Summary
Neisseria meningitidis kan damarları bulaşan bir insan özgü patojendir. Bu protokolde insan mikrodamarlar bağışıklığı fare üzerine insan cildi aşılama yaparak bir fare sokulur. Bakteriler genellikle insan durumda gözlenen purpurik döküntü vasküler hasar ve gelişimine yol açan, insan gemilere yoğun yapışır.
Abstract
Bu insan kan dolaşımına girdiğinde Neisseria meningitidis ağır, sık sık öldürücü sepsis neden olur. Enfeksiyon vasküler sızıntı, purpura döküntü ve nihai doku nekrozu geliştirilmesi ile sonuçlanan kan damarlarının geniş bir hasara yol açar. Bu enfeksiyonun patogenezinin incelenmesi, daha önce in vivo modellerde zorlaştırır bakterilerin insan özgüllük ile sınırlıydı. Bu protokol, insan derisi, dermal mikrodamarlar ihtiva eden, bağışıklık sistemi üzerine aşılanmış farelerde edildiği bu enfeksiyon için bir insanlaştırılmış modeli açıklar. Insan özelliklerini korurken bu gemiler fare dolaşımı ile anastomoz. Bir kez bu model, N. içine tanıttı meningitidis geniş vasküler hasar, enflamasyon ve purpurik döküntü bazı durumlarda gelişimi ile sonuçlanan insan gemiler için özel olarak uygun. Bu protokol conte bu modelin aşılama, enfeksiyon ve değerlendirme aşamalarını açıklarN. xt meningitidis enfeksiyonu. Bu teknik, kan akışı enfekte çok sayıda insana özgü patojenlere uygulanabilir.
Introduction
Meningococcal sepsis, bakteriyel patojen Neisseria meningitidis tarafından neden olunan bir sıklıkla ölümcül bir kanla enfeksiyondur. Meningokok sepsis hastalar sıklıkla önceden dolaşan bakteriler ve bakteriyel ürünler 1 neden vasküler yıkım ile ilişkili olduğu kendi cilt üzerinde bir peteşiyal veya purpurik döküntü ile mevcut. Klinik hastalardan alınan deri biyopsileri genellikle damarlarına 2 dolgu, kılcal damarlarla ilişkili bakterileri göstermektedir. Yanı sıra, bakteriler, geniş tromboz, pıhtılaşma, tıkanıklık ve vasküler sızıntı purpurik bölgelerde 3-5 görülür. Bu vasküler hasar meningokok kurtulan debridman ve hatta amputasyon sonuçlanan, deri ve çevreleyen dokuların geniş nekrozu yol açabilir. Enfeksiyon, bu vasküler hasara neden nasıl anlamak önleme ve tedavi stratejilerini optimize etmek için önemlidir. Meningokok sepsis araştırma çoğunluğu üzerine in vitro yapılmıştırN. insan özellikten dolayı insan hücre çizgileri meningitidis. Enfeksiyon birçok yönleri bakteriyel yapışma, konakçı hücre yanıtı hem de sitokin tepkisi 6-9 de dahil olmak üzere, in vitro incelenmiştir. Tip IV pili (TFP) N. için önemli yapışma organel gibi emplikedir meningitidis epitelyal ve endotelyal hücreler 10 hem de. Ayrıca, N. bu yapışma gösterilmiştir konukçu hücrelere meningitidis kesme stresi bağımlıdır ve bu nedenle, mikrovasküler 11 kan akış hızları ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu bakteri in vivo yüz dinamik gerilmeler patogenezinde çok önemli olduğunu düşündürmektedir. Bu, in vitro olarak, küçük damarların mikro modellemek için ancak çok zordur.
Neisseria TFP için yapışma reseptörü hala bilinmemektedir ve bu nedenle, bir hayvan modelinde bakteriyel yapışmayı elde etmek için knock-in stratejileri bu anda öngörülen edilemez. CD46 TFP reseptör ve transgenik hayvanlar fare modelleri olarak hareket etmek üretildi olduğu öne sürüldü. Bununla birlikte, bu hayvanlarda enfeksiyon geniş enfeksiyona yol değildir ya da geliştirme 12,13 döküntü. Neisseria enfeksiyonun bakteremi yönü için tarif edilmiş olan diğer hayvan modelleri dikkate bir demir kaynağı 14,15 insan transferin için bakteriyel tercih alır. Insan transferin tamamlayan ya da uzun bir süre içinde kan akışında bir artış bakteri yükünde bir transgen sonuçlardan bu ifade, ancak bu model no bakteriyel yapışmayı veya döküntü gelişimini gösterir 16,17 ya.
Bu protokol, dermal mikrovasküler de dahil olmak üzere, insan derisi, farelerde bağışıklığı 18,19 üzerine transplante edildiği bir insanlaştırılmış fare modeli açıklar. Bu, fare dolaşımı ile perfüze fonksiyonel insan damarları, ile sonuçlanır. Insan transferin takviyesi ile birlikte, bu mOdel N. insan özel yönlerinden en az ikisi için hesaplar meningitidis, bir in vivo ortamda, insan endotel ve insan transferin, yani. N. meningitidis vasküler hasar ve purpurik döküntü gelişme 18 de dahil olmak üzere hastaların klinik, rapor ne benzer bir patoloji üreten, insan endotele özellikle uygun bu model damardan tanıttı.
Protocol
1.. Riskler ve İzinler
- Yerel etik kurullar, bütün hayvan protokolleri onaylaması gerekir. Bu protokol Fransız ve Avrupa laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için düzenlemeler (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 ve 2001-131 ve belirlenen esaslar çerçevesinde gerçekleştirilmiştir Avrupa Direktifi 2010/63/UE) ve yerel etik kurul Fransa Comité d'Ethique en matière d'deney Animale, Universite Paris Descartes, Paris, tarafından onaylanmıştır. No: CEEA34.GD.002.11.
- Insan cildi için, yazılı bilgilendirilmiş hasta onam alınmış ve bütün prosedürler uygulandı Fransız ulusal kurallara uygun olarak ve yerel etik kurul, Comité d'Değerlendirme Ethique de l'INSERM KİK 00003888 FWA 00005881, Paris, Fransa Opinion tarafından onaylanan: 11-048 .
- N. meningitidis potansiyel olarak zararlı bir insan patojeni ve organizasyonu tutarken gerekli tüm önlemler alınmalınism. Bu önlemler aşı ve Biyogüvenlik düzeyi 2 şartlar altında çalışan bulunmaktadır.
2. Deri naklinde kullanılan deri parçası
- Mümkün olduğunca zaman aşılama gibi yakın insan derisi toplayın. Bu çalışmada deri çoğunluğu karın bölgesini kapsayan plastik cerrahi operasyonları gelmektedir. Meme, bacak ve hatta yüz gibi diğer kaynaklar da başarı ile kullanılmıştır.
- % 70 EtOH ile deri yüzeyin temizlenmesi ve tercihen bir akış hunisi altına, iyi temizlenmiş yüzey üzerinde düz olarak uzanarak, insan derisi örnek hazırlayın.
- Önceden belirlenmiş bir kalınlığa sahip bir dermatomal kullanarak deri üstünden 200-400 um dilim dilim.
- Kısa süreli depolama için% 10 serum (3-12 saat ile hemen veya DMEM içinde 4 ° C'de bir aşılama durumunda bütünlüğü için cilt dilimleri kontrol edin ve 2 cm x 2 cm kare içine kesilmiş, daha sonra (iki değerli katyonlar olmadan) PBS içinde yer .)
- Ketamin (100 mg / kg) ve Ksilazin (10 mg / kg) ile inje 6-8 haftalık SCID.bg fareler (yaklaşık olarak 20 g) uyuşturanCTED ip
- Fareler anestezi sonra, bir ayak tutam, ağrı refleks kurmak için standart bir yöntem gerçekleştirerek ağrı yanıtı kontrol edin. Kornea kurumasını önlemek ve greft yerleştirileceği omuz arkasında hayvanın sol tarafını tıraş gözlere jel uygulanır. Prosedür boyunca bir ısı pedi üzerinde fare sıcak tutun.
- Ameliyat için fareyi hazırladığımız sonra,% 70 EtOH ile traş bölgeyi temizleyin.
- Greft sitede (Tronothane) topikal olarak lokal anestezi uygulayın ve dikkatlice kavisli bir makasla fare derisine yüzeysel tabakasını kaldırarak greft sitesi hazırlamak. Altta yatan damarsal bozmak için dikkatli olun.
- Insan derisi dilimin alanı biraz daha küçük bir alanda deri çıkarın.
- PBS (veya DMEM) cilt dilim çıkarın ve greft Yatağın üzerine yerleştirmek, epidermal yüzü yukarı bakacak sağlanması. Adımları 2.8-2.10 greft yatak kurumasına değil sağlanması, mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
- Bir köşesini hizalayınveya doku yapıştırıcı ile kenar ve düzeltme. Dikkatle kenarlarında doku yapıştırıcısı küçük miktarlarda yerleştirerek, greft yatağına cilt dilim kalanını uygun. Her zaman boyutuna insan derisini kesmek yerine greft Yatakta daha büyük yapmak.
- Fare cilt çok esnek olduğu gibi aşı yatağın üzerinde çok sıkı cilt çekmeyin.
- Greft her köşesinde doku yapıştırıcı ile sabit olduğundan emin olun.
- Iyot çözeltisi ile bölgeyi temizleyin.
- Greft üzerinde yastık alanı ile Band-Aid uygulayın. Band-Aid sağlam ama sıkı değil ve hayvanın nefes etkilenmez emin olun.
- Pansuman bandı ile Band-Aid Fix.
- Hayvan sıcak bir yüzey üzerinde kurtarmak için izin verin.
- Bir kez uyanık, kendi kafesine hayvan dönün. Hayvanlar 2-3 başına kafes yerleştirilmiştir.
- Ağrı veya sıkıntı belirtileri için kurtarma sırasında düzenli olarak farelerin kontrol. 10-14 gün sonra aşılama, greft bozmak için dikkatli olmak, Band-Aid kaldırın. Bizim tecrübelerimize göre postoperatif ağrı miniMal. Bununla birlikte hayvan işlemini takiben, birkaç gün, özellikle de her gün izlenmelidir. Ağrı veya sıkıntı için kriterler şunlardır.
- % 10 üzerinde ağırlık kaybı
- Fiziksel görünüm, kürk, kambur pozisyonda, gözler
- Artmış solunum veya kalp hızları
- Azalmış veya olağandışı hareketler.
- Vücut sıcaklığında Rise
- Durumda, ağrı işaretleri tespit edilir parasetamol (300 mg / kg, her 4 saat) oral yoldan tatbik edilir. İnsani uç noktaları kesinlikle ağrı devam ederse yapıştırılır.
- Greft esnek cilt tutmak için her 2-3 gün bebek yağı uygulayın kuru görünüyorsa.
- Greft deney 21 gün sonrası greft için hazırdır.
3. Enfeksiyon
- Enfeksiyondan bir gün önce, uygun antibiyotik ile birlikte agar plakaları üzerine GCB çizgi oluşumu bakteri suşu hazırlar. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca büyütün.
- Bakteriler hazırlık
- OD 600, yaklaşık 0.1 'un bir bakteriyel yoğunluğa kadar kuluçka makinesi içinde 2 saat gevşek kapaklı (% 5 CO2 içinde 37 ° C), boyunca çalkalarken kuluçkalayın.
- 3 dakika için 15,000 rpm bakterileri santrifüjleyin.
- PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon kaldırmak, sonra tekrar santrifüj.
- Iki kez yıkama adımı (2.2.4-2.2.5) tekrarlayın.
- PBS bakteriyel pelletini.
- OD 600 ölçün.
- OD 600 0,1 (10 8 CFU / ml) ya da OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml) ya da bir kültür yapın. Bu bilinen bir konsantrasyonu, 7 10 CFU / ml 'ye seyreltilir. Mümkün olduğunca enjeksiyon zamanına yakın bakterileri hazırlamak için deneyin.
- Fareler tartılır.
- Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin ile farelerin uyuşturan (10 mg / kg) enjekte ip
- Bir kere uykuda, chalt ağrı yanıtı bir ısı pedi sıcak fareler tutmak ve kurumasını önlemek için göz merhemi koymak, bir ayak-tutam tarafından yoktur.
- Her bir fareye salin veya PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş insan transferrin 8 mg, ver, ip enjekte
- Kuyruk kan küçük bir damla alın ve kan enfeksiyonu öncesi steril kontrol etmek için bir agar plakası üzerine yayılmıştır.
- Damardan retro-orbital ya kuyruk damarı yoluyla 100 ul 10 7 CFU / ml bakteri kültürü (10 6 CFU toplam) enjekte edilir. 5 dakika sonrası enjeksiyon alınan CFU ölçümleri bağımsız enjeksiyon yerinde tutarlıdır.
- Birkaç dakika sonra, kuyruk ucu makasla kesme ve hemen enfeksiyonun ardından kan CFU kurmak için bir 10-kat seyreltme ile, uygun antibiyotik ile birlikte agar plakaları üzerine kan örneği yayıldı.
- Doku yapıştırıcı ile kuyruk Seal.
- Enjeksiyondan sonra, bakteriyel inokulum sulandırarak CFU kurmak için uygun antibiyotik ile birlikte agar plakaları üzerine yayıldı.
- Farelere Verenonlar kadar ve hareketli kadar bir ısı pedi üzerinde kurtarmak için
- 6 saat sonrası enfeksiyondan 6 saatte CFU kurmak sulandırmak ve plaka, kuyruk kan küçük bir miktar çizin.
- CO2 gece boyunca% 5 37 ° C'de tüm agar inkübe edin.
4. Kurban
- Enfeksiyon seçilmiş zamanda, Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin ile farelerin uyuşturan (10 mg / kg) ip enjekte
- Uykuda kez, bir ısı pedi ile fare sıcak tutmak.
- Ağrı refleks (toe-tutam) gitti zaman, kuyruk ucunu makasla kesme ve kan çizin.
- Uygun antibiyotik ile agar plakları üzerine kan yayıldı; 5 ul doğrudan ve 10 ul 1:10 seyreltme CFU kurmak.
- Servikal dislokasyon ile fare Kurban.
- Ilgili tüm kurumsal ve etik kurallara göre fareyi ödün sonra, kalp atışı eksikliği ölümü onaylayın. Göğüs kafesi ile kesmek bir orta hat kesi yapmak ve duymak bir kesi yapmakt.
- Steril tüp içinde, kalp / göğüs boşluğu ve yerden mümkün olduğu kadar fazla kan toplamak.
- Steril bir tabak içine organların (karaciğer, dalak, beyin) sökün.
- Deri grefti ve steril plaka içine fare deri bir bölümü çıkarın.
- Fare vücudun atmayın.
- Toplanan kan, 15 dakika boyunca pıhtılaşmaya bırakılmıştır, sonra, 3000 rpm'de 15 dakika santrifüj o.
- ELISA veya FACS bazlı yöntemler ile sitokin tespiti için, örneğin daha sonraki analizler için -80 ° C'de kan ve plazma depodan çıkartın.
5. Organ CFU Sayımlar
- Her öncesinde biyopsi örnekleri alınarak PBS 500 ul içeren tüpler homojenize tartılır.
- Bir steril biopsi zımba kullanılarak her dokudan 4 mm biyopsi örnekleri al.
- 500 ul PBS içeren önceden tartılmış homojenize tüplere yer biyopsileri. Diğer organlar için daha küçük boncuklar kullanımı, 2 mm boncuk deri örnekleri homojenize.
- Kalan t yerleştirinmikroskopi için 4 ° C 'de% 4 paraformaldehit (PFA) ve mağaza sorunları (aşağıya bakınız).
- (CFU / mg doku daha sonra hesaplanması için) biyopsi ağırlık kurmaya biyopsileri içeren tüpler homojenize tartılır.
- Örnekleri homojenize.
- 30 saniye boyunca 6000 rpm, karaciğer, dalak ve beyin homojenize.
- 30 saniye boyunca 6,000 rpm'de deri örnekleri homojenize ve gerekirse tekrarlayın.
- Agar plakaları üzerine her homojenize tüpten seyreltileri yaymak ve organ CFU sayısını belirlemek için,% 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca büyür.
6. Histoloji / İmmünohistokimya
- Tespit
- 4 ° C'de bir gece% 4 PFA içinde dokular tamir Fiksasyon adım daha uzun olabilir, daha uzun süreler için saklanması% 0.25 PFA dokuları koyarsanız.
- PBS ile yıkayın ve daha sonra dokular% 20 sukroz çözeltisi içinde yer ve gece boyunca ya da dokular çözeltide batmış kadar 4 ° C 'geri dönün.
- (A doku kalıp içinde ya da bir baz kartına yapıştırılmış olarak) boyutu ve Ekim çözelti içinde yer kesim, PBS içinde dokuları yıkayın.
- Hızla sıvı azot içinde yüzen bir Petri kabı üzerindeki dokuları dondurmak.
- Dondurulduktan sonra, depolama için -80 ° C aktarılmadan önce kuru buz üzerine dokuları koydu.
- Dilimleme
- -80 ° C ila dokuları çıkarın ve kriyostat -20 ° C'de denge sağlaması için izin verir.
- Dilim yaklaşık olarak 10-15 um bir kalınlığa sahip dokular ve kaplanmış mikroskopi slaytlar üzerine yerleştirin.
- Ihtiyaç kadar mağaza -20 ° C'de kayar.
- Boyanma
- Slaytlar oda sıcaklığına izin verir.
- Bir hidrofobik kalem ile slaytta dilim etrafında çizin. 5-10 dakika bekleyin.
- 5 dakika boyunca PBS içinde yıkama / dilim rehidrate, iki kere yineleyin.
- 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton Permeabilize dilim.
- 5 dakika süre ile PBS 2-3x yıkayın.
- PBS içinde Block10-60 dakika arasında kullanılmak üzere antikor veya leke bağlı olarak,% 0.1 Triton% 1 BSA.
- Bloklama tamponunu çıkarın ve blok tamponu içinde gerektiği gibi seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Belirlenmiş bir süre için inkübe edilir. (Çoğu zaman, oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C de).
- 5 dakika süre ile PBS 2-3x yıkayın.
- Bock tamponu içinde uygun olarak seyreltilmiş sekonder antikor uygulayın; DAPI tipik olarak bu aşamada dahil edilir. Karanlıkta, belirlenmiş bir süre, genellikle 1-2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- 5 dakika süre ile PBS 2-3x yıkayın.
- Bir cam kapak ile montaj medya korunması solmaya Dağı ve tırnak cilası ile mühür.
- Görüntü lekeli hemen slaytlar veya 4 ° C'de mağaza
- Kullanılan fluoroforlar uygun filtreler / lazerler ile kurulmuş bir konfokal veya floresan mikroskobu ile görüntüleme gerçekleştirin.
- Histoloji
- Histoloji oda sıcaklığına gelmesi için slaytlar kullanılmak üzere izin verin.
- Olarak kullanarak Leke slaytlartandard hematoksilen / eosin boyama protokolü.
- Slayt rafa slaytlar yerleştirin.
- Aşağıdaki sırayla çözümleri arasında slaytlar ile raf aktarın:
- Akan musluk suyu içine 2 sn.
- Süzüldü hematoksilin çözelti içinde 3 dk.
- Akan su içine 10 sn.
- Damıtılmış su içinde 10 sn.
- Etanol% 100 içine 10 sn.
- Süzülmüş eozin içine 2 sn.
- Akan su içine 10 sn.
- Etanol% 100 içine 10 sn
- 2 dakika ksilen x 3 içine (banyo I, II, III).
- Hemen aktarmak ve, üstüne her slaytlar, yer kapak kayma üzerine tespit tutkal birkaç damla ekleyin hava kabarcıklarını çıkarmak, birkaç saat kurumasını bekleyin.
- Görüntü bir standart beyaz ışık mikroskobu altında kayar.
Representative Results
CFU sayımları
N. Bu temsili sonuçlarda kullanılan meningitidis soyu N olduğu , Opc - - PilC1 + / PilC2 + 20 meningitidis 8013 klon 12, bir serogrup C klinik izolat, ben SB pilin için Opa bir sınıf ifade. Suş bir kromozom ekleme 18 yeşil floresan protein (GFP) ifade etmek için edilmiştir. Bakteri kolonisi oluşturan birim sayısı agar plakaları üzerinde koloni sayısının sayılması ve kan CFU / ml veya kaplama, bilinen miktarlar doku CFU / mg ya da hesaplanarak belirlenir. Kan sayımları, 5 dakika 10 6 CFU bakteri iv enjeksiyonundan sonra kanda dolaşan 1.5 x 10 5 CFU / ml 'lik bir ortalama (Şekil 1A) var olduğunu gösterdi. 6 saat sonra sayısı 4.8 x 10 4 CFU / ml ortalama. 24 saat ile Ortalama sayılar 4 CFU / ml x 10 2,4 ama 10 farelerin bu grubunda, 5 vardısaptanabilir bir diğer 5 nispeten yüksek sayıları (Şekil 1A) vardı bakteri dolaşan. Deri örnekleri alınan CFU sayısı farenin 2.1 x 10 4 CFU 6 saat sonra doku / mg ve 24 saat sonra doku 4.4 x 10 2 CFU / mg (Şekil 1B), ortalama insan derisinde önemli bir sayısını olan çoğunluğunu göstermek . Kontralateral fare deri numuneleri N. için güçlü bir tercih gösteren, 24 saat ve 6 saat sonra, sadece çok az sayıda hiçbir bakteri miktarını göstermiştir Aşılanmış deri (Şekil 1 B) insan gemilere meningitidis. Genel olarak, bakteri sayısı 2 hayvanları, yüksek bakteri sayısını (Şekil 1C) dolaşan ile ilişkili olarak, kandan kirlenme atfedilebilir göstermek sayılarını, her ne kadar örnek, diğer organlarda bulgulanabilir olmayan çok düşüktü. Bu model aynı zamanda tip IV pi, örneğin, in vivo olarak hastalık oluşturma faktörlerinin rolü belirlemek için kullanılabilirli. Tanımlanan TFP yoksun bir suş ile sonuçlanan pilD genindeki mutasyonlar 21, hem de önerilen TFP 'adezini' eksik pilC1 geni 8 ile Bakteriyel suşlar modeli tanıtıldı. Bu mutasyonlar TFP vivo (Şekil 1D) adezyonun oynadığı önemli rol onaylayan, insan deri grefti hiçbir bakteriyel yapışma sonuçlandı.
İmmünohistokimya / Histoloji
Bu deneylerde kullanılan N. İkinci boyanması için gerek kalmadan floresan tespit edilebilmesi için, yeşil floresan protein (GFP) ifade meningitidis suş. İnsan kaplar, insan endotel için bir marker ile ya da CD31 (PECAM-1) veya lektin Ulex europaeus agglutinin (UEA) 18,22 boyandı. UEA tek aşamalı bir boyama (Şekil 2A-C) izin rodamin konjüge edildi. Hücre çekirdekleri leke olabilirDAPI ile ed doku yapıları (Şekil 2A-B) belirlemenize yardımcı olması için. Histoloji standart hematoksilin / eozin lekeleme kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Cildin epidermal / dermal sınır açıkça tanımlanabilir oldu. Enflamasyon, tromboz ve damar sızıntısı enfeksiyonu (Şekil 2D) sonra bu sınır, 24 saat yakın kaplara konsantre edildi. Tromboz genellikle tıkanıklığı ve iltihabı eşlik birkaç küçük dermal damarları, görülebildi. Dokuların içine kırmızı kan hücrelerinin damar sızıntısı hasar geniş bir düzeyini belirten görülebilir. Enfekte olmamış aşılanmış farelerde deri histopatolojisi ayırt edilebilir bir inflamasyon 18, normal görünüyordu. Enfeksiyonlarının yaklaşık% 30 olarak, deri bakteriyel yapışma makroskopik olarak tespit purpura (Şekil 2E ve 2F) gelişmesine yol açar.
Src = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" />: fo "5in"
Şekil 1. CFU sayımları. (A), 5 dakika, 6 saat ve 24 saatlik enfeksiyondan kan ml başına Bakteri CFU sayımları. (B) Bakteriyel CFU 6 saat ve 24 saat sonrası enfeksiyon hem de insan cildi (HS) ve fare derisi (MS) karşılaştırarak deri örneklerinden sayar. (C) Bakteriyel CFU diğer organlar 24 saat sonrası enfeksiyon alınan sayar. Vahşi tip N. ile enfekte olan fareler 24 saat enfeksiyondan alındığı, insan ve fare derisi örneklerinden Bakteri CFU sayımları karşılaştırma (D) meningitidis 2C43 leke (WT), pilD geni (pilD) ya da pilC1 geni (pilC1) içinde bir mutasyona sahip bir suş içerisinde bir mutasyon içeren bir suş. Tüm grafikler medyan ile ham veri olarak gösterilmiştir. Şekil Melican et al. 18 değiştirildiğinde"_blank"> Büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Dermal (d) epidermal (e) sınır yakınında UEA lektinle (kırmızı) ile boyanmış bir insan mikrodamar gösteren bir konfokal yığının mikroskopi. (A) Projeksiyon. Damar N. ile enfekte meningitidis (yeşil) 2 saat sonrası enfeksiyon. (B) bir optik dilim ve N. gösteren bir dilim projeksiyon (C) meningitidis mikrokoloniler (yeşil) enfeksiyonu insan kap (UEA - kırmızı) bir deri grefti 2 saat sonrası enfeksiyon içinde. Insan derisi greft (D) Hematoksilen / eozin lekeleme N ile 24 saat için enfekte meningitidis. Epidermal (e), dermal (d) sınır açıkça görülebilir ve kapsamlı tromboz ve microvess tıkanıklığı olanels (oklar) dermis görülür. Enflamasyon ve bazı vasküler sızıntı (ok başı) da tespit edilebilir. (E) enfeksiyon öncesinde Insan derisi grefti. (F) N. ile (E) 24 saat sonrası enfeksiyon gibi aynı deri grefti Purpurik bölgeleri (oklar) gösteren meningitidis. 2B, 2D, 2E, 2F ve Melican vd. 18. modifiye edilmiştir Rakamlar büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Discussion
Hayvan modelleri bakteriyel patogenez araştırma önem taşımaktadır. Bu, tam olarak, hücre kültüründe in vivo ortamı taklit etmek mümkün değildir ve konukçu-patojen etkileşimi çok dinamik faktörlerden etkilenir açık hale gelmektedir. Böyle N. gibi bazı klinik olarak önemli patojenlerin, insan özgüllüğü meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes ve Salmonella typhi, bu enfeksiyonların in vivo modellerin kullanımı sınırlıdır. Biz bulaşıcı adımlar özgüllüğü katılan hangi anlamaya başlar Ancak, beşerileştirilmiş modelleri geliştirilmektedir. Burada açıklanan protokol N ile in vivo enfeksiyon geniş sağlayan, farelere insan mikrokapların tanıtımı ile bir örneğidir meningitidis, damar hasarı ve bazen purpura döküntüleri gelişimi ile sonuçlanır.
Bu modeli kullanarak,Biz TFP yapışkan özellikleri bakteri mutantlar kullanılarak ve vasküler hasar yapışma 18 yokluğunda azalır bu in vivo vasküler kolonizasyonu dahil olduğunu tanımlamak mümkün olmuştur. Daha önce, dolaşımdaki bakteriyel ürünler bu zararlardan sorumlu olmuştur ama bizim sonuçlarımız yerel yapışma ve damar kolonizasyon için belirleyici bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bu yeni tedavi hedeflerinin geliştirilmesi için yeni olanaklar açar. Patojenik bakterilerin yapışması farmasötik bloke olabilir eğer muhtemelen dermal lezyonların gelişimini önlemek ve doku nekrozu, debridman ve amputasyon açısından meningokok mağdurları için daha iyi sonuçlara yol açabilir. Bu çalışma ayrıca, enfeksiyonun karmaşıklığı ve bağışıklık yanıtı ve pıhtılaşma kaskadı katılımını göstermiştir. Bu mevcut insan endotel 18 nispeten az miktarda rağmen enfekte edilmiş farelerin serumlarında insan sitokin sinyal tespit edilmiştir.Bu bölgeye fare bağışıklık hücresi popülasyonlarının infiltrasyonu ile birlikte, önemli bir sitokin tepkisi gösterdi.
Hayvan modelleri tabii ki tamamen insan hastalığı çoğaltmak asla ve tüm sonuçları bu düşünce ile ele alınmalıdır onlardan aldı. Örneğin, bu modelde, kan ve dolaşan hücreleri fare kökenlidir ve insan hücrelerine farklı davranabilirler bu indirim olamaz. Bunun bir avantajı, bununla birlikte, yakın yayın 18 de gösterildiği gibi, dolaşan fare hücrelerinkinden insan endotel gelen sinyalleri ayırt menşeli yeteneğidir. Bu modelde kullanılan farelerin immün plan aynı zamanda bir başka "insanlaştırılmasıdır" yönü ekleme, insan immün hücre popülasyonlarının allojenik transferini sağlayacak. Farelerin immün plan ancak tüm eksik ya da, bu modelde, kusurlu NK, T ya da B-hücreleri için bir rol maskeleyebilir. Nispeten shorBu modelde kullanılan t zaman aralığı (24 saat) esas doğuştan yanıtı ilgilidir, ancak uzun vadeli enfeksiyonları ve bağışıklık diğer seçeneklerin geliştirilmesi için keşfedilmeyi gerekebilir.
Cilt N. için önemli bir enfeksiyon sitesi meningitidis değil, insan damar nispeten küçük bir miktarına sahip olan, aynı zamanda çok sayıda organları etkileyen sistemik bir enfeksiyon için veri ekstrapolasyon zor olduğu anlamına gelir. Bu modeli dermal lezyon geliştirme çalışması için izin verir iken, bu gibi epitelyal ve kan-beyin çaprazlama olarak menengokok enfeksiyonu önemli adımlar dahil değildir. Bu insanlaştırılmış modellerin geliştirilmesi ile enfeksiyon bu yönlerini ele için gereklidir. Ancak bu model çok sayıda insan özel patojenlere, kan damarlarını hedefleyen özellikle olanlar için büyük bir potansiyel sunuyor.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Yazarlar yazının eleştirel okuma için Dumenil laboratuara tüm üyelerini, özellikle Silke Silva teşekkür etmek istiyorum. Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr David Maladry de cerrahi bölümü. Michael Hivelin ve Dr Patrick Bruneval, HEGP de Patoloji Anabilim Dalı. Elizabeth Huc başkanlığındaki PARCC at hayvan tesis. Bu çalışma aşağıdaki hibe kuruluşları tarafından desteklenen: Marie Curie İEF dostluk yok. 273223 (KM), İNSERM den ATIP-Avenir Grant, CODDIM ekipman hibe (Ile de France Bölge), FRM ekipman hibe, mükemmellik konsorsiyum IBEID Laboratuvarı (fondation la recherche Médicale dökmek), ANR hibesi "(Agence Nationale la Recherche dökmek) Bugs-in-flow ". Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
