Summary
나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.
Abstract
그것은 인간의 혈액 스트림을 입력 할 때 나이 세리아 수막염은 심각한, 자주 치명적인 패혈증의 원인이됩니다. 감염이 혈관 누수, 부르르 발진 최종 조직 괴사의 발전의 결과로 혈관의 광범위한 손상에 이르게한다. 이 감염의 발병 기전을 연구하는 것은 이전에 생체 내 모델에서 어렵게 박테리아의 인간의 특이성에 의해 제한되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 인간의 피부, 피부의 미세 혈관을 포함하는이, 면역 쥐에 이식되는이 감염에 대한 인간화 모델을 설명합니다. 그 인간의 특성을 유지하면서 이러한 혈관 마우스 순환 anastomose. 일단이 모델 N.에 도입 수막염은 광범위한 혈관 손상, 염증과 부르르 발진의 경우에 개발의 결과로, 인간의 혈관에 독점적 준수합니다. 이 프로토콜은 콩트에서이 모델의 접목, 감염 및 평가 단계에 대해 설명합니다N.의 XT 수막염 감염. 기술은 혈류 감염 수많은 인간의 특정 병원균에 적용될 수있다.
Introduction
수막 구균 패혈증은 세균 병원체 나이 세리아 수막염 기인 자주 심각한 혈액 태어난 감염이다. 수막 구균 패혈증 환자들은 이전에 순환 세균과 박테리아 제품 1에 의한 혈관 파괴와 관련되어 자신의 피부에 점상 또는 부르르 발진이 존재. 임상 환자의 피부 생검은 종종 선박 2를 작성, 미세 혈관과 관련된 박테리아를 보여줍니다. 떨어져 박테리아, 광범위한 혈전증, 혈액 응고, 혼잡과 혈관 누출로부터는 부르르 지역 3-5에서 볼 수있다. 이 혈관 손상은 수막 구균 생존자 변연 절제술, 심지어 절단의 결과로, 피부와 주위 조직의 광범위한 괴사로 이어질 수 있습니다. 감염이 혈관 손상을 일으키는 방법을 이해하면 예방 및 치료 전략을 최적화하는 것이 중요합니다. 수막 구균 패혈증에 대한 연구의 대부분은 체외에서 수행되었다N. 인간의 특이성에 의한 인간 세포주 수막염. 감염의 여러 측면 세균의 부착, 숙주 세포 반응뿐만 아니라 사이토 카인 반응 6-9 포함한 체외에서 연구되어왔다. 유형 IV의 필리 (TFP)은 N.의 주요 접착 세포 기관으로 연루되어있다 수막염은 상피 및 내피 세포 (10)에 모두. 또한 N.의 접착력을 보였다 세포를 호스트 수막염은 전단 응력에 따라 달라지며, 따라서 미세 혈관 (11) 내의 혈액 흐름 속도에 관련된 것으로 생각된다. 이 박테리아가 생체 내에서 직면하는 역동적 인 스트레스가 발병에 매우 중요합니다 제안합니다. 이는 시험관 내에서의 작은 혈관의 미세 환경을 모델링하지만 매우 어렵다.
나이 세리아 TFP 대한 밀착성 수용체는 아직 알 수 있고, 따라서 동물 모델에서 세균의 부착을 달성하기 위해 노크의 전략은이 시점에서 예상 할 수없는. CD46는 총요소 생산성 수용체 유전자 변형 동물 모델 마우스의 역할을하도록 제작 된 것으로 제안했다. 그러나 이러한 동물에 감염 광범위한 감염으로 이어질하지 않거나 개발 (12, 13)를 발진 할 수 있습니다. 나이 세리아 감염 균혈증 측면에 대해 기술 된 다른 동물 모델의 계정에 철 소스 (14, 15) 인간 트랜스페린의 세균 환경을. 인간 트랜스페린을 보완 또는 연장 기간 동안 혈류의 증가 세균 부하 트랜스 결과로부터 발현하지만,이 모델은 세균의 부착이나 습진 개발 16,17 보여주지 않는다 어느.
이 프로토콜에서는, 우리는 피부의 미세 혈관을 포함하여 인간의 피부, 면역 마우스 (18, 19)에 이식 된 인간 답게 된 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이것은 마우스 순환 관류 기능적 인간 혈관 초래한다. 인간 트랜스페린의 보완과 결합,이 MODEL N.은 인간의 특정 측면의 적어도 두 개의 차지 수막염은 생체 내 환경에서, 인간의 내피 세포와 인간 트랜스페린 즉. N. 수막염은 혈관 손상과 부르르 발진 개발 (18)을 포함하여 임상 환자에서보고되는 것과 유사한 병리를 생산, 인간의 내피 세포에 특이 적으로 부착이 모델에 정맥 소개했다.
Protocol
1. 위험 및 권한
- 지역 윤리위원회는 모든 동물 프로토콜을 승인해야합니다.이 프로토콜은 프랑스와 유럽 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 규정 (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486과 2001-131에 의해 설립 된 지침에 따라 실시되었다 유럽 지침 2010/63/UE)과 지역 윤리위원회의 프랑스위원회 (CCT) D' ETHIQUE EN MATIERE 디부 실험 ANIMALE, 대학교 파리 데카르트, 파리, 승인. 아니오 : CEEA34.GD.002.11 없습니다.
- 인간의 피부를 위해, 기록 정보를 환자의 동의를 얻었다 모든 절차가 수행 된 프랑스 국립 지침에 따라 로컬 윤리위원회,위원회 (CCT) D' 평가 ETHIQUE 드 난 INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, 파리, 프랑스의 의견에 의해 승인 : 11-048 .
- N.의 수막염은 잠재적으로 유해한 인간의 병원체이며, ORGA를 처리 할 때 필요한 모든 예방 조치를 수행해야합니다커니즘. 주의 사항은 예방 접종 및 바이오 안전성 수준이 조건에서 작업이 (가) 있습니다.
2. 피부 이식
- 가능한 한 시간을 접목에 가까운 인간의 피부를 수집합니다. 이 작품의 피부의 대부분은 복부 영역을 포함하는 성형 수술 작업에서 비롯됩니다. 유방, 다리, 심지어 얼굴과 같은 다른 소스의 성공과 함께 사용되었다.
- 70 % EtOH로 피부 표면을 청소하고, 바람직하게는 흐름 후드 아래, 잘 청소 표면에 평평하게 거짓말을하여 인간의 피부 샘플을 준비합니다.
- 프리셋 두께 dermatome을 사용 피부 위에서 200-400 μm의 슬라이스 조각.
- 단기 저장을위한 10 %의 혈청 (3-12 시간 즉시 또는 DMEM에서 4 ° C에 접목하면 무결성 피부 조각을 확인하고 2cm X 2cm 사각형으로 그들을 잘라, 다음 (가의 양이온없이) PBS에 배치 ).
- 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏) 인제 6-8 주 이전 SCID.bg 마우스 (약 20 g)을 마취시키다cted의 IP
- 쥐가 마취되면, 발가락 핀치, 고통의 반사를 설정하기위한 표준 방법을 수행하여 통증 반응을 확인합니다. 각막 건조를 방지하고 이식이 배치됩니다 어깨 뒤에 동물의 좌측 면도 눈에 젤을 적용합니다. 절차 전반에 걸쳐 열 패드에서 마우스를 따뜻하게 유지합니다.
- 수술을 위해 마우스를 준비하고 후, 70 % EtOH로 면도 영역을 청소합니다.
- 이식 사이트 (Tronothane)에 국소 국소 마취제를 적용하고 신중하게 곡선 가위와 마우스의 피부의 표면 층을 제거하여 이식 사이트를 준비하고 있습니다. 기본이되는 혈관을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 인간의 피부 조각의 면적보다 약간 작은 면적의 피부를 제거합니다.
- PBS (또는 DMEM)에서 피부 조각을 제거하고 이식 침대에 배치, 표피면이 위를 향 보장한다. 단계 2.8-2.10는 이식 침대가 건조하지 않는 보장, 가능한 한 빨리 수행되어야한다.
- 한 모서리를 맞 춥니 다또는 조직 접착제로 가장자리와 수정. 조심스럽게 가장자리 주위 조직 접착제의 작은 금액을 배치, 이식 침대에 피부 조각의 나머지 부분을 맞습니다. 항상 크기로 인간의 피부 손질보다는 이식 침대가 더 큰합니다.
- 마우스 피부가 매우 유연하기 때문에 이식 침대에 너무 꽉 피부를 잡아 당기지 마십시오.
- 이식 각 모서리에있는 조직 접착제로 고정되어 있는지 확인합니다.
- 요오드 용액으로 영역을 청소합니다.
- 이식에 쿠션 지역에 반창고를 적용합니다. 반창고는 회사 그러나 단단하고 동물의 호흡이 영향을받지되어 있는지 확인합니다.
- 드레싱 테이프 반창고를 수정.
- 동물이 따뜻한 표면에 복구 할 수 있습니다.
- 일단 깨어, 그 케이지에 동물을 반환합니다. 동물은 2 ~ 3 당 케이지를 보관되어 있습니다.
- 통증이나 고통의 징후를 복구하는 동안 정기적으로 쥐를 확인합니다. 10-14일 이식 후 이식을 방해하지 않도록주의하고, 반창고를 제거합니다. 우리의 경험에서 수술 후 통증은 미니입니다말. 그럼에도 불구하고 동물은 수술 후 몇 일에 특히 매일 모니터링해야합니다. 통증이나 고통에 대한 기준은 다음과 같다.
- 10 % 이상의 체중 감소
- 외모, 모피, 꼽추 위치, 눈
- 증가 된 호흡이나 심장 요금
- 감소 또는 비정상적인 움직임.
- 체온 상승
- 경우에 고통의 흔적이 발견 paracetamole은 (300 ㎎ / ㎏, 매 4 시간) 경구 투여한다. 동물 애호 엔드 포인트는 엄격하게 통증이 지속되는 경우에 부착되어 있습니다.
- 수술이 부드러운 피부를 유지하기 위해 2-3 일마다 베이비 오일을 적용 건조 보인다면.
- 이식은 실험 이십일일 포스트 이식을위한 준비가되어 있습니다.
3. 감염
- 감염 전날, 적절한 항생제 GCB의 한천 플레이트에 줄무늬에 의해 균주를 준비합니다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장.
- 박테리아 준비
- 약 OD 600 0.1 세균의 밀도까지 인큐베이터에서 2 시간 느슨한 뚜껑 (5 % CO 2에서 37 ℃), 진탕 동안 품어.
- 3 분 15,000 RPM의 박테리아를 원심 분리기.
- PBS에 뜨는에 resuspend을 제거한 다음 다시 원심 분리.
- 두 번 세척 단계 (2.2.4-2.2.5)를 반복합니다.
- PBS에서 박테리아 펠렛을 재현 탁.
- OD 600을 측정합니다.
- OD 600 0.1 (10 8 CFU / ㎖), 또는 OD 600 1.0 (10 9 CFU / ㎖) 하나의 문화를합니다. 이 알려진 농도에서 10 7 CFU / ml로 희석. 가능한 분사 시간에 가까운 박테리아를 준비하려고합니다.
- 마우스의 무게를.
- 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진과 쥐를 마취시키다 (10 ㎎ / ㎏)을 주입 IP
- 일단 잠, C도대체 그 고통의 응답은 열 패드 따뜻한 마우스를 유지하고 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를두고, 발가락 핀치에 의한 결석.
- 각 마우스에게 식염수 또는 PBS에 인간 트랜스페린의 8 밀리그램을 제공, IP 주입
- 꼬리에서 혈액의 작은 방울을 타고 혈액 전에 감염에 대한 멸균 확인 한천 플레이트에 확산.
- 정맥 복고풍 궤도 또는 꼬리 정맥을 통해 100 ㎕의 10 7 CFU / ㎖의 세균 배양 (10 6 CFU 총)을 주입한다. 5 분 후 주사를 촬영 CFU의 측정에 관계없이 주사 부위의 일치한다.
- 몇 분 후, 꼬리 끝을 싹둑 즉시 감염 다음과 같은 혈액 CFU을 설정하는 하나의 10 배 희석으로 적절한 항생제로 한천 플레이트에 혈액 샘플을 확산.
- 조직 접착제로 꼬리를 밀봉.
- 주입 후, 세균 접종을 희석 CFU을 설정하는 적절한 항생제로 한천 플레이트에 확산.
- 쥐에게 허용그들은 위로 이동 될 때까지 열 패드에 복구 할 수
- 6 시간 게시물 감염에서 6 시간에 CFU을 설정하는 희석 플레이트, 꼬리에서 소량의 혈액을 그립니다.
- CO 2 밤새 5 %에서 37 ° C에서 모든 한천 번호판을 품어.
4. 희생
- 감염의 선택시, 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진과 쥐를 마취시키다 (10 ㎎ / ㎏)는 IP를 주입
- 자고 나면 열 패드로 마우스를 따뜻하게 유지합니다.
- 고통의 반사 (발가락 핀치)를 간 경우, 꼬리의 끝을 싹둑과 혈액을 그립니다.
- 적절한 항생제 한천 플레이트에 혈액을 확산, 5 ㎕를 직접 10 μL 배 희석는 CFU를 설정합니다.
- 경추 탈구하여 마우스를 희생.
- 모든 관련 기관과 윤리적 지침에 따라 마우스를 희생 한 후, 심장 박동의 부족으로 죽음을 확인합니다. 갈비뼈를 잘라 중간 선 절개를 확인하고, 듣고에 절개를t.
- 멸균 튜브에 심장 / 흉강과 장소에서 가능한 한 많은 혈액을 수집합니다.
- 멸균 플레이트에 장기 (예 : 간, 비장, 뇌)를 제거합니다.
- 피부 이식 및 멸균 플레이트에 마우스 피부의 일부를 제거합니다.
- 마우스 본체를 폐기하십시오.
- 수집 된 혈액을 15 분 동안 응고하도록 허용 한 후, 3,000 rpm에서 15 분간 원심 분리 해.
- ELISA 또는 FACS 기반의 방법에 의한 사이토 카인의 검출 예를 들어, 나중에 분석을 위해 -80 ° C에서 혈액과 매장에서 플라즈마를 분리합니다.
5. 기관 CFU 카운트
- 각 사전 생검 샘플을 채취로 PBS 500 μl를 포함하는 튜브를 균질화 무게.
- 멸균 생검 펀치를 사용하여 각 조직에서 4mm 생검 샘플을 채취.
- 500 ㎕의 PBS를 포함 preweighed 균질화 튜브에 장소 생검. 다른 장기에 작은 구슬을 사용하여 2 ㎜의 비즈 피부 샘플을 균질화.
- 나머지 t 배치현미경 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 및 저장의 문제는 (아래 참조).
- (CFU / MG 조직의 이상 계산) 생검 무게를 설정하기 위해 조직 검사를 포함하는 튜브를 균질화 무게.
- 샘플을 균질화.
- 30 초 동안 6,000 rpm으로, 간, 비장, 뇌를 균질화.
- 30 초 동안 6,000 rpm에서 피부 샘플을 균질화하고 필요한 경우 반복합니다.
- 한천 플레이트에 각 균질화 튜브에서 희석 확산과 장기 CFU 수를 설정하는 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장.
6. 조직학 / 면역 조직 화학
- 정착
- 4 ℃에서 하룻밤 4 % PFA의 조직을 수정 고정 단계는 더 이상 할 수 있으며, 장기간 동안 저장이 0.25 % PFA의 조직을 배치합니다.
- PBS에서 조직을 씻어 다음 20 % 자당 용액에 넣고 하룻밤 또는 조직이 솔루션에 침몰 할 때까지 4 ° C로 돌아갑니다.
- (조직 형 또는베이스 보드에 부착 된 하나) 크기의 OCT 솔루션의 장소로 절단, PBS에서 조직을 씻으십시오.
- 빨리 액체 질소에 떠있는 페트리 접시에 조직을 동결.
- 냉동 한 후, 저장을위한 -80 ° C로 전송하기 전에 드라이 아이스에 조직을 넣어.
- 슬라이스
- -80 ° C에서 조직을 제거하고 저온 유지 장치에 -20 ° C에 평형 수 있습니다.
- 슬라이스 약 10 ~ 15 ㎛의 두께로 조직 및 코팅 현미경 슬라이드에 배치합니다.
- 필요할 때까지 상점은 -20 ° C에서 슬라이드.
- 염색
- 슬라이드는 실온에 와서 수 있습니다.
- 소수성 펜으로 슬라이드의 조각 주위에 그립니다. 5 ~ 10 분을 기다립니다.
- 5 분 동안 PBS에서 / 세척 슬라이스를 재수, 두 번 반복합니다.
- 10 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤의 투과 조각.
- 5 분 동안 PBS 2 배에 씻으십시오.
- PBS의 차단10-60 분 사이에 사용되는 항체 또는 얼룩에 따라서는 0.1 % 트리톤 1 % BSA.
- 버퍼를 차단 제거하고 블록 버퍼에 필요한 희석 일차 항체를 추가합니다. 정해진 시간 동안 배양한다. (종종 실온에서 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤).
- 5 분 동안 PBS 2 배에 씻으십시오.
- 복 버퍼에 적절한 희석 차 항체를 적용, DAPI는 일반적으로이 단계에 포함되어 있습니다. 어둠 속에서, 정해진 시간에, 종종 1 ~ 2 시간 실내 온도에 품어.
- 5 분 동안 PBS 2 배에 씻으십시오.
- 커버 유리로 설치 미디어를 보호 페이드 마운트 및 손톱 광택과 도장.
- 이미지 스테인드 즉시 슬라이드 또는 4 ℃에서 보관
- 사용 된 형광 물질에 적합한 필터 / 레이저로 설정 공 초점 형광 현미경 이미징을 수행합니다.
- 조직학
- 조직학은 실온에 와서하는 슬라이드를 사용할 수 있도록 허용합니다.
- 로 사용하여 얼룩 슬라이드tandard의 헤 마톡 실린 / 에오신 염색 프로토콜입니다.
- 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓습니다.
- 다음과 같은 순서로 솔루션 사이의 슬라이드와 랙을 이동 :
- 흐르는 수돗물에 2 초.
- 필터링 헤 마톡 실린 용액에서 3 분.
- 흐르는 물에 10 초.
- 증류수 10 초.
- 에탄올 100 %로 10 초.
- 필터링 에오신에 2 초.
- 흐르는 물에 10 초.
- 에탄올 100 %로 10 초
- 2 분 자일 렌 × 3에 (목욕 I, II, III).
- 즉시 전송하고, 상단에 각 슬라이드, 장소 커버 슬립에 고정 접착제 몇 방울을 추가 기포를 제거, 몇 시간 동안 건조시켜주십시오.
- 이미지는 표준 백색광 현미경 슬라이드.
Representative Results
CFU 카운트
N. 이러한 대표적인 결과에 사용 수막염 변형은 N입니다 , OPC는 - - PilC1 + / PilC2 + 20 수막염 8013 클론 (12), 혈청군 C 임상 분리, 나는 SB의 pilin, 오파 클래스를 표현. 변형 염색체 삽입 (18)로부터 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 설계되었다. 세균 콜로니 형성 단위 카운트는 한천 플레이트에 콜로니의 수를 계산하고 혈액의 CFU / ㎖ 또는 도금 알려진 볼륨에서 조직의 CFU / MG 하나를 계산하여 설정됩니다. 혈액 수는 5 분 10 6 CFU의 세균의 정맥 주사 후 혈액 순환 1.5 × 10 5 CFU / ㎖의 평균 (그림 1A) 있다는 것을 보여 주었다. 6 시간 후에 수는 4.8 × 104 CFU / ml의 평균. 24 시간으로 평균 수는 4 CFU / ㎖ × 10 2.4했지만 10 생쥐의이 그룹에서 5했다이 탐지 다른 5가 상대적으로 높은 카운트 (그림 1A)를 가지고있는 동안 박테리아를 순환. 피부 샘플에서 가져온 CFU 수는 마우스가 2.1 × 104 CFU 6 시간에서 조직 / MG와 24 시간에서 조직의 4.4 × 10 2 CFU / MG (그림 1B)를 평균, 인간의 피부에 상당한 수를 갖는 대부분을 보여 . 반대측 마우스의 피부 샘플 N.에 대한 강한 선호를 보여, 24 시간 및 6 시간에 만 매우 낮은 수에서 더 박테리아 수 없었다 이식 피부 (그림 1B)에서 인간의 혈관 수막염. 일반적으로 세균의 수는 2 동물들이 높은 세균 수 (그림 1C)를 순환과 상관으로, 혈액에서 오염에 기인 할 수있다 쇼 수를 했더라도 샘플링 다른 장기에 nondetectable 매우 낮았다. 모델은 타입 IV 파이에게 예를 들어, 생체 내에서 독성 인자의 역할을 결정하기 위하여 사용될 수있다리. 정의 TFP 결여 균주 결과 pilD 유전자 21의 돌연변이뿐만 아니라 제안 된 TFP '히젼'을 결여 pilC1 유전자 08 가진 균주가 모델에 도입 하였다. 이러한 돌연변이는 총요소 생산성은 생체 내 (그림 1D)에 접착에서 재생하는 중요한 역할을 확인하고, 인간의 피부 이식에없는 세균의 부착 결과.
면역 조직 화학 / 조직학
이 실험에서 우리는 N.을 사용 차 염색을위한 필요없이 형광 검출을 가능하게하는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현 수막염의 변종. 인간의 혈관, 인간의 내피 세포에 대한 마커를 사용하여 하나 CD31 (PECAM-1) 또는 렉틴 Ulex의 europaeus의 응집소 (UEA) 18, 22를 염색 하였다. UEA는 한 단계 염색법 (도 2A-C) 허용 로다 민에 접합시켰다. 세포 핵을 염색 할 수있다DAPI와 ED는 조직 구조 (그림 2A-B)를 식별하는 데 도움이. 조직학은 표준 헤 마톡 실린 / 에오신 염색을 사용하여 실시 하였다. 피부의 표피 / 피부 경계가 명확하게 식별했다. 염증, 혈전증과 혈관 누출은 감염 (그림 2D) 후이 국경을 24 시간에 가까운 선박에 집중했다. 혈전증은 종종 혼잡과 염증을 동반 여러 개의 작은 피부 혈관에서 볼 수 있었다. 조직으로 축소 적혈구의 누출은 혈관 손상의 광범위한 레벨을 나타내는 볼 수 있었다. 비감염 생쥐에 이식 피부의 조직 병리학없이 구별 염증 (18)와 정상 나타났다. 감염의 약 30 %가 피부에있는 박테리아 부착은 육안 검출 자반병 (도 2E 및 2F)의 개발에 이르게한다.
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그림 1. CFU 카운트. (A) 5 분, 6 시간 및 24 시간 후 감염의 혈액 밀리리터 당 세균 CFU 카운트. (B) 박테리아 CFU은 6 시간과 24 시간 후 감염 모두에서 인간의 피부 (HS)와 마우스의 피부 (MS)를 비교하는 피부 샘플에서 계산합니다. (C) 세균 CFU는 다른 기관이 24 시간 후 감염을 촬영부터 계산합니다. 야생형 N.에 감염된 마우스에서 24 시간 후 감염에 찍은 인간과 쥐의 피부 샘플에서 박테리아 CFU 수를 비교 (D) 수막염 2C43 얼룩 (WT), pilD 유전자 (pilD) 또는 pilC1 유전자 (pilC1)의 돌연변이 균주의 돌연변이로 변형. 모든 그래프는 중간 원시 데이터로 표시됩니다. 그림은 Melican 등. 18에서 수정"_blank"> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 피부 (D) 표피 (E) 국경에 가까운 UEA 렉틴 (빨강)로 염색 인간의 미세 혈관을 보여주는 공 초점 스택의 현미경. (A) 투사. 용기 N. 감염된 수막염 (녹색) 2 시간 게시물 감염. (B) 광학 슬라이스와 N. 보여주는 슬라이스 돌기 (C) 수막염의 microcolonies (녹색) 감염 인간의 용기 (UEA - 빨간색) 피부 이식 2 시간 게시물 감염 내. 인간의 피부 이식의 (D) 헤 마톡 / 에오신 염색은 N. 24 시간 동안 감염 수막염. 표피 (E)는, 피부 (D) 경계는 명확하게 볼 수 광범위한 혈전증 및 microvess의 정체입니다ELS (화살표)는 진피에서 볼 수있다. 염증과 일부 혈관 누출 (화살촉)도 식별 될 수있다. (E) 전에 감염에 대한 인간의 피부 이식. (F) N.와 (E) 24 시간 후 감염과 동일한 피부 이식 부르르 지역 (화살표)를 표시하는 수막염은. 2B는, 2D, 2E, 그리고 2 층이 Melican 등. 18에서 수정은 그림 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
동물 모델은 세균성 병인 연구에 매우 중요하다. 그것은 완전히 세포 배양에서 생체 내 환경을 모방하는 것은 불가능하며 기주 - 많은 동적 요인에 좌우되고 있다는 것이 명백 해지고있다. 같은 N. 일부 임상 적으로 중요한 병원체의 인간의 특이성 수막염은, HIV, HCV, 열대열 원충 (Plasmodium falciparum), 리스테리아 균, 살모넬라 균이 감염에 대한 생체 내 모델의 사용을 제한하고있다. 우리는 전염성 단계 특이성에 관여하는 이해하기 시작 그러나, 인간 답게 모델이 개발되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 N.과 생체 내 감염의 광범위한 허용, 생쥐로 인간의 미세 혈관의 도입이의 데모입니다 수막염은 혈관 손상과 가끔 부르르 발진의 개발의 결과로.
이 모델을 사용하여,우리는 총요소 생산성의 접착 성이 세균의 돌연변이 체를 사용하여 혈관 손상이 접착 (18)의 부재에서 감소된다 의해 생체 내에서 혈관 식민지에 참여하는 것으로 정의 할 수 있었다. 이전에는 순환 세균 제품이 손상 연루되어있다 그러나 우리의 결과는 지역의 접착 및 혈관 식민지에 대한 결정적인 역할을하는 것이 좋습니다. 이 새로운 치료 표적 개발을위한 새로운 가능성을 엽니 다. 병원성 세균의 부착은 약학 적으로 차단 될 수 있다면 그것은 아마도 피부 병변의 발생을 예방하고 조직 괴사, 괴사 조직 제거 및 사지 절단의 측면에서 수막 구균 생존자를위한 더 나은 결과로 이어질 수 있습니다. 작업은 또한 감염의 복잡성과 면역 반응과 응고 캐스케이드의 참여를 보여 주었다. 우리는 현재 인간의 내피 (18)의 상대적으로 작은 양에도 불구하고 감염된 생쥐의 혈청에서 인간의 사이토 카인 신호를 확인했다.이 영역에 마우스 면역 세포 집단의 침윤과 함께 중요한 시토 킨 반응을 나타냈다.
동물 모델은 물론 완벽하게 인간의 질병을 복제 할 수 없다 모든 결과를 염두에두고 고려되어야 그들로부터 얻고. 예를 들어,이 모델의 혈액 순환 세포를 마우스의 원산지이며, 우리는 그들이 인간의 세포에 다르게 동작 할 수 있음을 할인 할 수 없습니다. 이것의 장점은 그러나, 우리의 최근 간행물 (18)에서와 같이, 순환 마우스 세포와는 인간 내피로부터 발신 신호를 구별 할 수있는 능력이다. 이 모델에서 사용 된 마우스의 면역 배경 또한 상기 '인간화'양태를 추가, 인간 면역 세포 집단의 동종 전송을 허용한다. 쥐의 면역 배경 그러나 모든 부족하거나이 모델에서 결함이 NK, T 또는 B 세포의 역할을 마스크 할 수 있습니다. 상대적으로 짧이 모델에 사용되는 t의 기간 (24 시간)을 중심으로 타고난 반응을 우려하지만, 장기 감염과 면역 다른 옵션의 발전을 위해 탐구 할 필요가 있습니다.
피부는 N.을위한 중요한 감염 사이트입니다 수막염하지만 인간의 혈관은 비교적 적은 양을 갖는 또한 수많은 기관을 포함한 전신 감염에 데이터를 외삽하는 것은 어렵다는 것을 의미한다. 이 모델은 피부 병변 개발의 연구를 위해 수 있지만, 이러한 상피 및 뇌 혈관 횡단 등의 수막 구균 감염의 중요한 단계는 포함되어 있지 않습니다. 이러한 인간화 모델의 발전은 감염의 다른 측면을 해결하기 위해 필요하다. 그럼에도 불구하고이 모델은 수많은 사람의 특정 병원균, 혈관을 대상으로 특히 큰 잠재력을 제공합니다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 원고의 중요한 읽기 Dumenil 연구소의 모든 구성원, 특히 실케 실바에게 감사의 말씀을 전합니다. HOPITAL Europeen에서 조르쥬 퐁피두 (HEGP), 박사 데이비드 Maladry의 수술 부서. 마이클 Hivelin 박사 패트릭 Bruneval, HEGP에서 병리학 교실. 엘리자베스 HUC 이끄는 PARCC의 동물 시설. 이 작품은 다음과 부여 기관에 의해 지원되었다 : 마리 퀴리 IEF 교제 없음. 273223 (KM), INSERM에서 ATIP-Avenir에서 그랜트, CODDIM 장비 보조금 (일 드 프랑스 지역), FRM 장비 부여, 우수 컨소시엄의 IBEID 연구소 (매그 라 공들인 médicale을 부어), ANR 부여 "(직원은 국립 라 공들인을 부어) 버그 인 흐름 ". 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
