Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז'רמינל

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

Abstract

ניטור תקשורת סלולרית על ידי מיקרוסקופית רב פוטון רקמות עמוקות intravital הוא המפתח להבנת גורלם של תאי מערכת החיסון בתוך דגימות עבות רקמות ואיברים בבריאות ובחוליים. על ידי שליטה על תבנית הסריקה במיקרוסקופ רב פוטון ויישום אלגוריתמים מספריים מתאימים, פיתחנו גישת פסי תאורה, מה שאיפשר לנו להשיג פי 3 ברזולוציה צירית טוב יותר ויחס משופר אות לרעש, כלומר לעומת זאת, בלמעלה מ 100 עומק רקמת מיקרומטר בתוך מאוד פיזור רקמות של איברים הלימפה בהשוואה למיקרוסקופיה רב פוטון סטנדרטי. מהירות הרכישה, כמו גם השפעות photobleaching וניזקים היו דומה לטכניקת צילום המבוסס על מכפיל סטנדרטי, ואילו עומק ההדמיה היה מעט נמוך יותר בשל השימוש בגלאי שדה. על ידי שימוש בגישה עם פסי התאורה, אנו מסוגלים להתבונן בדינמיקה של פיקדונות מורכבים חיסון בתאים דנדריטים זקיקים משניים ̵1; ברמה של כמה מולקולות חלבון במרכזים נבטי.

Introduction

מיקרוסקופ לייזר סריקת שני פוטונים (TPLSM), עם יתרונות משלה להדמית רקמות עמוקות הקשורות לעירור פעם אולטרה קצר אינפרא אדום 1, יש מהפכה השקפתנו על תהליכים חיוניים ברמה תא בודד על ידי חשיפת דפוסי תנועתיות ואינטראקציה של שונים תת תא חי חיות 2-5. עם זאת, טכנולוגיה נוכחית היא עדיין לא מספיק כדי להבהיר את מנגנוני פעילות של איברים שונים ותפקוד כתנאי מוקדם לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, שכן הוא הופך את המידע דליל רק על הבסיס המולקולרי של תגובה תאית בתוך רקמות בבריאות ובחוליים. הטכנולוגיה נוכחית מאפשרת חלון מרחבית רק של כמה מאה מיקרונים בשל פיזור ולנופף באפקטי עיוות קדמיות ברזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש 6, שהן בולטות במיוחד ברקמה הקומפקטית ביותר של בעלי חיים מבוגרים. השפעות עיוות אלו פיזור ולנופף מולם בשל הטרוגנית מאודחלוקת ד איזוטרופי של מקדם השבירה ברקמות, מה שמוביל בשלב ראשון להידרדרות תלויה עומק של רזולוציה מרחבית 3D וסופו של דבר לאובדן המוחלט של אותות שמקורם פוטונים עירור בליסטיים, כלומר הפסד של יחס אות לרעש. במונחים של bioscientific ויישומי רקמות עמוקות ביו, זה אומר שהטכנולוגיה הנוכחית אינה מסוגלת לחשוף את התקשורת סלולרית באופן חד משמעי, כי ברזולוציה נמוכה תוביל לאינטראקציות באופן כוזב חיוביות ואילו הירידה של יחס אות לרעש הייתי לגרום למערכת להתעלם מכמה יחסי גומלין בין מבנים עמומים.

על מנת לזהות באופן חד משמעי אינטראקציות הסלולר באופן דינמי, יש צורך ברזולוציה מרחבית השתפרה מאוד עמוק בתוך הרקמה. טכניקות Nanoscopy החזקות הציגו כיום מבוססות על אלגוריתמים מיוחדים מספריים, למשל גישות מבנה תאורה, על דלדול של המצב המעורר הראשון, כגון למשל dSTORM, PALM, מצאו יישומים רבים בתאים קבועים, כמו גם בתרביות תאים חיות 7. עם זאת, על מנת להרחיב את היישומים הללו לסעיפי רקמות, רקמות ואורגניזמים חיים שעדיין צריכים להתגבר על קשיים טכניים חמורים. שני פוטונים עירור STED עם אורכי גל שונים, כמו גם עם אורך גל יחיד (sw2PE-STED) לעירור ופליטה מאולץ יושמה כדי לשפר את הרזולוציה לרוחב פרוסות מוח 8 או במטריצות מלאכותיות עם תאים מוטבעים 9, בהתאמה, באותו רזולוציה צירית כTPLSM סטנדרטי. שימוש אחד הפוטון STED, הדינמיקה של קוצים הדנדריטים יכולה להיות צילמה על פני השטח של קליפת המוח (עד 10-15 עומק מיקרומטר) בעכבר Thy1 EGFP מתגורר ברזולוציה של 67 10 ננומטר. כלי תכליתי לביולוגיה התפתחותית מסופק על ידי מיקרוסקופ מובנה תאורה multifocal, המספק 2D הכפול השתפררזולוציה. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש רק באורגניזמים עם נטייה נמוכה של פיזור אור, כגון עוברי דגי זברה 11. ובכל זאת, אף אחת מהטכניקות הללו ניתן ליישם ברקמת הפערים הפיזור של בעלי חיים מבוגרים בכמה מאות מיקרומטרים, שהם מודלים חיוניים למחקר ביו והקליני של מחלות עם הופעה לאחר לידה.

מבקר של הקירוב משמש לחישוב את צורת חזית גל העקיפה מוגבל, כלומר פונקצית נקודת התפשטות (כוחות הביטחון הפלסטיניים), לאחר ההתמקדות דרך עדשה, הרוחב של כוחות הביטחון הפלסטיניים לאורך הציר האופטי (ברזולוציה צירית) הוא לפחות פי שלוש גדול יותר רוחב כוחות הביטחון הפלסטיניים בניצב לציר האופטי (ברזולוציה רוחב) 12. לנופף עיוותים מול הזמנות שונות לכמת ידי המקדמים של Zernike משמעותי לשנות את צורת חזית הגל של גל אלקטרומגנטים ממוקד בתחום ההדמיה רקמות עמוקות שמוביל לPSFs הרבה יותר גדול, במיוחד לאורך אופטיאל ציר 13-15. לפיכך, שני החוקים העקיפה והשפעות עיוות חזית הגל מצביעים על הרזולוציה לאורך הציר האופטי כגורם המגביל בהדמיה רקמות עמוקות. ואילו טכניקות Nanoscopy להתמקד במנטרלות את המגבלות של השתברות, טכנולוגיה שמשפרת את הרזולוציה וחדות על ידי מנטרל הן עקיפה ואפקטי עיוות גל קדמי צירית יש צורך רק להדמית intravital ברזולוציה גבוהה. באופן אידיאלי, טכניקה זו צריכה להיות גם מהיר מספיק כדי לאפשר ניטור של דינמיקה סלולרית.

תיקון סטיות כוחות הביטחון הפלסטיניים ואובדן ניגוד באמצעות האופטיקה מתקנת בTPLSM בזמן אמת, נחקר בהרחבה והשתפר בעשור האחרון 13,14,16-18 ולכן הבחירה הטובה ביותר הזמינים כיום המובילה לניהול טוב יותר של עירור בליסטי פוטונים 14. ובכל זאת, בשל העובדה שרוב לנופף מול תיקון גישות בשימוש באופטיקה אדפטיבית הם איטרטיבי וכי הם חהיש צורך לחזור לאזורים קטנים (כמה 10 x 10 מיקרומטר 2) בשל ההטרוגניות הגבוהה של מקדם השבירה ברקמות, מהירות הרכישה היא נמוכה באופן משמעותי מהנדרש לתנועתיות תא הדמיה ותקשורת. יתר על כן, המגבלה הפיסית בהסתגלות אופטיקה השתפרה TPLSM עדיין נקבעת על ידי עקיפה.

אפנון המרחבי של תאורה (SPIN) ואפנון זמני בצד זיהוי (ספייד) הוצעו באופן תיאורטי שיחול על מיקרוסקופיה לייזר סריקה כדי לשפר את הרזולוציה. היישום המעשי שלהם בתחום ההדמיה intravital עדיין להיות הפגין 19.

יחדיו, יש ביקוש גבוה לפיתוח של טכנולוגיות, המשפרות את הרזולוציה להדמית רקמות עמוקות בחיים בעלי חיים מבוגרים. בעבודה זו, אנו משיגים אפנון המרחבית של דפוס העירור על ידי שליטה על תהליך הסריקה ברב קרן לייזר-s רב פוטון עם פסי תאורהמיקרוסקופיה שימורים (MB-SI-MPLSM) 20. בניגוד לגישות תאורה מובנה, שבו חתך קורה עירור הוא מווסת מרחבית, אנו משתמשים רק בתהליך הסריקה על מנת להשיג את האפנון המרחבי של העירור. על ידי הרחבת העירור לאורך גל ארוך יותר, אנו מסוגלים לשפר את שניהם ברזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש ברקמות עמוקות של מאוד פיזור רקמות (בלוטות לימפה לדוגמא, נתיב חופשי פיזור 47 מיקרומטר 6), ללא תלות באופטית אות שאינו ליניארי אנו מזהים, כגון הקרינה, דור שני הרמוני או בתדירות אחרת ערבוב תופעה. שימוש בגישה זו באורכי גל עירור עד 900 ננומטר אנו מסוגלים באופן דינמי מבנים חלבוניים סלולריים תמונה בקנה המידה של כמה מולקולות במרכזים נבטי של בלוטות לימפה בעכבר. לפיכך, אנו יכולים לחזות טובים יותר את האינטראקציה בין יחידות אנטיגן נושא על פני השטח של תאי דנדריטים זקיקים ותאי B בתהליך של חיטוט אנטיgen במהלך התגובה החיסונית באיברים הלימפה משניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התקנת Multi-מרישים לTPLSM פסים תאורה

ההגדרה המשמשת כאן היא מיקרוסקופ רב קרן מיוחדת שני פוטונים לייזר סריקה, כפי שתוארה לעיל 6,20. המערכת מתוארת באיור 1. הגישה יכולה להיות מיושמת על מיקרוסקופים אחרים שני פוטונים לייזר סריקה, אשר מסוגלים לסנכרן רכישת מצלמה עם התנועה של מראות galvoscanner, גם אם הם מסוגלים לבצע סריקה חד קרן בלבד . במקרה זה, החסרון יהיה מהירות רכישה נמוכה יותר, עם זאת בדומה למהירות הרכישה בTPLSM מבוססת PMT הסטנדרטי. על מנת להשיג את האיכות אופטימלית עד כמה שרזולוציה וניגודיות מודאגות, בphotobleaching הנמוך ביותר והניזקים והרכישה המהירה ביותר, זה recommendable לשקול את צעדי ההסתגלות הבאות של ההתקנה:

  1. בדוק את כוח הלייזר של הלייזר כי תשא: לבדוק ב100%, בהשוואה לערכים מקוריים של היצרן וPrevioבבעלותנו קריאה ולהשתמש בו כפי שהוא אם גל עירור בננומטר 700-1,000 הטווח הוא הכרחי.
  2. בדוק את האינדיקציה בקרה מרחוק לטי: מפצל אלומת Sa, כלומר לבדוק 0% והגדרות 100%. אם יש קרן תשא שנותרה ב100%, ולאחר מכן לבדוק ולאפס את עמדת null מנוע דריכה. טי: מפצל אלומת Sa מורכב מצלחת נמוכה מסדר λ / 2 ומקטב, אשר מפצלת את הקורות מקוטבות בניצב לייזר על נתיבי קורה בניצב: אחד מופנה למיקרוסקופ לעירור, האחר משמש משאבת הפרמטרים אופטיים מתנד (OPO). על ידי סיבוב אוטומטי צלחת λ / 2, הסתגלות מתמשכת של טי: Sa וכוח OPO, בהתאמה, מושגת.
  3. התאם את OPO לאורך הגל הרצוי ולמדוד את תפוקת החשמל. אם הכוח הוא נמוך מדי (עם 4 W טי: לייזר Sa ב800 ננומטר, אחד צריך להיות מסוגל לקבל .8-1 W של קרן OPO בסביבות 1,050-1,100 ננומטר) לייעל את אורך גל השאיבה ולבדוק את ההגדרות של הראי דואר ושל הגביש ליבה. בחר את הערכים שלהם מומלצים אופטימליים, לעתים קרובות זמינים כמו תרשימים או גרפים, ולאחר מכן לכוונן אותם עד OPO מהדהד במוצא הגל הרצוי ומגדיל את הכוח.
    1. אם הכוח הוא עדיין נמוך, להתאים את שתי המראות נגישות של OPO עם ארבע ידיות כוונון-מראה נגישים. לעשות את הצעד הזה באיטיות רבה ובתנועות קטנות מאוד, לסירוגין בין המראות הקדמיות וסופו של דבר.
  4. בדוק שTi: קורות Sa ו / או OPO להכות את מראות הכניסה במיקום המתאים, המרכזי.
    1. השתמש בפיסת נייר לבן (לא מאוד מבריק או משקף!) וצופת אינפרא אדום לצפייה קרן OPO וגבוה יותר הגל Ti: הקורות Sa.
      1. ללבוש משקפי מגן בעת ​​עבודה עם ניר Ti: הקורות Sa (בדרך כלל עד 720-750 ננומטר היא גלויות לאדם הממוצע).
    2. הגדר את כוח הלייזר (ים) נמוך ככל האפשר עבור הליך היישור כדי miמזער נזק לעיניים פוטנציאליות.
    3. תמיד לשמור על אורות הסביבה של החדר, כך שהתלמיד של העין מכווץ.
    4. זכור כי כוח הלייזר הוא על ידי מנחתים מורכב מצלחת λ / 2 ומקטבים, אשר אינו בתוקף עדיין, כאשר טי בשליטה בסדר: קרן שא נכנס לסריקה בראש!
  5. בדוק שסרעפת נקודת כניסה היא פגעה באמצע על ידי Ti: קרן Sa ו / או OPO; אם לא, להתאים את שתי המראות האחרונות לפני קרן הלייזר נכנסה לסריקת הראש.
    1. השתמש בצופת IR וחתיכה קטנה של נייר לבן (אך לא מבריק / רעיוני!).
    2. תמיד לסגור את הסרעפת בכניסה למיקרוסקופ, כך שעמדת קרן לייזר יכולה להישפט באופן מדויק יותר. חשוב: אל תשכחו לפתוח מחדש את הסרעפת לפני שתמשיך לשלב 6!
  6. התאם את נתיב קרן אור הלייזר שיקף למיקרוסקופ בהתאם. עשה זאת במקטעים קטנים ולבצע הקורה ווא איטרטיביlking.
    1. בדוק את נתיב האור כולו, אם תפוקת האור מעדשת המטרה היא לא נאותה.
    2. יש לבדוק תמיד את נתיב האור בעת השימוש במערכת בפעם הראשונה לאחר תקופה ארוכה סרק, תיקון גדול, כל החלפה של אלמנטים אופטיים, או אם בעיות חשודות להתקיים עם הפלט.
  7. ודא כי כל המשטחים אופטיים הפעילים נקיים, במיוחד שהם ללא אבק! אם המשטחים מכוסים בשכבה של אבק, חזית הגל מעוות עוד לפני שנכנס לעדשה האובייקטיבית וקרן לייזר וכתוצאה מכך אף פעם לא יספקו תמונה חדה של המדגם!
    1. במידת צורך, לנקות את המראות עם חתיכת נייר מקופלת עדשה, טבולה באתנול או isopropanol.
  8. בדוק שהקרן מגיעה חזרה למראה שממוקמת ישירות מעל מראה הכניסה בסוף מדחס הדופק מבוסס פריזמה, אחרי נתיב האור מוגדר. מכאן, שהקרן באה לידי ביטוי in כדי רבב הקורה (ע).
  9. בדקו אם קרן הלייזר פוגעת בסרעפת שממוקמת בכניסה של מרבב הקרן, מייד לפני צלחת λ / 2, שינוי הקיטוב של קרן הלייזר שיתאים לדרישות להעברת 50% בפס רחב והשתקפות 50% בתוך ע.
    1. ראשית, לסגור את הסרעפת כך שעמדת הקרן יכולה להישפט באופן מדויק יותר ולבצע הליכה קורה בין שני דיאפרגמה, כלומר אחד בכניסה למיקרוסקופ, ושנייה בכניסת BM. עבור מיקרוסקופים סריקה חד קרן אחרות הסרעפת צריכה להיות ממוקמת בכניסה לסורק-XY.
    2. אם הקרן לא פגעה במרכז של הצמצם הסגור למטה, להתאים את המראה הנ"ל, ממוקם ישירות לפני הסרעפת כניסת BM. חשוב: אל תשכחו לפתוח מחדש את הסרעפת לפני שתמשיך לשלב 10.
  10. עם הסרעפת נפתחה מחדש, לבדוק אם קרן הלייזר פוגעת במראות בBMעמידתם בנקודות. השתמש ברצועה צרה של נייר כדי שלא לחסום את חלק אחר של נתיבי האור המורכבים של BM!
  11. בדוק אם הקרן פוגעת באמצע מראות יציאה: המראה עליון עבור קיטוב מקביל "P", במראה תחתון עבור "S" בניצב קיטוב. אם לא, להתאים את מראה הכניסה לפני BM.
  12. בדוק אם "S" ו "P" אלומה מקוטבת מאפשר קבוצות להיכנס לקוביית המקטב והחפיפה הולמת בכניסה לסורק-XY. דלג על השלבים הבאים במקרה מיקרוסקופ סריקה חד קרן משמש.
  13. בדוק אם אור הלייזר עובר באופן מרכזי את הסריקה ועדשות הצינור ומקבל במרכז של העדשה האובייקטיבית "מישור מוקד אחורי. חשוב: בשלב זה יש לעשות עם קרן הלייזר בעמדת מרכז, לא בעמדת חניה!
    1. להחליף את העדשה האובייקטיבית עם כלי מכוון ("עין שור") ולבדוק אם קרן הלייזר פוגעת במטרה באמצע, ואםתאורה היא אפילו.
    2. אם זה נראה את המקרה, לסגור את הצמצם לפני בע"מ ולבדוק אם תבנית התאבכות מעגלית מופיעה, עם עיגול שחור באמצע (מינימום הפרעה).
      1. התאם את מראה הכניסה אם יש שינוי משמעותי ביחס למרכז העין של השור.
  14. עכשיו תחליף את העין של השור עם עדשה אובייקטיבית, למשל עם עדשת טבילה במי 20X.
    1. בדוק את נורית שדה הפלט עם פיסת נייר לבן. זה צריך להיות בהיר, אחיד ומיקום מרכזי.
    2. למדוד את תפוקת החשמל: בOPO 100% עם 100% שאיבת Ti: Sa (4 W), אחד צריך לקבל כ. 100-150 mW אחרי העדשה ב1,100 ננומטר (במיקרוסקופ משמש כאן). סמכויות לייזר נמוכות לא יספיקו לביצוע רב קורה SI-TPLSM. לסריקה חד קרן SI-TPLSM, 5-10 mW מספיקים. קרן הלייזר חייבת להישאר בעמדת המרכז מבלי להיות Scanneד!
  15. אם ביצוע MB-SI-TPLSM, ליישר את המראות בBM כדלקמן:
    1. הנח מדגם homogenously fluorescing, למשל שקופיות הקרינה אדומות, על הבמה ולמקד את קרן הלייזר בתוך המדגם אך סמוך למשטח העליון (כלומר קרוב לחזית העדשה האובייקטיבית ").
    2. הגדר את המיקרוסקופ למצב של ריבוי הקורה ולבחור את מספר הקורות, בתחילת, רצוי רק קרן אחת, וקיטוב, "P" למשל.
      1. מצא את קרן הלייזר על ידי ההדמיה שקופית הניאון: להגדיר את התריס "P" לפתוח ולהפעיל את מצלמת CCD ברציפות תוך התמקדות הקורה.
      2. להבטיח את הקרן היא בעמדת המרכז, ושהסורק כבוי. ודא שהקרן לא נסרקה!
      3. מצא את הקורה על ידי מחפש נקודת אור בסמוך למרכז של שבב המצלמה.
      4. למקד את הקרן עד לנקודה היא הבהירה וחד ביותר, כלומר מטוס התמונה של מיקרוסקופ תואם את עמדתו של שבב המצלמה; להקטין את כוח הלייזר, כך שהנקודה היא לא רוויה. עם מערכת מיושרת היטב זה אומר שהכח הלייזר חייב להיות מינימום קרוב, כאשר עובד במצב חד קרן (כ 0.6 כוח לייזר mW צריך לעבוד).
      5. אם המקום הוא באופן משמעותי מחוץ למרכז, להזיז אותה קרוב יותר למרכז על ידי התאמת המראה מול בע"מ (או של הסורק לסריקה חד קרן).
      6. כאשר גם יישור הקיטוב האחר קרן, כלומר, "S", עכשיו לעבור למצב 2-קורה, לפתוח את התריס "S" ולבדוק את המיקום של הקורה (רק קרן אחת שניתן לראות ולו רק התריס "S" הוא פתוח ).
      7. בסיום, לעבור למצב 4 הקורה ולהשתמש במצב "P" הקיטוב (תריס "P" פתוח). עכשיו שני beamlets יופיע.
      8. סדר שני beamlets להיות מקביל לחלוטין לקצה התחתון של התצוגה של המצלמה, ולהגדיר אותם להיות 2.8 מיקרומטר לגזרים.
          >
        1. אם הם לא מיושרים כראוי, להתאים את המראה הראשון של BM.
        2. לא ליישר את הבורג באמצע, במקום להשתמש בשני ברגים היקפיים להעביר את המראה עד שתי הקורות הן 2.8 אממ לגזרים ומושלמים מסודרים אופקי.
      9. עכשיו לעבור למצב של 8 קרן בקיטוב "P", ולהתאים את המראה השני בע"מ (גם בלי הנקודה האדומה) עד 4 beamlets נמצא במרחק שווה ב2.8 אממ, ומסודר במקביל לקצה התחתון של התמונה.
      10. חזור על פעולה ב16 - ומצב 32 קורה, כדי להתאים את מראות BS 3 ו -4, בהתאמה. זה חשוב לbeamlets להיות במרחק שווה, כי SI-אלגוריתמים, הפשוט ביותר להיות אלגוריתם דקות מקסימום (חילו), מבוססים על הנחה זו.
  16. החלף את המדגם אחיד ניאון עם אחד הטרוגני מובנה, למשל שורשי Convallaria חוצי מוכתמים.
    1. עבור לעמדת החניה של קורה העירור, Which ממוקם בדרך כלל בערכים גדולים של קואורדינטות הסורק, למשל (10,000; 10,000).
    2. סרוק את תמונה (רב קורה) עם מצלמת CCD. בדוק שהתמונה מופיעה חדה, אחיד וישרה.
    3. כוון את המצלמה אם התמונה מופיעה מסובבת: לסובב את גוף המצלמה axially סביב הציר האנכי ביד (להיות עדין!) עד שהתמונה מיושרת.
  17. הפעל את הסורק-XY על מנת לשלוט בתהליך הסריקה על מנת ליצור את דפוס העירור, תמונת פסים כלומר.
    1. במקרה של סריקה רב קורה, הזז את מראה y הסורק, כלומר. בניצב לקו beamlet, בצורה כזאת, כדי ליצור תמונה מפוספסת ריבועית.
    2. אם שדה הראייה שנוצר כמתואר בשלב 17.1. הוא קטן מדי, להאריך את שגרת הסריקה על ידי הזזת מראה x הסורק לעמדה להבטיח כי קו הקורה בואו מוכפל וbeamlets נמצא במרחק שווה לאורך הקו כולו. חזור על התנועה המדויקתמראה y הסורק לאחר מראה x הסורק הוא עבר כדי ליצור את תמונת פסים הגדולה יותר.
    3. במקרה של סריקה חד קרן, לסירוגין תנועת ראי y הסורק עם תנועת ראי x סורק שוב ושוב בעמדות במרחק שווה - שהוגדרו על ידי המדען - על מנת ליצור את תמונת פסים הרצויה.
    4. הקפד להשתמש לתנועת ראי y סורק הפקודה למהירות קבועה (האצה / האטה מופחתת) ולמראה חד x הסורק במהירות המרבית (האצה / האטה לכל היותר).
  18. באופן אוטומטי לרכוש ולשמור את התמונה המפוספסת עם המצלמה (שדה גלאי). לכן, לסנכרן את המצלמה עם הסורק ולהשתמש בסורק כהדק מאסטר.
  19. חזור על רכישת תמונות מפוספסות (פרוטוקול סריקה שתואר בפרוטוקול 17) על ידי הזזת מראה x הסורק בעמדות שונות באופן הבא:
    1. בחר מספיק צעדים חזרה ואורך הצעד המתאים ביןשתי תמונות פסים הבאות כדי לכסות את המרחק בין שני beamlets ברציפות (במקרה זה 2.8 מיקרומטר וצעד אחד מראות הסורק שווה 25 ננומטר); זה עשוי להיות כדאי, כדי לאפשר חפיפה קטנה, כלומר 0.3-0.4 מיקרומטר נוסף.
    2. הגדר את x-Shift לערך שמתאים למגבלת הרזולוציה הרוחב באורך הגל המסוים. כדוגמא, באמצעות 10 שלבים של מראה x הסורק במשמרת ו12 או 13 משמרות להוביל לטוב ביותר גם צירי ותוצאות ברזולוציה רוחב במערכת זו. בדוק עם שקופיות מובנים, למשל שקופיות שורשי Convallaria, שמספרי העבודה הטובים ביותר במערכת בשימוש.
    3. ייעל את שני הערכים הללו עד שתמונת Convallaria הופכת החדה ביותר: להשתמש בכלי פרופיל קו על תמונות SI המחושבים ולהשוות את הרוחב של פרופילי הקו (המהווה את אות הקרינה מקירות תא Convallaria).
    4. לרכוש כל תמונה מפוספסת מסונכרנת עם תנועת הסורק ולשמור אותו בנפרד, לדוגמא:
  20. פתח סט של תמונות פסים מלא כמו מטריצות, כלומר מטריצת 3D, בשגרת ההערכה ולהשתמש גם אלגוריתם דקות מקסימום או אלגוריתם פורייה-להפוך ליצירת מטריצת 2D של הרזולוציה הגבוהה SI-התמונה. האלגוריתמים תוארו בעבר בפירוט 20.

עכברי חיסון והכנה לIntravital הדמיה

הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדות המדינה המתאימות לרווחת בעלי החיים (LAGeSo, Landesamt für גזונטהייט und Soziales, ברלין) ובוצעו בהתאם להנחיות ותקנות (G0153/08 רישיון ניסוי בבעלי החיים) הנוכחיות.

  1. האינדוקציה של תגובת מרכז נבטי בבלוטות לימפה popliteal והכנת תחום ההדמיה בוצעה כפי שתוארה לפני 4. לטהר את תאי B immunomagnetically מהטחול של-8 B1 + / +- / -ותאי B של B1-8 + / +- / - ה-GFP + עכברים.
  2. הזרק לווריד 3 x 10 6 תאי B NP-ספציפיים עם טוהר> 95% באמצעות ⅛ B1-8 + / +- / - ה-GFP + ו⅞ nonfluorescent B1-8 + / +- / - בC57Bl / 6 נמענים .
  3. יום אחד, לאחר העברה לתא לחסן את המקבלים עם 10 מיקרוגרם של NP-CGG (גלובולין ɣ nitrophenyl עוף) לתחליב בadjuvant של פרוינד המלא (CFA) בפנקס מזון האחורי הימני.
  4. ברי התווית Fab של נוגדני anti-CD21/CD35 עם אסתר ATTO590-succinimidyl.
    1. כדי להדגיש את הרשת של תאי דנדריטים זקיקים (FDC) במרכז נבטי in vivo, להזריק 10 מיקרוגרם של שברי Fab כותרת fluorochrome לשודד אחוריות הימני של hr העכברים 12-24 לפני ניתוח intravital מתבצע.

השלבים הבאים צריכים להיות consideאדום להכנת הצומת לימפה popliteal להדמית intravital (היום 8-10 לאחר חיסון):

  1. הרדימי עכבר על ידי הזרקת ה-IP של קטמין / xylazine, כמות בהתאם למשקלם.
  2. בדיקת הרפלקסים לפקח עומק ההרדמה במשך כל תקופת ההדמיה.
  3. לגלח את הרגליים, גב ואגף ימני של עכבר קפדני ולהשתמש שיער מתוך קרם להסרת שיער שיורית לחלוטין.
  4. תקן trochanter תקין עיקרי: לאתר שבב גרמי עם אצבעות, להגדיר חתך בעור קטן עם מספריים עד fascia בצורת משולש לבן קטן מופיע.
  5. הצמד שבב גרמי מתחת fascia זה עם פינצטה המחודדת של העוצר.
  6. לתקן את עמוד השדרה באזור גב תחתון באמצעות פינצטה שיניים.
  7. תקן את הרגל אחורית ימנית על עוצר ולהדק את הבורג.
  8. זנב קלטת כדי לשמור על הרגל במצב הנכון.
  9. בצד הזנב של הירך, ליצור חתך בעור, באזור שבו ente וריד popliteal הבולטrs הרקמות, להפריד את העור מהרקמה הבסיסית עם פינצטה הבוטה ובצע את וריד popliteal מפרוקסימלי לדיסטלי.
  10. לחשוף את הבלוטות לימפה באמצעות פינצטה בוטה, נסה להימנע מחיתוך על מנת להגן על כלי הלימפה בסדר (לשמור על הבלוטות לימפה בPBS במהלך החשיפה).
  11. ליצור מעגל של שומן ואקום סביב הבלוטה לימפה, למלא שלולית זה עם PBS.
  12. שים את תלוש לכסות בעמדתה ולמקם את מדחום הבדיקה (לשמור על טמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, אחרת מהירות התא באופן דרמטי להשתנות).
  13. לאורך הקצה העליון של להחליק את המכסה להוסיף עיגול של שומן ואקום.
  14. שים את סליל החימום בעמדתה בגריז הוואקום, ליצור חותם באופן דומה כמו בעבר ולהוסיף מים / PBS על להחליק את מכסה הזכוכית לטבול האובייקטיבי ל.
  15. לאחר הדמיה, העכבר נשמר בהרדמה, תוך הגדלת המינונים של קטמין / xylazine למנה קטלנית, ואחריו נקע בצוואר הרחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רזולוציה מרחבית בבלוטות הלימפה

הממדים של התפקוד היעיל נקודת ההתפשטות (ePSF) מתאימות לרזולוציה מרחבית של מיקרוסקופ 12. מדדנו שלוש ממדי פונקציה זאת על ידי רכישת אות דור הרמוניות השנייה של סיבי הקולגן בבלוטות לימפה על ידי MB-SI-TPLSM שלנו בהשוואה לטכניקות הוקמו שני פוטונים במיקרוסקופ סריקת לייזר, כלומר TPLSM גילוי שדה (באמצעות מצלמות CCD) ו TPLSM זיהוי נקודה (באמצעות PMTs).

ממדידות אלה זה הופך להיות ברור כי על פני השטח של הדגימה, שתי החלטות לרוחב וציריות מתאימות לערכים הצפויים שנחזו על ידי תורת עקיפת 20. עם זאת, עם עומק הדמיה גובר וכך עם הגדלת נתיב אופטי של שניהם עירור וקרינת פליטה באמצעות תקשורת עם מקדם שבירה שונה מאוד, ברזולוציה מרחבית מתדרדרת במידה ניכרת, independently של ההתקנה המועסקות (איור 2). על ידי MB-SI-TPLSM שהגענו, באופן עצמאי מעומק הדמיה, כ. 20% יותר רזולוציה לרוחב ורזולוציה צירית 220% יותר בהשוואה לגישות TPLSM הסטנדרטי.

דינמיקה של קומפלקסים חיסוניים על תאים הדנדריטים זקיקים במרכזים נבטי

הבחירה המשובט של תאי B במהלך התגובה החיסונית, בתוך איברי הלימפה משניים של עכברים בוגרים היא הצעד הראשון בדרכם להתמיין לתאי B זיכרון או תאי פלזמה 4. בתהליך זה, האינטראקציה מאוד דינמית בין תאי זקיקים דנדריטים (FDC) ותאי B ברמה של מבנים חיסוניים מורכבים (אשכולות של כמה מולקולות חלבון) בתוך מרכזים נבטי הוא האמין לשחק תפקיד מרכזי. רק על ידי שימוש בטכנולוגיה מיקרוסקופית intravital פתרון מאוד אפשר לנתח תקשורת סלולרית זה והשלכותיו על התגובה החיסונית. הגישה שלנו MB-SI-TPLSM מספק בפעם הראשונה את האפשרות של intravitally הדמיה וכימות הממדים של האשכולות של פיקדונות מורכבים חיסוניים שככותרתו על ידי anti-CD21/35-Fab-ATTO590 על תאים הדנדריטים זקיקים, בעד 120 עומק מיקרומטר ב מרכזים נבטי של בלוטות לימפה popliteal (3 א ו 3 ב דמויות). בעוד מבנים כאלה אינם נראים לעין על ידי גישות TPLSM סטנדרטיות, אנו יכולים לזהות אותם באופן אישי ואפילו לדמיין את הדינמיקה שלהם באמצעות הגישה שלנו. 3E דמויות ו3F לתמוך בתובנה זו, מראים השוואה הישירה בין תמונת הקרינה 3D של פיקדונות תא חיסון במרכז נבטי כנרכש על ידי TPLSM הקונבנציונלי (מבוסס PMT-) וMB-SI-TPLSM. יתר על כן, יחסי הגומלין של הפיקדונות המורכבים חיסוניים במרכז נבטי תאי B יכול להיות מאוד נפתרו (3C דמויות ו3D; סרטי 1 ו -2) ועכשיו יכולים להיות שאניnvestigated בשילוב עם בדיקות פונקציונליות intravital עבור הפצה, בידול או אפופטוזיס. בשלב הבא, אנו נשתמש בגישה שלנו גם לחקור את התקשורת הדינמית של תאי B נבטי עם תאי T מסייע, מאמינים כי היא מהווה תופעה המכרעת האחרות לבחירה משובט תא B באיברים הלימפה משניים.

איור 1
.. איור 1 עיקרון והתקנה של לייזר מיקרוסקופ סריקה רב קורה עם פסי תאורת שני הפוטונים קרן Ti פעמו-FS מתכונן: לייזר Sa (טווח אורכי גל 690-1,080 ננומטר, 140 80 MHz fsec,) הוא נחלש על ידי מודול עשוי מצלחת λ / 2 ומקטב סרט דק, קטניותיה precompressed במודול GVD-תגמול מבוסס מנסרה ולבסוף התפצלו ל2, 4, 8, 16, 32, או 64 קורות,יוצר קו beamlet. יש שני beamlets רצוף בתוך הקו קיטובים מאונכים (שכותרתו האדומה וירוק בשורת beamlet) ומועברים בזמן על מנת למנוע הפרעה. בזמן המשמרת בין שני beamlets רצוף מסתכמת ב 3 psec. לרכישת תמונה, קו beamlet הוא לתוך המדגם ממוקד על ידי עדשה אובייקטיבית (עדשת 20X טבילה במים אובייקטיבית, NA 0.95, WD 2 מ"מ) וניצב סרוק, כך שדפוס תקופתי מוגדר היטב שנוצר. דפוס זה מתורגם לאורך קו beamlet. הסדרה של תמונות שנוצרה בדרך זו מתגלה דרך מסנני הפרעות רכובים על גלגל לסנן ידי מצלמה EM-CCD ולבסוף הוערכה על ידי אלגוריתם מינימום מקסימום. TPLSM חד הקרן מבוססת על PMT איתור בוצע עם אותו מיקרוסקופ. במקרה זה, השתמשנו רק אחד קרן לייזר כדי לסרוק את המדגם, ואנחנו ספקטרלית פתרנו את אות הקרינה עם מראות מקבילה dichroic ומסנני הפרעות לפני לזהותing אותו עם צינורות מכפיל. לחלופין, במקום Ti:. קרן לייזר Sa, הקרן של מתנד פרמטרים אופטיים יכולה להיות יחד למיקרוסקופ כדי לבצע אורך גל ארוך MB-SI-TPLSM אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. רזולוציה מרחבית של TPLSM פסי תאורה רבת קרן בהשוואה לTPLSM מבוסס CCD מבוסס PMT וmultifocal הסטנדרטי. (א) פרופילים צירי נציג כמו גם XY ותחזיות XZ של SHG בסיבי קולגן ב100 עומק מיקרומטר בתוך הלימפה צומת. lexc = 900 ננומטר, אורכי גל נעים איתור 447 ± 30 ננומטר, שטף פוטון Φ = 4.75 x 10 2 סנטימטר · שניות. (ב) חרוזים fluorescing צהובים ירוקים המשובצים בagarose כפי שנרשם על ידי MB-SI-TPLSM וTPLSM הקונבנציונלי (SB-PMT). λ exc = 850 ננומטר, אורכי גל נעים איתור 525 ± 25 ננומטר, שטף פוטון Φ = 2.08 x 10 29 פוטון / 2 סנטימטר · שניות, יחידת רשת = 3.7 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 הדמיה Intravital של מרכזים נבטי על ידי MB-SI-TPLSM (א) תמונת הקרינה 3D של אזור האור של מרכז נבטי שכותרתו על ידי CD21/35-Fab-ATTO590 (אדום) בעכבר שחוסנו עם haptene -.. Γ העוף -GLobulin (NP-CGG) לאחר העברת מאמצת של B1-8 EGFP + תאי B (ירוק). הפיקדונות חיסוניים המורכבים (תיוג CD21/35) בתאי זקיקים דנדריטים (FDC) ניתן דמיינו בנפרד, כפי שנצפו בזום-in (ב) לתמונה (א), ויש להם ממדים (שניהם לרוחב וצירי) ב מגוון 400-800 ננומטר בעד 120 עומק מיקרומטר. המרכז נבטי תאי B בEGFP B1-8 המחוסנים + העכבר מזוהים (ג), ואילו אנשי הקשר (ד) אחראים באופן חלקי להבשלה של התגובה החיסונית יכול עכשיו גם להיות דמיינו. λ exc = 850 ננומטר, אורכי גל נעים איתור 605 ± 20 ננומטר (ATTO590) ו525 ± 25 ננומטר (EGFP), שטף פוטון Φ = 7.05 x 10 פוטון 28/2 סנטימטר · שניות. סרגל קנה מידה () 20 מיקרומטר, (ב) 10 מיקרומטר, (ג) 30 מיקרומטר, (ד) 10 מיקרומטר. תמונות הקרינה 3D של אותו האזור בתוךאזור אור של מרכז נבטי שכותרתו על ידי CD21/35-Fab-ATTO590 כפי שנרשם על ידי MB-SI-TPLSM (ה) וקונבנציונלי TPLSM (מבוסס PMT) (ו), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

כיתובי סרט

סרט-1 ו -2

דינמיקה של פיקדונות חיסוניים מורכבים בתאים דנדריטים זקיקים משניים (FDC) והאינטראקציה שלהם עם מרכז נבטי תאי B כפי שנרשם על ידי MB-SI-TPLSM. הפיקדונות המורכבים חיסוניים מסומנים על ידי CD21/35-Fab-ATTO590 (אדום) ואילו במרכז נבטי התאים B הם B1-8 Jk - / - EGFP תאים + (ירוק).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה של הדמיה אופטית intravital היא דינמי ופונקציונלי כדי להמחיש תנועתיות ואינטראקציות הסלולר על מנת להבין רקמות ותפקוד איברים בבריאות ובחוליים 5. טכנולוגיה רבת עוצמה ביותר להשגה, מיקרוסקופית לייזר סריקה רב פוטון זה, עדיין יש להתגבר על מגבלות הקשורות לנופף עיוותים קדמיות, פיזור, רכישה איטית, photobleaching וניזקים, המגבילים את הרזולוציה המרחבית שלו, בניגוד, כמו גם ברזולוציה הזמן שלה .

ישנם שני פתרונות מוצלחים כדי להשיג עירור טוב יותר (ופליטה) ניהול פוטון בניגוד מוגבר (עלה יחס אות לרעש, בשל אות מוגברת), ולכן photobleaching מופחת, וניזקים שמובילות להחלטות מרחבית טובות יותר רקמות עמוקות, : הגישות אדפטיבית אופטיקה והשימוש באורכי גל עירור ארוך יותר - עירור אינפרא אדום מתכונן 6. בעשור האחרון, את הקונספט של Corre חזית הגלction ידי אופטיקה אדפטיבית הועבר מאסטרונומיה להדמיה ביו האופטית וגם למיקרוסקופיה רב פוטון. בעוד אופטיקה אדפטיבית הראשונה מתקרבת לשני הפוטונים במיקרוסקופ הסתמך על חישת חזית גל וצורך התייחסות subdiffraction, כלומר "כוכב מדריך", בדומה לאסטרונומיה, המערכות הנוכחיות מתאימות יותר להדמית רקמות עמוקות 12. לדוגמא, הם משתמשים קוהרנטיות-gating של קרינת העירור לחזית גל חישת 13,15, או שהם לא משתמשים בכל חישת חזית גל חיצונית בכלל, אבל לפתח אלגוריתמי הסתגלות מבוססים גם על מתאם צולב של תמונות לאחר תלמיד פילוח 17 או בחיפוש סטוכסטיים איטרטיבי של הפרמטרים אידיאליים וההפרעות הבאות עם התמונה שלא תוקנה כפי שמתקבלים מהצעד איטרציה הקודם - IMPACT 16, או שהם משתמשים ב- אקוסטיקה לאפיין את עיוותי חזית גל והשפעות פיזור 20. ובכל זאת, בשל ציוד ק משתנה מאודאינדקס פעיל ברקמות, גישות אופטיקה אדפטיבית הן איטיים למדי, שכן צעד התיקון יש צורך לחזור לשטחים קטנים יחסית (כ 10 x 10 מיקרומטר 2) 16. בנוסף, בין אם על ידי חזית גל או תיקון אפקט פיזור, ברזולוציה מרחבית השגה המקסימום עדיין מוגבלת על ידי עקיפה.

הגישה שלנו היא מסוגל להתגבר באופן חלקי את הנטל של סטייה חזית גל ושל פיזור, אלא גם דוחפת את הרזולוציה מעבר לגבול ההשתברות. שימוש בעדשות אובייקטיביות עם צמצם מספרי גבוה יותר, הערכים מוחלטים לרזולוציה צירית עשויים לשפר סביב 400 ננומטר 20. המחיר לרזולוציה המשופרת הוא דעיכה תלולה יותר של יחס אות לרעש ברקמות עמוקות בהשוואה לTPLSM הקונבנציונלי. זאת בשל הצורך להשתמש בזיהוי שדה בMB-SI-TPLSM. כפי שניתן לראות לפני 15, השימוש בגלאי שדה במקום גלאי נקודה מזוהה עם הדעיכה תלולה הזה של יחס האות לרעש duדואר לפיזור החזק של אור הנפלט שהוא רלוונטי רק לגילוי שדה. לכן, עומק ההדמיה המרבי לשיטות TPLSM איתור שדה הוא כ. 25% מופחתים לעומת TPLSM הקונבנציונלי (כלומר, זיהוי נקודת בסיס). פתרון מעשי פשוט הוא ליישם את עירור באורכי גל ארוך יותר ולזהות אורכי גל פליטה ארוכים יותר. באופן טבעי, זה משפר את יחס האות לרעש העומק תלוי בTPLSM הקונבנציונלי באותה המידה כמו בMB-SI-TPLSM.

ככל מהירות הרכישה היא מודאגת, MB-SI-TPLSM מוגבל רק על ידי המהירות של סורק galvanometric ו / או על ידי הקריאה מתוך המצלמה ורווחים של פיצול הקרן לקרן לייזר 32 מאפשרת. לעומת TPLSM מבוסס מצלמה רב קרן הרגילה, MB-SI-TPLSM הוא מעט איטי בשל הצורך לא רק כדי לסרוק, אלא גם לרכישה באופן סינכרוני כל של כ. 10 פסים מוארים תמונות כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה הסופית. עם זאת, הטכניקה שלנו שומרת על CLיתרון אוזן מהירות מעל TPLSM הקונבנציונלי (המבוסס על סריקה חד קרן ואיתור נקודה). לפיכך, זמן רכישת (פיקסל 512 x 512) 150 x 150 מיקרומטר 2 הוא 841 msec באמצעות TPLSM הקונבנציונלי (תדר סורק 800 הרץ) ו109 msec באמצעות MB-SI-TPLSM. ובכך, את כוח העירור לכל קורה ולהתעכב הזמן לכל פיקסל הוא זהה בשני קונבנציונלי וMB-SI TPLSM, כך שהאות היא דומה לשני ההגדרות. כפי שהוכח בעבר 20, photobleaching ואפקטי נזקי בניסויי MB-SI-TPLSM נמוכים ודומים לTPLSM הקונבנציונלי מבוצע היטב.

בעתיד זה יהיה רצוי לשלב גישות המשלימות של הסתגלות אופטיקה ופסי תאורה בטווח אינפרא אדום לשיפור TPLSM intravital, בדומה להישגים באופטיקה מסתגלת למובנה תאורה 21 נוסף. עם זאת, על מנת להשיג מטרות אלה, גישות משמעותית מהר יותר אדפטיבית אופטיקהחייב להיות מפותח.

ההשפעה הגבוהה הצפויה של הגישה עם פסי התאורה למדעי חיים וביו טמונה ביכולתה לשפר את הרזולוציה ולשפר את הניגוד ברקמות עמוקות, מנטרלת עיוות חזית גל ופיזור אפקטים, אלא גם הולך מעבר לגבולות העקיפה במיקרוסקופי לייזר לסריקת, על ידי פשוט שליטה על תהליך הסריקה ובחירת גלאי שדה כראוי רגיש.

ההשפעה הגבוהה הצפויה של הגישה עם פסי התאורה למדעי חיים וביו טמונה ביכולתה לשפר את הרזולוציה ולשפר את הניגוד ברקמות עמוקות, מנטרלת עיוות חזית גל ופיזור אפקטים, אלא גם הולך מעבר לגבולות העקיפה במיקרוסקופי לייזר לסריקת, על ידי פשוט שליטה על תהליך הסריקה ובחירת גלאי שדה כראוי רגיש.

הגישה עם פסי התאורה יכולה להיות מיושמת על im רקמות עמוקות intravitalהזדקנות בכל הסריקה מיקרוסקופי לייזר שני פוטונים המסוגלים לסנכרן זיהוי מצלמה עם תנועת galvoscanner בסריקה חד קרן. במקרה זה, הפסים בודדים בתוך דפוס העירור נוצרים לאחר מכן ולא בו זמנית כמו בMB-SI-TPLSM. באמצעות סריקת קרן אחת בSI-TPLSM באופן טבעי אנו מצפים רכישה בשיעור מעט איטי יותר של תמונות הקרינה בהשוואה לTPLSM הקונבנציונלי (סריקת קרן אחת, TPLSM מבוסס גלאי נקודה) אבל באותו השיפור ברזולוציה וניגודיות מרחבית כפי שמודגם לMB- SI-TPLSM. מהירות הרכישה הנמוכה יחד עם המגבלה בעומק הדמיה מצמצמת באופן משמעותי את טווח היישום של חד קרן SI-TPLSM לעומת MB-SI-TPLSM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

וולקר Andresen הנו בעל מניות של LaVision יוטכנולוגיים GmbH, בילפלד, גרמניה. אין לי מחברים האחרים כל ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לר 'Heintzmann לדיונים פוריים במהלך הפיתוח של הגישה עם פסי התאורה, ק Rajewsky וא' הברמן למתן עכברים הטרנסגניים C57BL / 6 B1-8-GFP. אנו מכירים Forschungsgemeinschaft דויטשה תחת מענק NI1167/3-1 (לRN), HA5354/4-1 וSFB633, A15 פרויקט (לAEH), שריטה תחת מענק מלגת רחל הירש (לRN) לתמיכה כספית. אנחנו בעיקר מכירים את הרשת ג'ימי לדיונים פוריים ותמיכה תשתיתית

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  2. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, (3), 424-436 (2010).
  3. Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475, (7357), 514-518 (2011).
  4. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, (5), 655-667 (2007).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  6. Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98, (4), 715-723 (2010).
  7. Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461, (7267), 1069-1070 (2009).
  8. Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63, (4), 429-437 (2009).
  9. Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (17), 6390-6393 (2012).
  10. Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335, (6068), 551 (2012).
  11. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
  12. Gu, M. Advanced optical imaging. Springer Verlag. Berlin. (2001).
  13. Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15, (4), (2010).
  14. Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
  15. Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93, (7), 2519-2529 (2007).
  16. Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
  17. Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (22), 8434-8439 (2012).
  18. Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
  19. Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9, (11), 3883-3889 (2009).
  20. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7, (12), (2012).
  21. Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16, (13), 9290-9305 (2008).
מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז'רמינל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter