Mycket Lösta Intravital Randig-belysning Mikroskopi germinalcenter

Summary

Högupplösande intravital avbildning med förstärkt kontrast upp till 120 ^ m djup i lymfkörtlar från vuxna möss åstadkoms genom att rumsligt modulering av exciteringsmönster av en multi-fokal två-foton-mikroskop. I 100 um djup mätte vi resolutioner av 487 nm (lateral) och 551 nm (axial), på så sätt kringgå spridnings och diffraktion gränser.

Abstract

Övervakning cellulär kommunikation genom intravital djupvävnads flera foton mikroskopi är nyckeln för att förstå vad som händer med immunceller inom tjocka vävnadsprover och organ i hälsa och sjukdom. Genom att styra scanning mönster i flera foton mikroskopi och tillämpa lämpliga numeriska algoritmer, utvecklade vi en randig-belysning metod, som gjorde det möjligt för oss att uppnå 3-faldigt bättre axiell upplösning och förbättrad signal-till-brus-förhållande, dvs kontrast, i mer än 100 nm vävnadsdjup inom mycket spridande vävnad av lymfoida organ jämfört med standard multi-foton mikroskopi. Förvärvs hastighet samt fotobleknings och fotoskador effekter liknade standard fotomultiplikatorn-baserad teknik, medan bilddjupet var något lägre på grund av användningen av fältdetektorer. Genom att använda den randiga-belysning strategi, har vi möjlighet att observera dynamiken i immunkomplex avlagringar på sekundära follikulära dendritiska celler ̵1; om nivån på några proteinmolekyler i germinalcentra.

Introduction

Två-foton laserskanning mikroskopi (TPLSM), med dess fördelar för djupvävnads avbildning samband med infraröd ultrakorta pulsad excitation ^1, har revolutionerat vår syn på viktiga processer på ett enda cellnivå genom att avslöja motilitet och interaktionsmönster av olika cellgrupper i levande djur ^2-5. Dock är dagens teknik fortfarande otillräcklig för att klarlägga mekanismerna för organfunktion och dysfunktion som en förutsättning för utveckling av nya terapeutiska strategier, eftersom det gör bara glesa information om den molekylära grunden för cellulära svar inom vävnader i hälsa och sjukdom. Dagens teknik gör det möjligt för bara en rumslig fönster av några hundra mikrometer på grund av spridning och vågfrontskorrektion förvrängningseffekter på rumslig upplösning och signal-till-brus-förhållande ^6, vilket är särskilt tydligt i den mycket kompakt vävnad av vuxna djur. Dessa spridnings och vågfrontskorrektion distorsionseffekter beror på en mycket heterogen end anisotrop fördelning av brytningsindex i vävnad, vilket i ett första steg till ett djup beroende försämring av 3D spatial upplösning och slutligen till total förlust av signal som kommer från ballistiska excitation fotoner, det vill säga förlust av signal-till-brus-förhållande. När det gäller biovetenskaplig och biomedicinska djupvävnads applikationer, innebär detta att den nuvarande tekniken är inte entydigt avslöja cellulär kommunikation eftersom dålig upplösning skulle leda till falskt positiva interaktioner medan minskningen av signal-till-brus-förhållande skulle få systemet att förbise vissa interaktioner mellan dim strukturer.

För att otvetydigt identifiera cellulära interaktioner på ett dynamiskt sätt, behövs en mycket förbättrad rumslig upplösning djupt inom vävnaden. De för närvarande infört kraftfulla nanoskopi tekniker som bygger på speciella numeriska algoritmer, t.ex. struktur-belysning metoder, om utarmningen av den första exciterade tillståndet, t.ex. t.ex. dSTORM, PALM, har funnit många tillämpningar i fasta celler och i levande cellkulturer ^7. Men för att förlänga dessa program för att vävnadssnitt, levande vävnad och organismer som vi fortfarande måste övervinna allvarliga tekniska svårigheter. Tvåfotonexcitering sted med olika våglängder samt med en enda våglängd (sw2PE-STED) för excitation och stimulerad emission har tillämpats för att förbättra laterala upplösningen i hjärnskivor ⁸ eller i artificiella matriser med inbäddade celler ^9, respektive, vid samma axial upplösning som standard TPLSM. Användning av en-foton-STED kan dynamiken i Dendritutskotten skall avbildas på ytan av hjärnbarken (upp till 10 till 15 ^ m djup) i en levande Thy1 EGFP mus med en upplösning på 67 nm ^10. Ett mångsidigt instrument för utvecklingsbiologi ges av multifokal strukturerade-belysning mikroskopi, som ger två gånger förbättrad 2Dupplösning. Emellertid kan denna teknik endast användas i organismer med en låg benägenhet för ljusspridning såsom zebrafiskembryon ^11. Ändå kan ingen av dessa metoder tillämpas i den mycket spridande vävnad av vuxna djur i flera hundra mikrometer, som är viktiga modeller för biomedicinsk och klinisk forskning av sjukdomar med debut efter födseln.

Oberoende av approximation används för att beräkna diffraktionsbegränsad vågfront form, dvs punktspridningsfunktion (PSF) efter fokusering med en lins, är åtminstone tre gånger större än bredden på PSF längs den optiska axeln (axiell upplösning) PSF-bredd som är vinkelrät mot den optiska axeln (lateral upplösning) ^12. Vågfrontskorrektion snedvridning av olika ordning kvantifierade av Zernikes koefficienter avsevärt modifiera vågfronten form av fokuserad elektromagnetisk våg i djup-vävnad avbildning som leder till mycket större vävda, särskilt längs den optiskaal axel ^13-15. Därför både de diffraction lagar och vågfronten distorsionseffekter pekar på upplösning längs den optiska axeln som den begränsande faktorn i djupt vävnad avbildning. Endast behövs av följande skäl nanoskopi tekniker inriktade på att motverka gränserna för diffraktion en teknik, som förbättrar axiell upplösning och kontrast genom att motverka både diffraktion och vågfronten distorsionseffekter för högupplösta intravital avbildning. Helst bör denna teknik också vara tillräckligt snabb för att möjliggöra övervakning av cellulära dynamik.

Realtids korrigering av PSF aberrationer och kontrastförlust med hjälp av adaptiv optik i TPLSM har studerats och förbättrats under det senaste decenniet ^13,14,16-18 och det är därför det bästa tillgängliga valet leder till en bättre hantering av ballistiska excitation Fotoner ^14. Ändå, på grund av det faktum att de flesta vågfront korrigering tillvägagångssätt som används i adaptiv optik är iterativ, och att de HAve upprepas för små ytor (några få 10 x 10 ^ m ²⁾ på grund av den höga heterogeniteten av brytningsindex i vävnaden, är förvärvet hastighet betydligt lägre än vad som krävs för avbildning cellmotilitet och kommunikation. Dessutom förbättras den fysiska begränsningen i adaptiva optik TPLSM fortfarande bestämmas genom diffraktion.

Spatial modulering av belysnings (SPIN) och tidsmässiga modulering på detektion sidan (SPADE) har teoretiskt förslag som skall tillämpas på laser-scanning mikroskopi för att förbättra upplösningen. Deras praktiska tillämpningen i intravital avbildning är ännu inte påvisas ^19.

Sammantaget finns det en stor efterfrågan på att utveckla teknik som förbättrar upplösningen för djupvävnads avbildning i levande vuxna djur. I detta arbete får vi rumsliga modulering av exciteringsmönstret genom att styra skanningsprocessen i flerstråle randig-belysning med flera foton laser skonservering mikroskopi (MB-SI-MPLSM) ^20. I motsats till strukturerade belysning tillvägagångssätt, i vilket exciteringsstrålen tvärsnitt spatialt module använder vi enbart skanningsprocessen för att uppnå den rymdmodulering av exciteringen. Genom att expandera den excitation till en längre våglängd, har vi möjlighet att förbättra både rumslig upplösning och signal-till-brusförhållandet i djupvävnaden hos mycket spridande vävnad (t.ex. lymfkörtel fritt spridningsvägen 47 um ^6), oberoende av den optiska icke-linjär signal som vi upptäcker, t.ex. fluorescens, andra harmoniska generationen eller annan frekvens blandningsfenomen. Med hjälp av denna strategi på excitationsvåglängder upp till 900 nm kan vi dynamiskt bild cellulär proteinstrukturer på skalan av några molekyler i germinalcenter av mus lymfkörtlar. Därmed kan vi bättre visualisera samspelet mellan antigen bär heter på ytan av follikulära dendritiska celler och B-celler i processen att sondera antigen under immunsvaret i sekundära lymfoida organ.

Protocol

Multi-beam Setup för Randig-belysning TPLSM

Installationen som används här är ett specialiserat flerstrålande två-foton-laserscanningsmikroskop, såsom beskrivits tidigare ^6,20. Systemet som visas i fig 1. Kan appliceras Ansatsen till andra två-foton-laserscannande mikroskop, som är i stånd att synkronisera kamera förvärv med rörelsen av de galvoscanner speglar, även om de endast är i stånd att utföra en-stråle skanning . I detta fall kommer den nackdelen att vara en lägre upptagningshastighet emellertid likartad till förvärvet hastighet i standard PMT baserade TPLSM. För att uppnå optimal kvalitet mån upplösning och kontrast är berörda, till lägsta fotoblekning och fotoskador och snabbaste förvärv, är det rekommendabelt att överväga följande justerings steg i installationen:

1. Kontrollera lasereffekten av Tisa laser: kolla på 100%, jämför med fabriksvärden och previovi äger avläsningar och använda det som det är om en excitationsvåglängd i intervallet 700-1,000 nm är nödvändig.
2. Testa fjärrkontrollen indikation för Ti: Sa stråldelare, dvs kolla 0% och 100% inställningar. Om det återstående Tisa balk på 100%, kolla då och återställ stegmotorn nolläge. Ti: Sa stråldelare består av en låg ordning λ / 2 platta och en polarisator, som delar upp de vinkelrätt polariserade laserstrålar på vinkelräta strålbanorna: en är riktad in i mikroskop för excitation, den andra används för att pumpa den optiska parametriska oscillator (OPO). Genom att automatiskt rotera λ / 2 tallrik, en kontinuerlig anpassning av Ti: Sa och OPO makt, respektive, uppnås.
3. Justera OPO till den önskade våglängden och mäta uteffekten. Om strömmen är för låg (med en 4 W Ti: Sa laser vid 800 nm, man borde kunna få 0,8-1 V om OPO balk på runt 1,050-1,100 nm) optimera pump våglängd och kontrollera inställningarna för ee spegel och fläktade kristall. Välj deras rekommenderade optimala värden, ofta finns som tabeller eller diagram, och sedan finjustera dem tills OPO resonans vid den önskade våglängden utgång och effekthöjningar.
   1. Om strömmen är fortfarande låg, justera de två tillgängliga speglar av den OPO med de fyra tillgängliga spegeljuste rattar. Gör detta steg mycket långsamt och i mycket små rörelser, växlande mellan de främre-och slut speglar.
4. Kontrollera att Ti: Sa och / eller OPO strålar träffade inträdes speglarna på rätt, centralt läge.
   1. Använd en bit vitt papper (inte mycket blanka eller reflektera!) Och en infraröd visningsprogram för att observera OPO trålen och den högre våglängd Ti: Sa balkar.
      1. Använd skyddsglasögon vid arbete med NIR Ti: Sa balkar (oftast upp till 720-750 nm är synlig för en vanlig människa).
   2. Ställ in lasereffekten (er) så låg som möjligt för inriktningsförfarandet för att minimize eventuella ögonskador.
   3. Håll alltid rummets omgivningsljus på, så att ögats pupill är trängd.
   4. Tänk på att lasereffekten är fin-styrd av dämpare som består av en λ / 2 tallrik och polarisatorer, som inte är i kraft ännu då Ti: Sa strålen går in i skanningshuvud!
5. Kontrollera att ingångspunkten membranet träffas i mitten av Ti: Sa och / eller OPO balk; Om inte, justera de sista två speglar innan laserstrålen kommer in i skanningshuvudet.
   1. Använd IR betraktaren och en liten bit vitt papper (men inte blanka / reflekterande!).
   2. Stäng alltid membranet vid inträde i mikroskop, så att laserstrålen läget kan bedömas mer exakt. Viktigt: Glöm inte att öppna membranet innan du går vidare till steg 6!
6. Justera den reflekterade laserstrålen ljusbanan in i mikroskop i enlighet därmed. Gör detta på små segment och utför iterativ balk-walking.
   1. Kontrollera hela ljusvägen om ljusflödet från objektivet är inte tillräcklig.
   2. Kontrollera alltid lätta vägen när du använder systemet för första gången efter en lång viloperiod, en större reparation, ersättande av optiska element, eller om problem misstänks existera med utgången.
7. Se till att alla aktiva optiska ytor är rena, framför allt att de är fria från damm! Om ytorna är täckta med ett lager av damm, är vågfronten störas även innan den kommer in i objektivet och den resulterande laserstrålen kommer aldrig att leverera en skarp bild av provet!
   1. Rengör vid behov speglarna med en vikt bit linspapper, fuktad med etanol eller isopropanol.
8. Kontrollera att balken kommer tillbaka till spegeln som ligger direkt ovanför posten spegel i slutet av prismat baserade pulskompressor, efter att ljusstrålen är inställd. Härifrån är den stråle som reflekteras into balken multiplexor (BM).
9. Kontrollera om laserstrålen träffar membranet som är belägen vid ingången av balken multiplexer, direkt före λ / 2 platta, ändra polarisationen hos laserstrålen för att passa kraven för en bred-band 50% transmission och 50% reflektion inom BM.
   1. Först stänger membranet så att balken positionen kan bedömas mer exakt och utför balk promenader mellan de två membranen, alltså det vid inträde i mikroskop och den andra på BM posten. För andra singel-beam scanning mikroskop membranet ska placeras vid inträde i xy-scanner.
   2. Om strålen inte träffar mitt i den nedlagda bländare, justera ovan nämnda spegel, placerad direkt före inresan membran BM. Viktigt: Glöm inte att öppna membranet innan du går vidare till steg 10.
10. Med membranet öppnas igen, kontrollera att laserstrålen träffar BM speglar ideras mitt-punkt. Använd en smal pappersremsa för att inte blockera en annan del av BM: s komplexa ljusvägar!
11. Kontrollera att strålen träffar mitt i utgångs speglar: topp spegel för parallell polarisering "P", botten spegel för vinkelrät polarisering "S". Om inte, justera posten spegeln innan BM.
12. Kontrollera om "S" och "P" polariserad stråle låter grupper in i polarise kuben och överlappar varandra på lämpligt sätt vid inträde i xy-scanner. Hoppa så här i fall en enkelstrålesvepmikroskop används.
13. Kontrollera om laserljuset passerar centralt genomsökningen och röret linser och går igenom mitten av målet objektivets bakre fokalplan. Viktigt: Detta steg måste göras med laserstrålen i mittläge, inte i ett parkeringsläge!
    1. Byt objektiv med ett syfte verktyg ("prick") och kontrollera att laserstrålen träffar målet i mitten, och ombelysning är ännu.
    2. Om detta verkar vara fallet, stänga bländaren innan BM och kontrollera om ett cirkulärt interferensmönster visas med en svart cirkel i mitten (störnings minimum).
       1. Justera ingångsspegeln om det finns en betydande förskjutning i förhållande till centrum av måltavlan.
14. Nu ersätter prick med en objektiv, t.ex. med en 20X vatten nedsänkning lins.
    1. Kontrollera den utgående ljusfält med ett vitt papper. Detta bör vara ljusa, enhetliga och centralt placerad.
    2. Mät uteffekt: 100% OPO med 100% pumpa Ti: Sa (4 W), bör man få ca. 100-150 mW efter linsen vid 1100 nm (i mikroskop som används här). Lägre lasereffekter kommer inte att räcka för att utföra multi-beam SI-TPLSM. För singel-beam scanning SI-TPLSM, 5-10 mW är tillräckliga. Laserstrålen måste vara kvar i mittläget utan att vara scanned!
15. Om du utför MB-SI-TPLSM, rikta speglarna på BM enligt följande:
    1. Placera ett homogent fluorescerande prov, t.ex. en röd fluorescens bild, på scenen och fokusera laserstrålen i urvalet, men nära den övre ytan (dvs nära målet objektivets framsida).
    2. Ställ mikroskopet till multi-beam läge och markera antalet strålar, i början, företrädesvis endast en stråle, och polariseringen, t.ex. "P".
       1. Hitta laserstrålen genom att avbilda den fluorescerande slide: Ställ in "P" slutaren öppen och köra CCD-kameran kontinuerligt samtidigt fokusera strålen.
       2. Se till att balken är i mittläget, och att skannern är avstängd. Se till att strålen inte scannas!
       3. Hitta strålen genom att leta efter en ljuspunkt nära centrum av kamerachip.
       4. Fokusera strålen tills fläcken är den ljusaste och kraftigaste, dvs bildplanmikroskopet motsvarar läget hos kamerachip; minska lasereffekten så att fläcken inte är mättad. Med en väl anpassad systemet innebär det att lasereffekten måste vara nära minimum vid arbete i en-strålläge (ca 0,6 mW laser makt bör fungera).
       5. Om fläcken är betydligt utanför centrum, flytta den närmare centrum genom att justera spegeln framför BM (eller på skannern för singel-beam scanning).
       6. När även rikta den andra polarisation, dvs "S" stråle, nu växla till 2-strålläge, öppna "S" slutare och kolla läget för strålen (endast en stråle kan ses om bara "S" slutaren är öppen ).
       7. När du är klar, växla till 4-beam-läge och använda "P" polarisering läget ("P" slutaren öppen). Nu två beamlets visas.
       8. Ordna de två beamlets vara perfekt parallell till den nedre kanten av kamerans uppfattning, och ställa dem till 2,8 ìm isär.
          Om de inte är ordentligt justerade, justerar den första spegeln av BM.
          1. Rikta aldrig skruven i mitten, i stället använder de två perifera skruvarna för att flytta spegeln tills de två strålarna är 2,8 um från varandra och helt horisontellt ordnade.
       9. Byt nu till 8-beam-läget i "P" polarisering, och justera den andra BM spegeln (även utan den röda pricken) tills de 4 beamlets är samma avstånd på 2,8 um, och arrangeras parallellt med den nedre kanten av bilden.
       10. Upprepa i 16 - och 32-beam läge, justera den 3: e och 4: e BS speglar, respektive. Det är viktigt för beamlets att vara lika långt, eftersom SI-algoritmer, det enklaste är den min-max (HiLo) algoritm, bygger på detta antagande.
16. Byt ut jämnt fluorescerande provet med ett heterogent strukturerad en, t.ex. kors färgade Convallaria rötter.
    1. Gå till parkeringsläget av exciteringsstråle, which vanligen placerad vid stora värden på skanner koordinater, t.ex. (10000, 10000).
    2. Skanna en (multi-beam) bild med CCD-kameran. Kontrollera att bilden är skarp, jämn och rak.
    3. Justera kameran Om bilden roteras: vrida kamerahuset axiellt runt den vertikala axeln för hand (var försiktig!) Tills bilden rätas.
17. Börja xy-scanner för att styra skanningsprocessen för att alstra exciteringsmönstret, dvs randig bild.
    1. Vid flerstråleskanning, flytta y-scanner spegel, dvs. vinkelrät mot beamlet linje, på ett sådant sätt för att generera en kvadratisk randig bild.
    2. Om synfältet genereras såsom beskrivs i steg 17.1. är för liten, förlänga avsökningsrutinen genom att flytta X-scannerspegel till ett läge som säkerställer att det balk let linje är dubbelt och de beamlets är ekvidistanta längs hela linjen. Upprepa den exakta rörelsenpå y-scanner spegeln efter x-scanner spegel förflyttas för att alstra större randig bild.
    3. I fallet med singel-beam scanning, alternera y-scanner spegel rörelse med x-scanner spegel rörelse upprepade gånger med ekvidistanta positioner - definieras av forskare - för att generera önskad randiga bilden.
    4. Se till att använda för rörelse y-scanner spegel ett kommando för konstant hastighet (reducerad acceleration / retardation) och för x-scanner spegel en i högsta hastighet (maximal acceleration / retardation).
18. Automatiskt förvärva och spara den randiga bild med kameran (fält-detektor). Därför synkronisera kameran med skannern och använda skannern som master trigger.
19. Upprepa skaffa randiga bilder (skanning protokoll som beskrivs i protokoll nr 17) genom att flytta x-scanner spegel i olika lägen enligt följande:
    1. Välj tillräckligt upprepning steg och lämplig steglängd mellantvå efterföljande randiga bilder för att täcka avståndet mellan två på varandra följande beamlets (i detta fall 2,8 m och ett steg av skanner speglar utgör 25 nm); kan det vara lämpligt att låta en liten överlappning, dvs ytterligare 0,3-0,4 um.
    2. Ställ in x-skift till ett värde som motsvarar den gräns sidoupplösning vid den givna våglängden. Som ett exempel, med hjälp av 10 steg i x-scanner spegel per skift och 12 eller 13 förskjutningar leder till bäst både axiella och laterala resultat upplösning i detta system. Kontrollera med en strukturerad bild, t.ex. Convallaria rötter slide, vilka nummer som fungerar bäst i det system som används.
    3. Optimera dessa två värden tills Convallaria bilden blir den skarp: använda linjen profilen verktyget på de beräknade SI-bilder och jämföra bredden av linjeprofiler (som är den fluorescenssignal från Convallaria cellväggar).
    4. Förvärva varje randig bild synkroniseras med skannern rörelsen och spara den för sig, t.ex.
20. Öppna en komplett uppsättning av randiga bilder som matriser, dvs 3D-matris, i utvärderingen rutin och använda antingen min-max algoritm eller en Fourier-transform algoritm för att generera en 2D matris av den högupplösta SI-image. Algoritmerna har tidigare beskrivits i detalj ^20.

Möss Immunization och Förberedelse för Intravital Imaging

De djurförsök godkändes av lämpliga statliga kommittéer för djurskydd (LAGeSo, Lande für Gesundheit und Soziales, Berlin) och har utförts i enlighet med gällande riktlinjer och föreskrifter (djurförsök licens G0153/08).

21. Induktionen av en germinal center svar i popliteal lymfkörtel och beredning av avbildningsområdet utfördes såsom beskrivits tidigare ^4. Rena B-celler immunomagnetically från mjälte av B1-8 ^{+ / +} Jk ^{- / -}och B-celler av B1-8 ^{+ / +} Jk ^{- / -} GFP ⁺ möss.
22. Injicera intravenöst 3 x 10 ⁶ NP-specifika B-celler med en renhet av> 95% med användning av ⅛ B1-8 ^{+ / +} Jk ^{- / -} GFP ⁺ och ⅞ icke-fluorescerande B1-8 ^{+ / +} Jk ^{- / -} i C57BL / 6 mottagare .
23. En dag efter cellöverföringen immunisera mottagarna med 10 ug av NP-CGG (nitrofenyl-kyckling ɣ globulin) emulgerat i fullständigt Freunds adjuvans (CFA) i höger baktass mat pad.
24. Tillverkare Fab-fragment av anti-CD21/CD35 antikroppar med ATTO590-succinimidyl-ester.
    1. För att markera det nätverk av follikulära dendritiska celler (FDC) i den stilbildande centrum in vivo, injicera 10 mikrogram av fluorokrommärkta Fab-fragment i den högra bakre trampdynan av mössen 12-24 timmar innan intravital analys utförs.

Följande steg bör vara considerött för beredning av Poplietallymfknutor lymfkörtel för intravital imaging (dag 8-10 efter immunisering):

25. Bedöva musen genom ip injektion av ketamin / xylazin, det belopp beroende på deras vikt.
26. Testa reflexer för att övervaka anestesidjupet över hela avbildningstiden.
27. Raka ben, rygg och höger flank av mus rigorösa och använder hårborttagningskräm för att avlägsna rester av hår helt.
28. Fix rätt trochanter stora: lokalisera beniga chip med fingrarna, sätta ett litet snitt i huden med en sax tills en liten vit triangel-formad ramp visas.
29. Kläm benig chip under denna fascia med spetsiga pincetter i rainer.
30. Fäst ryggraden i ländryggen området med hjälp av tandade pincett.
31. Fix höger bakben på fixeringsutrustning och dra åt skruven.
32. Tape svans för att hålla benet i rätt läge.
33. Vid den kaudala delen av låret, skapa ett snitt i huden, i det område där den framstående popliteal ven enters vävnaden, separera huden från den underliggande vävnaden med trubbig pincett och följ Poplietallymfknutor ven från proximalt distalt.
34. Exponera lymfkörtel med trubbiga pincett, försök att undvika att skära för att skydda de fina lymfkärl (hålla lymfkörtel i PBS under exponera).
35. Skapa en cirkel av vakuum fett runt lymfkörtel, fylla denna pöl med PBS.
36. Sätt täckglas i sin position och placera termometern-sonden (håll temperaturen vid 37 ° C, annars cellhastigheten dramatiskt variera).
37. Längs den övre kanten av locket glida lägga till en cirkel av vakuum fett.
38. Placera värmebatteriet på sin position på vakuum fett, skapa en tätning på ett liknande sätt som tidigare och tillsätt vatten / PBS på glaset täckglas för att doppa målet in.
39. Efter avbildning, är musen förvaras i anestesi, och samtidigt öka doserna av ketamin / xylazin till en dödlig dos, följt av cervikal dislokation.

Representative Results

Rumslig upplösning i lymfkörtlar

Måtten på den effektiva punktspridningsfunktion (EPSF) motsvarar den rumsliga upplösningen i ett mikroskop ^12. Vi mätte denna tre dimensionell funktion genom att förvärva den andra harmoniska generationen signal av kollagenfibrer i lymfkörtlar genom vår MB-SI-TPLSM jämfört med etablerade två-foton-laserskanning mikroskopi tekniker, dvs detekteringsfält TPLSM (med hjälp av CCD-kameror), och punkt upptäckt TPLSM (med hjälp av PMT).

Från dessa mätningar blir det uppenbart att på ytan av provet, både sidled och axiella resolutioner motsvarar de förväntade värden som förutsetts i diffraktionsteori ^20. Men med ökande bilddjupet och därmed med ökande optiska vägen för både excitation och emission strålning genom media med mycket varierande brytningsindex, försämras den rumsliga upplösningen avsevärt, oberoenderoende av den sysselsatta setup (Figur 2). Genom MB-SI-TPLSM nådde vi, oberoende av bilddjupet, en ca. 20% bättre lateral upplösning och en 220% bättre axiell upplösning jämfört med standard TPLSM metoder.

Dynamik av immunkomplex på follikulära dendritiska celler i germinalcentra

Den klonurvalet av B-celler under immunsvaret, i sekundära lymfoida organ från vuxna möss är det första steget på väg att differentiera till minnes B-celler eller plasmaceller ^4. I denna process är det mycket dynamiska samspelet mellan follikulära dendritiska celler (FDC) och B-celler i nivå med immun komplexa strukturer (kluster av några proteinmolekyler) inom germinalcenter tros spela en central roll. Endast genom att använda en mycket lösa intravital mikroskopi teknik är det möjligt att dissekera denna cellulär kommunikation och dess konsekvenser för immunsvaret. Vår inställning av MB-SI-TPLSM ger för första gången möjlighet att intravitally visualisera och kvantifiera måtten på de kluster av immunkomplex insättningar som märkt av anti-CD21/35-Fab-ATTO590 på follikulära dendritiska celler, i upp till 120 um djup i groddcentra av popliteala lymfkörtlarna (figurerna 3a och 3b). Även om sådana strukturer inte syns med standard TPLSM metoder, kan vi identifiera dem individuellt och även visualisera deras dynamik med hjälp av vår strategi. Figurer 3e och 3f stödja denna insikt, som visar den direkta jämförelsen mellan 3D fluorescens bild av immunceller insättningar i en stilbildande centrum som förvärvats av konventionell TPLSM (PMT-baserad) och MB-SI-TPLSM. Dessutom kan växelverkan av de immunkomplex inlåning med germinal center B-celler vara mycket löst (figur 3c och 3d, filmer 1 och 2) och kan nu vara jagnvestigated i kombination med intravital funktionella prober för proliferation, differentiering och apoptos. I ett nästa steg kommer vi att använda vår metod för att även undersöka den dynamiska överföring av embryon B-celler med T-hjälparceller, som tros utgöra den andra avgörande fenomen för B-cellsklonurvalet i sekundära lymfoida organ.

.. Figur 1 Princip och installation av multistråle randig-belysning två-photon laserskanning mikroskop Strålen från en avstämbar fs-pulsade Ti: Sa laser (våglängdsområdet 690-1,080 nm, 140 fsec, 80 MHz) dämpas genom en modul tillverkad av ett λ / 2 platta och en tunnfilms-polarisatorn, dess pulser förkomprimeras i ett prisma baserade GVD-kompensationsmodulen och slutligen delas upp i 2, 4, 8, 16, 32, eller 64 balkar,bildande en beamlet linje. Två på varandra följande beamlets inom linjen har vinkelräta polariseringar (märkta rött och grönt i beamlet linjen) och förskjuts i tid för att undvika störningar. Den tidsförskjutningen mellan två på varandra följande beamlets uppgår till 3 ps. För bildtagning är beamlet linjen fokuserade i provet genom ett objektiv (20X vatten nedsänkning objektiv, NA 0,95, WD 2 mm) och vinkelrätt skannas, så att en väldefinierad periodiska mönster genereras. Detta mönster är översatt längs beamlet linjen. Den serie bilder som genereras på detta sätt upptäcks genom interferensfilter monterade på en filterhjul med en EM-CCD-kamera och slutligen utvärderas av ett minimum-maximum algoritm. Single-balk TPLSM baserad på PMT-detektering utfördes med samma mikroskop. I det här fallet använde vi bara en laserstråle för att skanna provet, och vi spektralt löst fluorescenssignalen med motsvarande dikroiska speglar och interferensfilter innan upptäckaning det med fotomultiplikatorrör. Alternativt, i stället för Ti:. Sa laserstråle, strålen av en optisk parametrisk oscillator kan kopplas till mikroskop för att utföra långa våglängd MB-SI-TPLSM Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Rumslig upplösning på multistråle randig-belysning TPLSM jämfört med standard PMT-baserade och multifokal CCD-baserad TPLSM. (A) Representativa axiella profiler samt xy och xz projektioner av SHG i kollagenfibrer i 100 ìm djup inom lymfa nod. lexc = 900 nm, detektionsvåglängder spänner 447 ± 30 nm, fotonflöde Φ = 4,75 x 10 2 · sek. (B) Gul-grön fluorescerande kulor inbäddade i agaros som registrerats av MB-SI-TPLSM och konventionell TPLSM (SB-PMT). λ _{ex moms} = 850 nm, upptäckt våglängder varierar 525 ± 25 nm, fotonflöde Φ = 2,08 x 10 ²⁹ foton / cm ² · s, maskenhet = 3,7 um. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Intravital avbildning av groddcentra från MB-SI-TPLSM (a) 3D-fluorescensbild av den lätta zonen i en germinal center märkt genom CD21/35-Fab-ATTO590 (röd) i en mus immuniseras med hapten -.. Kyckling γ -globulin (NP-CGG) efter adoptiv överföring av B1-8 EGFP ⁺ B-celler (gröna). De immunkomplex inlåning (CD21/35 märkning) på follikulära dendritiska celler (FDC) kan visualiseras för sig, som observerats i (b) av bilden zoom-in (a), och har (både sido-och axiella) dimensioner i intervallet 400-800 nm i upp till 120 um djup. Germinal center B-celler i det immuniserade B1-8 EGFP ⁺ mus detekteras (c), medan kontakterna (d) delvis är ansvariga för mognad av immunsvaret kan nu även visualiseras. λ _{ex moms} = 850 nm, detektionsvåglängder sträcker 605 ± 20 nm (ATTO590) och 525 ± 25 nm (EGFP), fotonflöde Φ = 7,05 x 10 ²⁸ foton / cm ² · sek. Scale bar (a) 20 ^ m, (b) 10 ^ m, (c) 30 | im, (d) 10 pm. 3D fluorescens bilder av samma område inomljus zon av en germinal center märkt av CD21/35-Fab-ATTO590 som registrerats av MB-SI-TPLSM (e) och konventionella (PMT-baserad) TPLSM (f), respektive. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Filmtexter

Film-1 och -2

Dynamik av immunkomplex avlagringar på sekundära follikulära dendritiska celler (FDC) och deras interaktion med germinal center B-celler som registrerats av MB-SI-TPLSM. Immunkomplexet depositioner märkt genom CD21/35-Fab-ATTO590 (röd) medan germinal center B-celler är B1-8 Jk ^{- / -} EGFP ^+-cellerna (grönt).

Discussion

Syftet med intravital optisk avbildning är att dynamiskt och funktionellt visualisera cellulära motilitet och interaktion för att förstå vävnader och organ fungerar vid hälsa och sjukdom ^5. Den mest kraftfulla teknik för att uppnå detta, flera foton laserskanning mikroskopi, fortfarande har att övervinna begränsningar i samband med våg fram snedvridningar, spridning, långsam förvärv, fotoblekning och fotoskador, som begränsar dess rumslig upplösning, kontrast samt dess tidsupplösning .

Det finns två lyckade lösningar för att uppnå en bättre excitation (och utsläpp) fotonhantering i djup-vävnad som leder till bättre rumsliga resolutioner, ökad kontrast (ökad signal-till-brus-förhållande, på grund av ökad signal) och därmed minskad fotoblekning och fotoskador : de adaptiva-optik metoder och användning av längre excitationsvåglängder - avstämbara infraröd excitation ^6. Under det senaste decenniet har begreppet vågfronten motsvaInsatser av adaptiv optik har överförts från astronomi till bio-optisk avbildning och även till flera foton mikroskopi. Medan den första adaptiva optiken metoder för två foton mikroskopi förlitat sig på vågfronten avkänning och behövde en subdiffraction referens, det vill säga en "guide stjärna", liknande astronomi, nuvarande system är bättre lämpade för djupvävnads avbildning ^12. Till exempel använder de konsekvens-slussning av excitationsstrålningen för vågfront avkänning ^13,15, eller att de inte använder någon extern vågfront avkänning alls, men utveckla adaptionsalgoritmer bygger antingen på korskorrelation av bilderna efter elev segmente ¹⁷ eller på iterativ stokastiska jakt efter den perfekta parametrar och efterföljande ingrepp med den okorrigerade bilden som erhållits från den föregående iterationen steget - IMPACT ^16, eller de använder fotoakustik för att karakterisera de snedvridningar våg fram och spridnings effekter ^20. Ändå, på grund av en mycket varierande refraktiv index i vävnaden, den lämpliga optiken metoder är ganska långsam, eftersom korrigeringssteg måste upprepas för relativt små områden (ca 10 x 10 ^ m ^{2) 16.} Dessutom kan antingen genom vågfronten eller spridningseffekten korrigering, den maximalt uppnåbara rumsliga upplösningen är fortfarande begränsad genom diffraktion.

Vår inställning kan delvis övervinna bördan av vågfronten aberration och för spridning, men också driver upplösningen bortom diffraktionsgränsen. Att använda objektiv med högre numerisk bländare, kan de absoluta värdena för den axiella upplösningen förbättras till cirka 400 nm ^20. Priset för den förbättrade upplösningen är en brantare sönderfall av signal-till-brus-förhållande i djup-vävnad jämfört med konventionell TPLSM. Detta beror på att det är nödvändigt att använda fältdetektering i MB-SI-TPLSM. Som visas före ^15, är användningen av fältdetektorer i stället för punktdetektorer i samband med denna brantare förfall av SNR due till den starkare spridning av emitterat ljus som är relevant endast för fältdetektering. Således är den maximala bilddjupet för fältdetektering TPLSM metoder ca. 25% reducerad jämfört med konventionell (dvs. punkt upptäckt baserad) TPLSM. En enkel praktisk lösning är att tillämpa längre excitationsvåglängder och för att upptäcka längre emissionsvåglängder. Givetvis förbättrar detta den djupberoende SNR på konvention TPLSM i samma utsträckning som i MB-SI-TPLSM.

När det gäller förvärvshastigheten är berörda, är MB-SI-TPLSM begränsas endast av hastigheten på galvanometrisk scanner och / eller av den läs-ur kameran och vinster av stråldelande till 32 laserstråle låter. Jämfört med standard multi-beam kamerabaserat TPLSM, är MB-SI-TPLSM något långsammare på grund av att det är nödvändigt inte bara att skanna utan även att synkront förvärva vardera ca. 10 randig belysta bilder för att generera den slutliga högupplöst bild. Dock behåller vår teknik en clöra hastighet fördel över konventionella TPLSM (baserat på en bjälke skanning och punkt upptäckt). Därför anskaffningstiden för en 150 x 150 ìm ² (512 x 512 bildpunkter) är 841 msek genom att använda konventionell TPLSM (scannerfrekvens 800 Hz) och 109 ms med hjälp av MB-SI-TPLSM. Därigenom exciteringseffekten per balk och uppehållstiden per bildpunkt, är samma för både konventionella och MB-SI TPLSM, så att signalen är jämförbar för båda inställningar. Som tidigare visats ^20, fotoblekning och fotoskador effekter i MB-SI-TPLSM experiment är låga och jämförbara med väl utförd konventionell TPLSM.

I framtiden skulle det vara önskvärt att kombinera de kompletterande strategier för adaptiv-optik och randiga-belysning i det infraröda området för att ytterligare förbättra intravital TPLSM, liknar resultaten i adaptiv optik för strukturerad-belysning ^21. Men för att uppnå dessa mål, betydligt snabbare adaptiv-optik metodermåste utvecklas.

Den förväntade höga effekten av den randiga-belysning strategi för biovetenskap och biomedicin ligger i dess förmåga att förbättra upplösningen och öka kontrasten i djup vävnad, motverka vågfront distorsion och spridning effekter, men också går utöver diffraktion gränserna i laserskanning mikroskop, genom helt enkelt styra skanningsprocessen och välja ett lämpligt känsliga område detektor.

Den förväntade höga effekten av den randiga-belysning strategi för biovetenskap och biomedicin ligger i dess förmåga att förbättra upplösningen och öka kontrasten i djup vävnad, motverka vågfront distorsion och spridning effekter, men också går utöver diffraktion gränserna i laserskanning mikroskop, genom helt enkelt styra skanningsprocessen och välja ett lämpligt känsliga område detektor.

Den randiga-belysning tillvägagångssätt kan tillämpas för intravital djupvävnads imåldrande i alla två-photon laser scanning mikroskop som klarar att synkronisera kameradetektering med galvoscanner rörelsen i singel-beam scanning. I detta fall är de enskilda ränder inom excitation mönstret genereras senare och inte samtidigt som i MB-SI-TPLSM. Använda enda stråle skanning i SI-TPLSM vi förväntar sig naturligtvis en något långsammare upptagningshastighet av fluorescensbilder som jämfört med konventionell TPLSM (enkelstrålescannings punkt detektor baserade TPLSM) men samma förbättring i rumslig upplösning och kontrast som visats för MB- SI-TPLSM. Den lägre förvärvshastighet tillsammans med begränsningen i bilddjupet minskar avsevärt användningsområdet för singel-beam SI-TPLSM jämfört med MB-SI-TPLSM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin		The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US		Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803
Equipment
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany