lektin UEA (rot) in der Nähe der Haut (d) der Epidermis (e) Grenze gefärbt. Der Behälter wird mit infizierten N. meningitidis (grün) 2 h nach der Infektion. (B) Eine optische Scheibe und eine Scheibe Projektion (C) zeigt N. meningitidis Mikrokolonien (grün)-Infektion eine menschliche Gefäß (UEA - rot) in einer Hauttransplantation 2 Stunden nach der Infektion. (D) Hämatoxylin / Eosin-Färbung von menschlichen Hauttransplantation für 24 Stunden mit N. infiziert meningitidis. Der epidermale (e), ist dermalen (d) Grenze deutlich sichtbar und ausgedehnten Thrombose und Staus von microvessels (Pfeile) in der Dermis zu sehen. Entzündung und einige Vascular Leak (Pfeilspitze) kann auch identifiziert werden. (E) Die menschliche Haut Transplantat vor der Infektion. (F) Das gleiche Hauttransplantation als (E) 24 h nach Infektion mit N. meningitidis, die Purpura Regionen (Pfeile). 2B, 2D, 2E, 2F und werden von Melican et al. modifizierten 18 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Discussion
Tiermodelle sind für bakterielle Pathogenese Forschung von entscheidender Bedeutung. Es ist unmöglich, vollständig zu imitieren die in vivo-Umgebung, in der Zellkultur und es zeichnet sich ab, daß Wirt-Pathogen-Wechselwirkung wird durch viele dynamische Faktoren beeinflusst. Der menschliche Anwendbarkeit einiger klinisch wichtige Pathogene, wie N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes und Salmonella typhi ist die Verwendung von in-vivo-Modelle für diese Infektionen beschränkt. Allerdings, wie wir beginnen zu verstehen, welche Infektionsschritte werden in der Spezifität beteiligt, humanisierte Modelle entwickelt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beweis dafür mit der Einführung des menschlichen Mikrogefäßen in Mäuse, was eine umfangreiche in vivo-Infektion mit N. meningitidis, was zu Gefäßschäden und gelegentlich die Entwicklung der Purpura Hautausschläge.
Mit diesem ModellWir waren in der Lage zu bestimmen, dass die Klebeeigenschaften der TFP in Gefäßbesiedlung in vivo unter Verwendung von bakteriellen Mutanten und dass die Gefäßschäden in Abwesenheit der Adhäsion beteiligt 18 reduziert. Bisher haben die zirkulierende bakterielle Produkte in diesem Schaden in Verbindung gebracht, aber unsere Ergebnisse legen nahe, eine entscheidende Rolle für die lokale Adhäsion und Gefäß Kolonisation. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Behandlungsziele. Wenn Adhäsion von pathogenen Bakterien könnten pharmazeutisch blockiert werden es möglicherweise verhindern, könnte die Entwicklung von Hautläsionen und führen zu besseren Ergebnissen für die Meningokokken-Überlebenden in Bezug auf Gewebe Nekrose, Debridement und Amputationen. Die Arbeit hat auch die Komplexität der Infektion und die Beteiligung der Immunantwort und Gerinnungskaskade. Wir identifizierten humanen Zytokin-Signalisierung im Serum infizierter Mäuse trotz der relativ geringen Menge an menschlicher Endothel 18 vorhanden.Dies zeigte eine signifikante Reaktion Cytokin, zusammen mit der Infiltration von Mausimmunzellpopulationen in der Umgebung.
Tiermodelle können natürlich nie vollständig menschlichen Krankheit zu replizieren und alle Ergebnisse erhielt von ihnen müssen in diesem Sinne angesehen werden. Zum Beispiel in diesem Modell das Blut und die zirkulierenden Zellen von Maus Herkunft, und wir können nicht ausschließen, dass sie unterschiedlich auf den menschlichen Zellen zu verhalten. Ein Vorteil davon jedoch, wie in unserer jüngsten Veröffentlichung 18 gezeigt, ist die Fähigkeit, Signal die aus menschlichen Endothel aus, dass der umlaufMausZellen zu differenzieren. Die immun Hintergrund der in diesem Modell verwendeten Mäuse würde auch für die allogene Übertragung von menschlichen Immunzellpopulationen zu ermöglichen, um eine weitere 'Humanisierung' Aspekt. Die immun Hintergrund der Mäuse können jedoch Maske eine Rolle für die NK-, T-oder B-Zellen, die alle fehlen in diesem Modell oder defekt. Die relativ Short Zeitrahmen (24 h) in diesem Modell verwendet, betrifft vor allem die angeborene Reaktion, aber für längerfristige Infektionen und die Entwicklung der Immunität andere Optionen benötigen, erkundet zu werden.
Die Haut ist ein wichtiger Infektionsstelle für N. meningitidis, aber mit einer relativ kleinen Menge an menschlichem Gefäße bedeutet auch, dass eine Extrapolation der Daten zu einer systemischen Infektion, die zahlreiche Organe ist schwierig. Während dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Haut Läsion Entwicklung, sind wichtige Schritte von Meningokokken-Infektion, wie Epithel-und Blut-Hirn-Überfahrt nicht inbegriffen. Die Weiterentwicklung dieser humanisierten Modellen benötigt wird, um diese anderen Aspekte der Infektion zu adressieren. Dennoch ist dieses Modell bietet ein großes Potenzial für zahlreiche Menschen spezifischen Krankheitserregern, insbesondere solcher, die auf die Blutgefäße.
Disclosures
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich alle Mitglieder der Dumenil Labor, insbesondere Silke Silva für das kritische Lesen des Manuskripts danken. Die chirurgische Abteilung im Hôpital Européen Georges Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin und Dr. Patrick Bruneval, Pathologie-Abteilung an HEGP. Die Tierhaltung in PARCC von Elizabeth Huc geleitet. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschuss Agenturen unterstützt: Marie-Curie-Stipendium IEF-Nr. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant von INSERM, CODDIM Ausrüstung Zuschuss (Region Ile de France), FRM (Fondation pour la recherche médicale) Ausrüstung gewähren, die IBEID Laboratory der Exzellenz-Konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) grant " Bugs-in-flow ". Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
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