Summary
Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.
Abstract
Überwachung zellulären Kommunikation durch Intravital tiefen Gewebe Multi-Photonen-Mikroskopie ist der Schlüssel für das Verständnis, das Schicksal von Immunzellen in dicken Gewebeproben und Organe in Gesundheit und Krankheit. Durch die Steuerung der Scan-Muster in Multi-Photonen-Mikroskopie und Anwendung geeigneter numerischer Algorithmen, eine gestreifte-Beleuchtung Ansatz entwickelten wir, was uns ermöglicht, zu erreichen 3-fach bessere axiale Auflösung und verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis, dh dagegen in mehr als 100 &mgr; m Gewebetiefe in stark streu im Vergleich zu Standard-Multi-Photonen-Mikroskopie Gewebe des lymphatischen Organe. Die Aufnahmegeschwindigkeit sowie Bleichen und Lichtschäden Wirkungen waren ähnlich wie Standard-Photo-Multiplier-basierte Technik, während die Bildtiefe etwas geringer durch den Einsatz von Felddetektoren. Durch die Verwendung der Streifenbeleuchtung Ansatz sind wir in der Lage, die Dynamik der Immunkomplex-Ablagerungen auf sekundären follikulären dendritischen Zellen zu beobachten ̵1; auf dem Niveau von einigen Proteinmoleküle in Keimzentren.
Introduction
Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM), mit seinen Vorteilen für die tiefen Gewebe-Bildgebung mit Infrarotultrakurzpulsanregung ein Zusammenhang hat unsere Sicht auf Lebensprozesse auf Einzelzellebene durch die Enthüllung Motilität und Interaktionsmuster der verschiedenen revolutioniert Zell-Untergruppen in lebenden Tieren 05.02. Allerdings ist aktuelle Technik noch nicht ausreichend, um die Mechanismen der Organfunktion und Dysfunktion als Voraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu klären, da es nur spärliche Informationen über die molekularen Grundlagen der Zellantwort im Gewebe in Gesundheit und Krankheit macht. Die derzeitige Technologie ermöglicht nur eine räumliche Fenster einige hundert Mikrometer aufgrund von Streuung und Wellenfront-Verzerrungseffekte auf die räumliche Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis 6, die in der sehr kompakten Gewebe von erwachsenen Tieren besonders offensichtlich sind. Aufgrund einer sehr heterogenen Diese Streuung und ein Wellenfrontverzerrungseffekte sindd anisotrope Verteilung des Brechungsindex im Gewebe, was in einem ersten Schritt bis zu einer Tiefe abhängige Verschlechterung der 3D-Raumauflösung und schließlich zum völligen Verlust der Signal aus ballistischem Anregungsphotonen, also Verlust des Signal-zu-Rausch-Verhältnis Ursprung. In Bezug auf die biowissenschaftliche und biomedizinische tiefen Gewebe Anwendungen bedeutet dies, dass die aktuelle Technologie ist nicht eindeutig offenbaren zellulären Kommunikation, weil schlechte Auflösung würde zu falsch positiven Wechselwirkungen führen, während die Abnahme des Signal-zu-Rausch-Verhältnis würde dazu führen, das System einige Blick Wechselwirkungen zwischen schwachen Strukturen.
Um die zelluläre Interaktionen eindeutig erkennen dynamische Weise wird eine stark verbesserte räumliche Auflösung tief im Gewebe erforderlich. Die aktuell eingeführte leistungsstarke Nanoskopie Techniken, die auf spezielle numerische Algorithmen, wie zB Struktur-Beleuchtung Ansätze, auf Erschöpfung des ersten angeregten Zustand, z. B. zB dSTORM, PALM, haben viele Anwendungen in fixierten Zellen als auch in Live-Zellkulturen 7 gefunden. Allerdings, um diese Anwendungen zu Gewebeschnitten, lebendes Gewebe und Organismen erweitern wir müssen noch ernsthafte technische Schwierigkeiten zu überwinden. Zwei-Photonen-Anregung mit unterschiedlichen Wellenlängen als auch mit einer einzigen Wellenlänge (sw2PE-STED) zur Anregung STED und stimulierte Emission wurde angewandt, um die laterale Auflösung in Hirnschnitten 8 oder in künstlichen Matrizen verbessern mit eingebetteten Zellen 9, die jeweils an der gleichen axiale Auflösung als Standard TPLSM. Mit einem STED-Photonen, die Dynamik der dendritischen Dornen konnte an der Oberfläche der Hirnrinde (bis zu 10-15 um Tiefe) in einem lebenden Thy1 EGFP-Maus mit einer Auflösung von 67 nm 10 abgebildet werden. Ein vielseitiges Werkzeug für Entwicklungsbiologie wird von der multifokalen strukturierten Beleuchtung Mikroskopie, die zwei-fach verbesserte 2D bereitstelltAuflösung. Allerdings kann diese Technik nur in Organismen mit einer geringen Neigung der Lichtstreuung wie Zebrafischembryonen 11 verwendet werden. Dennoch kann keine dieser Techniken in der hoch-streuendem Gewebe erwachsener Tiere in mehreren hundert Mikrometern, die entscheidend Modelle für die biomedizinische Forschung und klinische Erkrankungen bei Einsetzen nach der Geburt angewendet werden.
Unabhängig von der Näherung verwendet, um den beugungsbegrenzten Wellenfrontform zu berechnen, dh die Punktverteilungsfunktion (PSF), nach der Fokussierung durch eine Linse, mindestens dreimal größer ist als die Breite der PSF entlang der optischen Achse (axialer Auflösung) die PSF Breite senkrecht zu der optischen Achse (laterale Auflösung) 12. Wellenfrontverzerrungen durch verschiedene Aufträge Zernikes Koeffizienten quantifiziert die Wellenfrontform von fokussierten elektromagnetischen Welle in tiefen Gewebe-Bildgebung, die zu viel größeren PSFs, vor allem entlang der optischen erheblich ändernal Achse 13-15. Daher sind sowohl die Beugungs Gesetze und die Wellenfrontverzerrungseffekte verweisen auf die Auflösung entlang der optischen Achse als limitierender Faktor bei tiefen Gewebe-Bildgebung. Während Nanoskopie-Techniken konzentrieren sich auf entgegen die Grenzen der Beugungs nur, eine Technologie, die axiale Auflösung und Kontrast entgegenwirkt sowohl Beugung und Wellenfront-Verzerrungseffekte verbessert wird zur hochauflösenden Intravital Bildgebung notwendig. Idealerweise sollte diese Technik auch schnell genug, um die Überwachung der zellulären Dynamik zu ermöglichen.
Die Echtzeit-Korrektur von Aberrationen und PSF Kontrastverlust mit Hilfe der adaptiven Optik in TPLSM wurde ausgiebig untersucht und in den letzten zehn Jahren 13,14,16-18 verbessert und es ist daher die derzeit besten Wahl, die zu einer besseren Verwaltung der ballistischen Erregungs 14 Photonen. Dennoch, aufgrund der Tatsache, dass die meisten Wellenfrontkorrektur Ansätze in der adaptiven Optik verwendet werden, sind iterative und dass sie have für kleine Flächen (einige 10 x 10 &mgr; m 2) aufgrund der hohen Heterogenität des Brechungsindex in Gewebe wiederholt werden, ist die Erfassungsgeschwindigkeit wesentlich geringer als für die Bildgebung Zellmotilität und Kommunikation erforderlich. Darüber hinaus ist die physikalische Grenze in der adaptiven Optik-TPLSM verbessert wird immer noch von Beugung bestimmt.
Räumliche Modulation der Beleuchtung (SPIN) und zeitliche Modulation auf der Erfassungsseite (SPADE) wurden theoretisch vorgeschlagen, Laser-Scanning-Mikroskopie eingesetzt, um die Auflösung zu verbessern. Ihre praktische Anwendung in der Intravital Bildgebung noch zu 19 nachgewiesen werden.
Zusammengenommen gibt es eine hohe Nachfrage nach der Entwicklung von Technologien, die die Auflösung für die tiefen Gewebe-Bildgebung in lebenden erwachsenen Tieren zu verbessern. In dieser Arbeit erreichen wir räumliche Modulation des Anregungsmusters durch Steuern der Scan-Vorgang in Mehrstrahl-Beleuchtungsstreifen Multi-Photonen-Laser-sKonservenmikroskopie (MB-SI-MPLSM) 20. Im Gegensatz zu strukturierten Beleuchtung Ansätze, in denen die Anregungsstrahlquerschnitt räumlich moduliert ist, verwenden wir nur den Scan-Vorgang, um die räumliche Modulation der Anregung zu erreichen. Mit dem Ausbau der Anregung zu einer längeren Wellenlänge, wir sind in der Lage, sowohl die räumliche Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis im tiefen Gewebe von stark streu Gewebe (z. B. Lymphknoten, frei Streupfad 47 um 6) zu verbessern, unabhängig von der optischen nichtlineare Signal wir erkennen, z. B. Fluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen oder anderen Frequenzmischphänomen. Unter Verwendung dieses Ansatzes bei Anregungswellenlängen bis zu 900 nm sind wir in der Lage, dynamisch Bild zellulären Proteinstrukturen in der Größenordnung von wenigen Molekülen in Keimzentren der Lymphknoten der Maus. So kann man besser die Interaktion zwischen Antigen tragenden Einheiten auf der Oberfläche der follikulären dendritischen Zellen und B-Zellen sichtbar in dem Verfahren zum Testen des Antigen während der Immunantwort in sekundären lymphatischen Organe.
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Protocol
Mehrstrahl-Einrichtung für Striped-Beleuchtung TPLSM
Das hier verwendete Aufbau ist eine Mehrfachstrahl Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskops, wie oben beschrieben 6,20. Das System ist in Fig. 1 dargestellt. Der Ansatz kann auch für andere Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskope, die in der Lage Kameraerfassung mit der Bewegung der galvanometrischen Spiegel synchronisiert sind, auch wenn sie nur in der Lage, Einzelstrahlabtastung durchzuführen sind, angewendet werden, . In diesem Fall wird der Nachteil einer unteren Erfassungsgeschwindigkeit, aber ähnlich wie die Aufnahmegeschwindigkeit in Standard-PMT-basierten TPLSM sein. Um eine optimale Qualität, so weit wie Auflösung und Kontrast angeht zu erreichen, bei der niedrigsten Photobleaching und Lichtschäden und schnellste Erwerb, empfiehlt es sich, die folgenden Bedienschritte des Setup berücksichtigen:
- Überprüfen Sie die Laserleistung der Laser TiSa: Check bei 100%, Vergleichen mit ursprünglichen Werkseinstellungen und previouns besitzen Lesungen und verwenden Sie es, wie es ist, wenn eine Anregungswellenlänge im Bereich von 700-1000 nm notwendig ist.
- Testen Sie die Fernbedienung Indikation für den Ti: Sa-Strahlteiler, dh überprüfen, 0% und 100%-Einstellungen. Wenn es eine Rest TiSa Strahl auf 100%, dann überprüfen Sie und stellen Sie die Schrittmotor-Null-Stellung. Der Ti: Sa Strahlteiler besteht aus einem niedriger Ordnung λ / 2-Platte und einen Polarisator, der die senkrecht polarisierte Laserstrahlen senkrecht Strahlengänge aufteilt: ein in das Mikroskop zur Anregung gerichtet, der andere verwendet wird, um den optischen parametrischen Pumpe Oszillator (OPO). Durch automatisches Drehen der λ / 2-Platte, eine kontinuierliche Einstellung des Ti: Sa und OPO Leistung bzw. erreicht wird.
- Einstellen des OPO zu der gewünschten Wellenlänge zu messen und die Ausgangsleistung. Wenn die Stromversorgung ist zu gering: Optimierung der Pumpwellenlänge und überprüfen Sie die Einstellungen der th (mit 4 W Ti Sa-Laser bei 800 nm, sollte man in der Lage, 0,8 bis 1 W OPO Strahl auf etwa 1,050-1,100 nm zu bekommen)e Spiegel und der aufgefächerten Kristall. Wählen Sie die empfohlenen optimalen Werte, die oft als Diagramme oder Grafiken zur Verfügung, und dann die Feinabstimmung, bis die OPO Resonanz bei der gewünschten Wellenlänge Ausgang und die Leistung steigt.
- Wenn die Stromversorgung immer noch niedrig ist, stellen die beiden zugänglich Spiegel der OPO mit den vier zugänglich Spiegel-Drehknöpfen. Führen Sie diesen Schritt sehr langsam und in sehr kleinen Bewegungen, abwechselnd zwischen den Vorder-und Ende-Spiegel.
- Überprüfen Sie, dass die Ti: Sa und / oder OPO Strahlen treffen auf den Eintrag in der richtigen Spiegel, zentrale Lage.
- Verwenden Sie ein Stück weißes Papier (nicht sehr glänzenden oder reflektierenden!) Und eine Infrarot-Viewer zum Betrachten der OPO Strahl und den höheren Wellenlängen-Ti: Sa Balken.
- Schutzbrille bei der Arbeit mit NIR-Ti: Sa Strahlen (in der Regel bis zu 720 bis 750 nm ist für die durchschnittliche Person sichtbar).
- Set der Laserleistung (en) so niedrig wie möglich für das Ausrichtungsverfahren um minimize potenzielle Augenschäden.
- Halten Sie immer Umgebungslicht des Raumes auf, so dass die Pupille des Auges verengt ist.
- Beachten Sie, dass die Laserleistung ist in Ordnung gesteuert Dämpfungsglieder, bestehend aus einem λ / 2 Platte und Polarisatoren, die in der Tat noch nicht, wenn der Ti: Sa Strahl tritt in den Scan-Kopf!
- Verwenden Sie ein Stück weißes Papier (nicht sehr glänzenden oder reflektierenden!) Und eine Infrarot-Viewer zum Betrachten der OPO Strahl und den höheren Wellenlängen-Ti: Sa Balken.
- Überprüfen Sie, dass der Einstiegspunkt Membran ist in der Mitte durch das Ti-Hit: Sa und / oder OPO Strahl; wenn nicht, stellen Sie die letzten zwei Spiegel, bevor der Laserstrahl in den Scankopf.
- Verwenden Sie die IR-Viewer und ein kleines Stück weiß (aber nicht glänzend / reflektierende!) Papier.
- Immer nahe der Membran am Eintritt in das Mikroskop, so dass die Laserstrahlposition genauer beurteilt werden. Wichtig: Vergessen Sie nicht, die Membran, bevor zu Schritt 6 wieder öffnen!
- Stellen Sie den reflektierten Laserstrahl Lichtpfad in das Mikroskop entsprechend. Tun Sie dies auf kleine Segmente und iterative Strahl-walking.
- Überprüfen Sie die gesamte Lichtpfad, wenn die Lichtausgabe von der Objektivlinse ist nicht ausreichend.
- Überprüfen Sie immer den Lichtpfad, wenn das System zum ersten Mal nach einer langen Ruhezeit, eine größere Reparatur, jeder Ersatz von optischen Elementen, oder wenn Probleme stehen im Verdacht, mit der Ausgabe gibt.
- Stellen Sie sicher, dass alle aktiven optischen Oberflächen sauber sind, vor allem, dass sie frei von Staub sind! Wenn man die Oberflächen mit einer Staubschicht bedeckt ist, wird die Wellenfront, noch bevor in die Objektivlinse verzerrt und die resultierende Laserstrahl wird nie ein scharfes Bild der Probe zu liefern!
- Falls notwendig, reinigen Sie die Spiegel mit einem gefalteten Stück Papier Objektiv, mit Ethanol oder Isopropanol befeuchtet.
- Prüfen Sie, ob der Strahl kommt wieder zum Spiegel, der direkt über dem Eingang Spiegel am Ende des Prismas-basierten Pulskompressor befindet, nachdem der Lichtpfad festgelegt ist. Von hier aus wird der Strahl reflektiert into der Strahlmultiplexer (BM).
- Überprüfen, ob der Laserstrahl auf die Membran, die am Eingang der Strahlmultiplexer befindet, direkt vor der λ / 2-Platte, die Änderung der Polarisation des Laserstrahls, um die Anforderungen an ein Breitband 50% Transmission und 50% Reflexion zu passen innerhalb der BM.
- Schließen Sie zunächst die Membran, so dass die Strahlposition genauer beurteilt werden und führen Strahl Fuß zwischen den beiden Membranen, dh dem bei der Eintragung in das Mikroskop und die andere an der BM-Eintrag. Für andere Single-Beam-Scanning-Mikroskope die Membran sollte bei der Einreise in der xy-Scanner befinden.
- Wenn der Strahl nicht traf die Mitte des stillgelegten Öffnung, passen Sie die oben genannten Spiegel, direkt vor der BM Eintrag Membran platziert. Wichtig: Vergessen Sie nicht, die Membran, bevor zu Schritt 10 wieder zu öffnen.
- Mit Wiedereröffnung der Membran, überprüfen Sie, ob der Laserstrahl auf die BM-Spiegel inihre Mittelpunkt. Verwenden Sie einen schmalen Papierstreifen, um nicht zu einem anderen Teil des BM komplexen Lichtwege zu blockieren!
- Prüfen Sie, ob der Strahl auf die Mitte der Ausfahrt Spiegel: top Spiegel für parallele Polarisation "P", Bodenspiegel für senkrechte Polarisation "S". Wenn nicht, stellen Sie den Eintrag vor dem Spiegel BM.
- Überprüfen Sie, ob das "S" und "P" polarisierten Strahl lässt Gruppen geben Sie die Polarisator-Würfel und überschneiden sich entsprechend bei der Einreise in der xy-Scanner. Überspringen Sie diese Schritte, falls ein Single-Beam-Scanning-Mikroskop verwendet.
- Überprüfen Sie, ob das Laserlicht geht zentral den Scan und die Rohrlinsen und bekommt durch die Mitte der Objektivlinse "hinteren Brennebene. Hinweis: dieser Schritt muß mit dem Laserstrahl in Mittelstellung durchgeführt werden, nicht in einer Parkstellung!
- Ersetzen Sie das Objektiv mit einem Ziel-Werkzeug ("Bullauge") und überprüfen, ob der Laserstrahl auf das Ziel in der Mitte, und ob dieAusleuchtung ist gleichmäßig.
- Wenn dies scheint der Fall zu sein, schließen Sie die Blende vor der BM und prüfen, ob eine kreisförmige Interferenzmuster erscheint, mit einem schwarzen Kreis in der Mitte (Interferenz Minimum).
- Stellen Sie den Eintrag Spiegel, wenn es eine deutliche Verschiebung in Bezug auf die Mitte der ins Schwarze.
- Jetzt ersetzen Sie das Bullauge mit einer Objektivlinse, z. B. mit einem 20-fach Wasserimmersionsobjektiv.
- Überprüfen Sie die Ausgangslichtfeld mit einem Stück weißem Papier. Dies sollte helle, gleichmäßige und zentral positioniert sein.
- Messen Sie die Ausgangsleistung: bei 100% OPO mit 100% Pump Ti: Sa (4 W), sollte man ca. bekommen. 100-150 mW nach der Linse bei 1100 nm (im Mikroskop verwendet). Niederlaserleistungen wird nicht ausreichen für die Durchführung Mehrstrahl-SI-TPLSM. Für Single-Beam-Scanning-SI-TPLSM sind 5-10 mW ausreichend. Der Laserstrahl muss in der Mittelstellung, ohne scanne bleibend!
- Bei Durchführung MB-SI-TPLSM, richten Sie die Spiegel in der BM, wie folgt:
- Legen Sie ein homogen fluoreszierende Probe, z. B. eine rote Fluoreszenz Rutsche, auf der Bühne und fokussieren den Laserstrahl im Inneren der Probe aber in der Nähe der Oberfläche (dh nahe an der Objektivlinse "vorne).
- Stellen Sie das Mikroskop auf die Mehrstrahl-Modus zu wählen und die Anzahl der Strahlen am Anfang, vorzugsweise nur ein Strahl, und die Polarisation, z. B. "P".
- Finden Sie den Laserstrahl durch Abbildung der Leuchtstoffschlitten: stellen Sie die "P"-Verschluss geöffnet und führen Sie die CCD-Kamera kontinuierlich, während die Fokussierung des Strahls.
- Sicherstellen, dass der Strahl in der Mittelposition, und daß der Scanner ausgeschaltet ist. Stellen Sie sicher, dass der Strahl nicht gescannt!
- Finden Sie den Strahl von der Suche nach einem Lichtblick in der Nähe der Mitte der Kamera-Chip.
- Fokus des Strahls, bis der Fleck ist der hellste und schärfste, dh der Bildebenedas Mikroskop entspricht der Position des Kamerachips; Verringerung der Laserleistung, so dass der Spot ist nicht gesättigt. Mit einem gut ausgerichteten System bedeutet dies, dass die Laserleistung muss in der Nähe sein, wenn mindestens die in der Ein-Strahl-Modus (ca. 0,6 mW Laserleistung funktionieren sollte).
- Wenn der Punkt ist deutlich aus der Mitte, bewegen Sie es näher an der Mitte durch Einstellen der Spiegel vor die BM (oder der Scanner für Single-Beam-Scanning).
- Wenn auch andere Ausrichtung der Polarisation, also "S"-Balken, jetzt 2-Strahl-Modus zu wechseln, öffnen Sie die "S"-Verschluss und überprüfen Sie die Position des Trägers (nur ein Strahl gesehen werden kann, wenn nur die "S"-Verschluss geöffnet ).
- Wenn Sie fertig sind, um 4-Strahl-Modus zu wechseln und das "P"-Modus Polarisation ("P" Shutter offen). Nun sind zwei Teilstrahlen erscheint.
- Ordnen Sie die beiden Teilstrahlen perfekt parallel werden, um den unteren Rand der Kamera-Ansicht und setzen Sie sie auf 2,8 um voneinander entfernt sein.
- Wenn sie nicht richtig ausgerichtet ist, stellen die ersten Spiegel des BM.
- Nie richten Sie die Schraube in der Mitte, verwenden Sie stattdessen die beiden peripheren Schrauben, um den Spiegel zu bewegen, bis die beiden Strahlen sind 2,8 ähm auseinander und perfekt horizontal angeordnet.
- Nun zu 8-Strahl-Modus wechseln in "P" Polarisation, und stellen Sie die zweite BM Spiegel (auch ohne roten Punkt), bis die vier Teilstrahlen gleich weit bei 2,8 um, und parallel zur Unterkante des Bildes angeordnet.
- Wiederholen Sie in 16 - und 32-Strahl-Modus, die Anpassung der 3. und 4. BS Spiegel auf. Es ist wichtig, dass die Teilstrahlen äquidistant sein, weil SI-Algorithmen, die einfachste wobei der Min-Max (HiLo-Algorithmus), werden auf dieser Annahme.
- Gehe zu der Parkposition des Anregungsstrahls, werden ist in der Regel bei großen Werten der Scanner Koordinaten, zB (; 10.000 10.000) gegeben.
- Scannen Sie eine (Multi-Strahl) Bild mit der CCD-Kamera. Überprüfen Sie, ob das Bild erscheint scharf, gleichmäßig und gerade.
- Stellen Sie die Kamera, wenn das Bild erscheint gedreht: Drehen Sie das Kameragehäuse axial um die vertikale Achse von Hand (sanft sein!), Bis das Bild begradigt.
- Im Falle der Mehrstrahl-Scanning, bewegen Sie den y-Scannerspiegel, dh. senkrecht zu der Teilstrahl Linie derart, um eine quadratische Bildstreifen erzeugen.
- Wenn das Sichtfeld erzeugt wird, wie in Schritt 17.1 beschrieben. zu klein ist, erstrecken sich die Scan-Routine, indem Sie den x-Scanner-Spiegel auf eine Position um sicherzustellen, dass der Strahl-let Linie verdoppelt wird und die Teilstrahlen gleich weit auf der ganzen Linie. Wiederholen Sie die exakte Bewegungder y-Scannerspiegel nach der x-Scannerspiegel bewegt wird, um das größere Bild gestreiften erzeugen.
- Im Fall von Single-Beam-Scanning, wechseln die y-Scanner-Spiegelbewegung mit x-Scannerspiegel Bewegung immer wieder in gleichen Positionen - vom Wissenschaftler definiert - um das gewünschte Bild zu erzeugen gestreift.
- Achten Sie darauf, für die Bewegung der y-Scanner-Spiegel ein Befehl zum konstanter Geschwindigkeit (reduzierte Beschleunigung / Verzögerung) und für die x-Scanner-Spiegel ein bei maximaler Geschwindigkeit (maximale Beschleunigung / Verzögerung) zu verwenden.
- Wählen Sie genug Wiederholung Schritte und die entsprechende Schrittlänge zwischenzwei Folge gestreiften Bilder, um den Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Teilstrahlen (in diesem Fall 2,8 um und einen Schritt der Scannerspiegel gleich 25 nm) abdecken; kann es ratsam sein, ein wenig überlappen zu lassen, dh eine zusätzliche 0,3 bis 0,4 um.
- Stellen Sie die x-Verschiebung zu einem Wert, der die laterale Auflösungsgrenze bei der vorgegebenen Wellenlänge entspricht. Als ein Beispiel unter Verwendung von 10 Schritten der x-Scannerspiegel pro Schicht und 12 oder 13 Schichten führen zu besten sowohl axialer und lateraler Auflösung führt in diesem System. Prüfen Sie mit einer strukturierten Folie, z. B. Convallaria Wurzeln Rutsche, die Zahlen funktionieren am besten im System verwendet werden.
- Optimieren Sie diese beiden Werte, bis der Convallaria Bild wird das schärfste: Linie Profilwerkzeug auf den berechneten SI Bilder und vergleichen Sie die Breite der Linienprofile (die das Fluoreszenzsignal von Convallaria Zellwände).
- Erwerben Sie jedes Bild mit dem gestreiften Scannerbewegung synchronisiert und separat speichern, z. B.
Mäuse Immunisierung und Vorbereitung für die Intravital Imaging
Die Tierversuche wurden von den zuständigen staatlichen Komitees für den Tierschutz (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) zugelassen und wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften (Tierversuch Lizenz G0153/08) durchgeführt.
- Die Induktion einer Antwort Keimzentrum in der Popliteallymphknoten und Vorbereitung des Abbildungsfeldes 4 wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Reinige B-Zellen aus der Milz immunomagnetisch von B1-8 + / + J &kgr; - / -und B-Zellen von B1-8 + / + J &kgr; - / - GFP +-Mäusen.
- Injizieren intravenös 3 x 10 6 NP-spezifische B-Zellen mit einer Reinheit von> 95% unter Verwendung von ⅛ B1-8 + / + J &kgr; - / - GFP + und ⅞ nichtfluoreszierenden B1-8 + / + J &kgr; - / - in C57BL / 6 Empfänger .
- Einen Tag nach der Zellübertragung immunisieren die Empfänger mit 10 ug NP-CGG (Nitrophenyl-Huhn ɣ Globulin) in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) in die rechte Hinter Essen Pad emulgiert.
- Etikett Fab-Fragmente von Antikörpern, die mit anti-CD21/CD35 ATTO590-Succinimidylester.
- Um das Netzwerk von follikulären dendritischen Zellen (FDC) innerhalb der Keimzentren in vivo zu markieren, zu injizieren 10 ug Fluorochrom-markierten Fab-Fragmente in die rechte Hinterpfote der Mäuse 12-24 h vor Intravital Analyse durchgeführt.
Die folgenden Schritte sollten conside seinrot für die Herstellung der Popliteallymphknoten zur intravitalen Imaging (8-10 Tage nach der Immunisierung):
- Maus anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin, die Menge in Abhängigkeit von ihrem Gewicht.
- Testen Reflexe, um die Narkosetiefe über die gesamte Bild Zeitraum zu überwachen.
- Rasur Bein, Rücken und rechten Flanke der Maus strenge und Haarentfernungscreme verwenden, um das restliche Haar vollständig zu entfernen.
- Fix rechten Trochanter major: locate knöchernen Chip mit Finger, legen Sie einen kleinen Hautschnitt mit der Schere bis eine kleine weiße Dreieck-förmige Blende angezeigt.
- Klemmen Sie knöchernen Chip unter dieser Faszie mit spitzen Pinzette der Verzögerer.
- Fix die Wirbelsäule in Lendenbereich mit gezahnten Pinzette.
- Fix rechten Hinterbein auf Rainer und die Schraube anziehen.
- Tape-Schwanz, das Bein in der richtigen Position zu halten.
- Am kaudalen Seite des Oberschenkels, erstellen Sie einen Schnitt in der Haut, in den Bereich, wo der prominente V. poplitea enters das Gewebe, trennen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebe mit stumpfen Pinzette und folgen der V. poplitea von proximal nach distal.
- Setzen Sie die Lymphknoten mit stumpfen Pinzette, versuchen zu vermeiden, schneiden, um die feinen Lymphgefäße schützen (halten die Lymphknoten in PBS während der Belichtung).
- Erstellen Sie einen Kreis von Vakuumfett rund um die Lymphknoten, füllen diese Pfütze mit PBS.
- Setzen Deckglas in seiner Position und legen Sie die Thermometer-Sonde (halten Temperatur bei 37 ° C, da sonst die Zellgeschwindigkeit drastisch variieren).
- Entlang der oberen Kante des Deckglases fügen einen Kreis von Vakuumfett.
- Setzen Sie die Heizspirale in ihrer Position auf dem Vakuumfett, eine Dichtung zu schaffen, in einer ähnlichen Weise wie zuvor und Wasser hinzufügen / PBS auf dem Deckglas, um das Ziel zu tauchen.
- Nach der Bilderzeugung wird die Maus in Narkose gehalten werden, während die Erhöhung der Dosis von Ketamin / Xylazin zu einer tödlichen Dosis, gefolgt durch zervikale Dislokation.
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Representative Results
Die räumliche Auflösung in Lymphknoten
Die Dimensionen der effektiven Punktbildfunktion (epsf) entsprechen der räumlichen Auflösung eines Mikroskops 12. Wir messen diese dreidimensionale Funktion durch den Erwerb der zweiten Harmonischen Generation Signal von Kollagenfasern in Lymphknoten durch unsere MB-SI-TPLSM im Vergleich zu etablierten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Techniken, dh Felderkennung TPLSM (mittels CCD-Kameras) und Punkterkennung TPLSM (mittels PMT).
Aus diesen Messungen wird deutlich, dass an der Oberfläche der Probe, sowohl die laterale und axiale Auflösungen entsprechen den erwarteten Werten durch die Beugungstheorie 20 vorhergesagt. Doch mit zunehmender Bildtiefe und somit mit zunehmender optischer Pfad des Anregungs-und Emissionsstrahlung durch Medien mit stark variierenden Brechungsindex, verschlechtert sich die räumliche Auflösung wesentlich, indegig von der verwendeten Setup (Abbildung 2). Mit MB-SI-TPLSM erreichten wir, unabhängig von Bildtiefe, eine ca.. 20% bessere laterale Auflösung und eine 220% bessere axiale Auflösung im Vergleich zu den Standard-TPLSM Ansätze.
Dynamik der Immunkomplexe auf follikulären dendritischen Zellen in Keimzentren
Die klonale Selektion von B-Zellen bei der Immunantwort, im sekundären lymphatischen Organen des erwachsenen Mäusen ist der erste Schritt auf dem Weg in den Speicher B-Zellen oder Plasmazellen 4 unterscheiden. In diesem Verfahren wird das hochdynamische Wechselwirkung zwischen follikuläre dendritische Zellen (FDC) und B-Zellen auf der Ebene der Immunkomplex-Strukturen (Cluster von einigen Proteinmoleküle) in Keimzentren vermutlich eine zentrale Rolle spielen. Nur mit Hilfe eines hochauflösenden Intravitalmikroskopie Technologie ist es möglich, diese zellulären Kommunikation und deren Auswirkungen auf die Immunantwort zu sezieren. Unser Ansatz, MB-SI-TPLSM stellt zum ersten Mal die Möglichkeit der intravital Visualisierung und Quantifizierung der Abmessungen der Gruppen von Immunkomplexablagerungen durch anti-CD21/35-Fab-ATTO590 auf follikulären dendritischen Zellen markiert, bis zu 120 &mgr; m Tiefe Keimzentren der poplitealen Lymphknoten (Fig. 3a und 3b). Während solche Strukturen nicht durch Standard-TPLSM Ansätze sichtbar, könnten wir sie einzeln identifizieren und auch mit unserem Ansatz ihrer Dynamik zu visualisieren. Figuren 3e und 3f diese Erkenntnis unterstützt, die den direkten Vergleich zwischen der 3D-Fluoreszenzbild von Immunzellen Ablagerungen in einem Keimzentrum (PMT-basiert), die durch herkömmliche TPLSM erworben und MB-SI-TPLSM. Darüber hinaus könnten die Wechselwirkungen der Immunkomplex-Ablagerungen mit Keimzentrums-B-Zellen hoch gelöst werden (Abb. 3c und 3d; Filme 1 und 2) und kann nun sein iin Kombination mit Intravitalfunktions Sonden für die Proliferation, Differenzierung oder Apoptose nvestigated. In einem nächsten Schritt werden wir unseren Ansatz zu verwenden, um auch untersuchen die dynamische Kommunikation von Keim B-Zellen mit T-Helferzellen, die vermutlich die andere entscheidende Phänomen für B-Zell-klonalen in sekundären lymphatischen Organen bilden.
.. Abbildung 1 Prinzip und Aufbau der Mehrstrahl-gestreift-Beleuchtung Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop Der Strahl eines abstimmbaren gepulsten fs-Ti: Sa-Laser (Wellenlängenbereich 690-1,080 nm, 140 fs, 80 MHz) abgeschwächt ein Modul einer λ / 2 Platte und einer Dünnfilm-Polarisator hergestellt werden seine Impulse in einem Prismenbasis GVD-Kompensationsmodul vorverdichtet und schließlich in 2 geteilt, 4, 8, 16, 32 oder 64 Strahlen,Bildung einer Beamlet Linie. Zwei aufeinanderfolgende Teilstrahlen in der Leitung haben senkrechten Polarisationen (in der Zeile mit der Bezeichnung Beamlet rot und grün) und sind in der Zeit, um Störungen zu vermeiden verschoben. Die Zeitverschiebung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Teilstrahlen beträgt 3 ps. Für die Bildaufnahme wird der Teilstrahl Linie in die Probe durch eine Objektivlinse (20X Wasserimmersionsobjektiv-Linse, NA 0,95, WD 2 mm) fokussiert und senkrecht abgetastet wird, so dass eine wohldefinierte periodische Muster erzeugt. Dieses Muster wird entlang der Linie Beamlet übersetzt. Die Serie von Bildern erzeugt auf diese Weise werden durch auf einer Filterscheibe durch eine EM-CCD-Kamera und schließlich von einem Minimum-Maximum-Algorithmus ausgewertet montiert Interferenzfilter detektiert. Einzelstrahl TPLSM bezogen auf PMT-Detektion wurde mit demselben Mikroskop durchgeführt. In diesem Fall verwendet man nur einen Laserstrahl, um die Probe zu scannen, und wir das Fluoreszenzsignal spektral aufgelöst mit entsprechenden dichroitischen Spiegel und Interferenzfilter vor detektierenten sie mit Photomultiplier-Röhren. Alternativ kann anstelle des Ti:. Sa Laserstrahl, der Strahl eines optischen parametrischen Oszillators kann mit dem Mikroskop verbunden ist, um langwellige MB-SI-TPLSM auszuführen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Räumliche Auflösung der Mehrstrahl-gestreift-Beleuchtung TPLSM Vergleich zu Standard-PMT-basierten und multifokale CCD-basierten TPLSM. (A) Vertreter axiale Profile sowie xy und xz Projektionen der SHG in Kollagenfasern in 100 um Tiefe in Lymphknoten Knoten. lexc = 900 nm, Detektionswellenlängen im Bereich 447 ± 30 nm, Photonenfluss Φ = 4,75 x 10
Abbildung 3 Intravital Bildgebung von Keimzentren von MB-SI-TPLSM (a) 3D-Fluoreszenzbild der Lichtzone einer Keimzentrum von CD21/35-Fab-ATTO590 (rot) in einer Maus mit Hapten immunisiert beschriftet -.. Hühner γ -globulin (NP-CGG) nach adoptiven Transfer von B1-8-EGFP + B-Zellen (grün). Die Immunkomplexablagerungen (CD21/35 Markierung) auf follikulären dendritischen Zellen (FDC) einzeln dargestellt werden, wie in der Zoom-in (b) des Bildes (a) beobachtet, und haben (beide seitlichen und axialen) Abmessungen in der Bereich von 400-800 nm in bis zu 120 um Tiefe. Keimzentrum-B-Zellen in dem immunisierten B1-8 EGFP + Maus erfaßt (c), während die Kontakte (d) für die Reifung der Immunantwort mitverantwortlich nun auch sichtbar gemacht werden. λ exc = 850 nm, Detektionswellenlängen im Bereich 605 ± 20 nm (ATTO590) und 525 ± 25 nm (EGFP), Photonenfluss Φ = 7,05 x 10 28 Photonen / cm 2 · s. Maßstab (a) 20 &mgr; m, (b) 10 &mgr; m, (c) 30 &mgr; m, (d) 10 &mgr; m. 3D-Fluoreszenzbilder des gleichen Bereichs innerhalb derLichtzone einer Keimzentrum von CD21/35-Fab-ATTO590 markiert, wie von MB-SI-TPLSM (e) und konventionelle (PMT-basiert) TPLSM aufgezeichnet (f) sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Film-Titel
Film-1 und -2
Dynamik der Immunkomplexablagerungen an Sekundär follikuläre dendritische Zellen (FDC) und deren Interaktion mit Keimzentrum-B-Zellen wie von MB-SI-TPLSM aufgezeichnet. Die Immunkomplex Kautionen werden von CD21/35-Fab-ATTO590 (rot) gekennzeichnet, während die Keimzentrums-B-Zellen sind B1-8 Jk - / - EGFP +-Zellen (grün).
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Discussion
Das Ziel der Intravital optische Bildgebung ist es, zelluläre Motilität und Interaktionen, um Gewebe-und Organfunktion in Gesundheit und Krankheit zu verstehen 5 dynamisch und funktional zu visualisieren. Die leistungsstarke Technologie, um diese, Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zu erreichen, muss noch Einschränkungen in Bezug auf Frontverzerrungen, Streuen, langsam Erwerb, Bleichen und Lichtschäden, die ihre räumliche Auflösung begrenzen Welle überwinden, Kontrast sowie die Zeitauflösung .
Es gibt zwei erfolgreiche Lösungen, um eine bessere Anregung zu erreichen (und Emission) Photonenmanagement im tiefen Gewebe was zu einer besseren räumlichen Auflösungen, erhöhten Kontrast (erhöhte Signal-zu-Rausch-Verhältnis, aufgrund der erhöhten Signal) und damit verringert Photobleichen und Lichtschäden : die adaptive Optik-Ansätze und die Verwendung von mehr Anregungswellenlängen - abstimmbaren Infrarotanregungs 6. In den letzten zehn Jahren das Konzept der Wellenfront entsprichtction durch adaptive Optik hat sich von der Astronomie bis zur bio-optische Bildgebung, Multi-Photonen-Mikroskopie übergegangen sind und auch. Während das erste adaptive Optik Ansätze für Zwei-Photonen-Mikroskopie verließ sich auf Wellenfront Sensor-und brauchte eine subdiffraction Referenz, dh ein "Leitstern", ähnlich der Astronomie sind die derzeitigen Systeme besser zu tiefen Gewebe-Bildgebung 12 geeignet. Zum Beispiel verwenden sie Kohärenz-Gating der Anregungsstrahlung für Wellenfrontsensor 13,15, oder sie verwenden keine externen Wellenfront-Messüberhaupt, sondern entwickeln Anpassung Algorithmen basieren entweder auf Kreuzkorrelation der Bilder nach der Segmentierung Schüler 17 oder auf iterative stochastische Suche nach den idealen Parameter und nachfolgende Störung der unkorrigierte Bild wie aus der vorherigen Iteration Schritt erhalten - IMPACT 16, oder sie verwenden, Foto-Akustik, die Wellenfrontverzerrungen und Streueffekte 20 charakterisieren. Dennoch, aufgrund der stark schwank refraktiven Index im Gewebe, sind die adaptive Optik Ansätze eher langsam, da der Korrekturschritt muss für relativ kleine Flächen wiederholt werden (ca. 10 x 10 um 2) 16. Zusätzlich können entweder durch Wellenfrontkorrektur oder Streuwirkung, die maximal erreichbare räumliche Auflösung ist immer noch durch die Beugung begrenzt.
Unser Ansatz ist in der Lage, die Belastungen der Wellenfrontaberration und der Streuung teilweise zu überwinden, sondern auch drückt die Auflösung jenseits der Beugungsgrenze. Mit Objektiven mit höheren numerischen Apertur können die absoluten Werte für die axiale Auflösung auf rund 20 400 nm zu verbessern. Der Preis für die verbesserte Auflösung ist ein steiler Abfall der Signal-zu-Rausch-Verhältnis im tiefen Gewebe im Vergleich zu herkömmlichen TPLSM. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit, Felderkennung in MB-SI-TPLSM verwenden. Wie vor 15 gezeigt, ist die Verwendung von Felddetektoren anstelle von Punktmeldern mit diesem steiler Abfall der SNR du verbundene auf die stärkere Streuung des emittierten Lichts, die nur relevant für Felderkennung ist. Somit ist die maximale Bildtiefe für Felderkennungsverfahren TPLSM ca. 25% verringert im Vergleich zu herkömmlichen (dh Punkt Detektion) TPLSM. Eine einfache Lösung ist es, praktische Anregungswellenlängen mehr anzuwenden und mehr Emissionswellenlängen zu erkennen. Natürlich verbessert dies die tiefenabhängige SNR in herkömmlichen TPLSM im gleichen Umfang wie in MB-SI-TPLSM.
Soweit der Aufnahmegeschwindigkeit betrifft, ist MB-SI-TPLSM nur durch die Geschwindigkeit des galvanometrischen Scanner und / oder durch Auslesen der Kamera und Gewinnen der Strahlteilungs 32 Laserstrahls ermöglicht beschränkt. Im Vergleich zu Standard-Mehrstrahl-Kamera-basierte TPLSM, ist MB-SI-TPLSM etwas langsamer aufgrund der Notwendigkeit, nicht nur scannen, sondern auch synchron zu erwerben, jeder von rd. 10 gestreift beleuchtete Bilder, um das endgültige Bild mit hoher Auflösung zu erzeugen. Aber unsere Technik behält eine clOhr Geschwindigkeitsvorteil gegenüber der konventionellen TPLSM (basierend auf Single-Beam-Scanning-und Punkterkennung). Daher ist die Akquisitionszeit von einem 150 x 150 um 2 (512 x 512 Pixel), ist 841 msec mit herkömmlichen TPLSM (Scanner Frequenz 800 Hz) und 109 ms mit MB-SI-TPLSM. Dadurch wird die Anregungsleistung pro Strahl und die Verweilzeit pro Pixel sind die gleichen für sowohl konventionelle und MB-SI TPLSM, so daß das Signal für beide Konfigurationen vergleichbar ist. Wie zuvor gezeigt, 20, Bleichen und Lichtschäden Effekte in MB-SI-TPLSM Experimente sind niedrig und vergleichbar mit herkömmlichen TPLSM gut durchgeführt.
In Zukunft wäre es wünschenswert, um die komplementären Ansätze der adaptiven Optik und gestreiften-Beleuchtung im Infrarotbereich zu kombinieren, um weiter zu verbessern Intravital TPLSM, ähnlich wie die Leistungen in der adaptiven Optik für die strukturierte Beleuchtung-21. Allerdings, um diese Ziele zu erreichen, deutlich schneller adaptive Optik-Ansätzeentwickelt werden.
Die erwarteten Auswirkungen der hohen Streifenbeleuchtung Ansatz für Biowissenschaften und Biomedizin liegt in ihrer Fähigkeit zur Verbesserung der Auflösung und Kontrast verbessern in tiefe Gewebe, entgegenWellenFrontVerzerrungen und Streueffekte, sondern auch jenseits der Beugungsgrenzen in der Laser-Scanning-Mikroskope gehen, durch einfach die Steuerung der Scan-Prozess und die Wahl einer entsprechend sensiblen Bereich Detektor.
Die erwarteten Auswirkungen der hohen Streifenbeleuchtung Ansatz für Biowissenschaften und Biomedizin liegt in ihrer Fähigkeit zur Verbesserung der Auflösung und Kontrast verbessern in tiefe Gewebe, entgegenWellenFrontVerzerrungen und Streueffekte, sondern auch jenseits der Beugungsgrenzen in der Laser-Scanning-Mikroskope gehen, durch einfach die Steuerung der Scan-Prozess und die Wahl einer entsprechend sensiblen Bereich Detektor.
Die Streifenbeleuchtung Ansatz kann für intravital im tiefen Gewebe angewendet werdenAltern in allen Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopen, die in der Lage, mit der Kameraerkennung Galvoscanner Bewegung in Single-Beam-Scanning zu synchronisieren sind. In diesem Fall werden die einzelnen Streifen in der Erregungsmuster nachträglich und nicht gleichzeitig, wie in MB-SI-TPLSM erzeugt. Mit Einzelstrahlabtastung im SI-TPLSM erwarten wir natürlich eine etwas langsamere Erfassungsrate der Fluoreszenzbildern im Vergleich zu herkömmlichen TPLSM (Einzelstrahl Scannen, Punktdetektor-basierten TPLSM), aber die gleiche Verbesserung der räumlichen Auflösung und Kontrast für bewiesen MB- SI-TPLSM. Die untere Erfassungsgeschwindigkeit zusammen mit der Einschränkung in Bildtiefe reduziert den Einsatzbereich der Single-Beam-SI-TPLSM im Vergleich zum MB-SI-TPLSM.
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Disclosures
Volker Andresen ist Gesellschafter der LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Deutschland. Die anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken R. Heintzmann für fruchtbare Diskussionen während der Entwicklung des Streifenbeleuchtung Ansatz, K. Rajewsky und A. Habermann für die Bereitstellung von C57BL / 6 B1-8-GFP-transgenen Mäusen. Wir erkennen die Deutsche Forschungsgemeinschaft unter dem Förder NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 und SFB633, Projekt-A15 (zum AEH), die Charité unter Gewährung Rahel-Hirsch-Stipendium (RN) für die finanzielle Unterstützung. Wir erkennen insbesondere die Netzwerk JIMI für fruchtbare Diskussionen und infrastrukturelle Unterstützung
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
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