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Immunology and Infection

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti.

Abstract

Monitoraggio della comunicazione cellulare da intravital tessuto profondo microscopia multi-fotone è la chiave per comprendere il destino delle cellule immunitarie all'interno di campioni di tessuti spessi e gli organi in salute e malattia. Controllando il modello di scansione in microscopia multi-fotone e l'applicazione di algoritmi numerici appropriati, abbiamo sviluppato un approccio strisce-illuminazione, che ha consentito di ottenere 3 volte migliore risoluzione assiale e miglior rapporto segnale-rumore, cioè contrasto, in più di 100 micron di profondità il tessuto all'interno altamente dispersione del tessuto degli organi linfoidi rispetto allo standard di microscopia multi-fotone. La velocità di acquisizione nonché effetti Fotodecolorazione e fotodanneggiamento erano simili alla tecnica basata fotomoltiplicatore standard, mentre la profondità di immagine era leggermente inferiore a causa dell'uso di rilevatori di campo. Utilizzando l'approccio strisce-illuminazione, siamo in grado di osservare le dinamiche dei depositi complessi immuni sulle cellule follicolari dendritiche secondarie ̵1; sul livello di alcune molecole proteiche in centri germinativi.

Introduction

Due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM), con i suoi vantaggi per l'imaging dei tessuti profondi relativi a infrarossi ultra-short di eccitazione impulsiva 1, ha rivoluzionato il nostro punto di vista sui processi vitali a livello di singola cellula rivelando motilità e l'interazione di vari modelli sottopopolazioni di cellule negli animali viventi 2-5. Tuttavia, la tecnologia attuale è ancora insufficiente a chiarire i meccanismi di funzionamento degli organi e disfunzioni come prerequisito per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, in quanto rende solo informazioni sparse sulle basi molecolari della risposta cellulare all'interno dei tessuti nella salute e nella malattia. La tecnologia attuale permette solo una finestra spaziale di poche centinaia di micron dovuta alla dispersione ed effetti di distorsione d'onda anteriori risoluzione spaziale e rapporto segnale-rumore 6, che sono particolarmente evidenti nel tessuto altamente compatto di animali adulti. Questi effetti di distorsione anteriori di scattering e onda sono dovute ad un un ambiente altamente eterogeneod anisotropo distribuzione dell'indice di rifrazione in tessuto, che porta in un primo passo per una profondità dipendente deterioramento della risoluzione spaziale 3D e infine alla perdita totale del segnale proveniente dai fotoni di eccitazione balistici, cioè la perdita di rapporto segnale-rumore. In termini di bioscientific e applicazioni biomediche tessuti profondi, questo significa che la tecnologia attuale è in grado di rivelare inequivocabilmente comunicazione cellulare perché scarsa risoluzione comporterebbe interazioni falsamente positivi mentre la riduzione del rapporto segnale-rumore causerebbe il sistema trascurare alcuni interazioni tra strutture dim.

Per rilevare inequivocabilmente interazioni cellulari in modo dinamico, una risoluzione spaziale elevata è necessario migliorare la profondità all'interno del tessuto. Le potenti tecniche nanoscopia attualmente introdotte sulla base di algoritmi numerici particolari, ad esempio approcci struttura illuminazione, sulla deplezione del primo stato eccitato, ad esempio ad esempio dSTORM, PALM, hanno trovato numerose applicazioni in cellule fissate e in colture cellulari Live 7. Tuttavia, al fine di estendere queste applicazioni per sezioni di tessuto, tessuto vivente e organismi abbiamo ancora bisogno di superare le gravi difficoltà tecniche. Eccitazione a due fotoni STED con differenti lunghezze d'onda e con una singola lunghezza d'onda (sw2PE-STED) per eccitazione e di emissione stimolata è stata applicata per migliorare la risoluzione laterale in fettine cerebrali 8 o artificiali in matrici di celle incorporate 9, rispettivamente, allo stesso risoluzione assiale TPLSM standard. Utilizzando un fotone STED, le dinamiche di spine dendritiche potrebbero essere esposte alla superficie della corteccia cerebrale (fino a 10-15 micron di profondità) in un topo vivente Thy1 EGFP con una risoluzione di 67 nm 10. Uno strumento versatile per la biologia dello sviluppo è fornito dalla multifocale microscopio strutturato-illuminazione, che fornisce duplice migliorato 2Drisoluzione. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata solo in organismi con una bassa propensione di diffusione della luce come embrioni di pesce zebra 11. Tuttavia, nessuna di queste tecniche può essere applicata nel tessuto altamente dispersione di animali adulti in diverse centinaia di micrometri, che sono modelli cruciali per la ricerca biomedica e clinica delle malattie con insorgenza dopo la nascita.

Indipendentemente dal approssimazione utilizzato per calcolare la forma del fronte d'onda a diffrazione limitata, cioè la funzione del punto di diffusione (PSF), dopo la focalizzazione attraverso una lente, la larghezza della PSF lungo l'asse ottico (risoluzione assiale) è almeno tre volte più grande la larghezza PSF perpendicolare all'asse ottico (risoluzione laterale) 12. Onda distorsioni anteriori dei diversi ordini quantificati mediante coefficienti di Zernike modificato notevolmente la forma del fronte d'onda dell'onda elettromagnetica focalizzata nella rappresentazione del tessuto profondo che porta a molto più grandi PSF, specialmente lungo l'otticaal all'asse 13-15. Quindi, entrambe le leggi di diffrazione e gli effetti di distorsione del fronte d'onda indicano la risoluzione lungo l'asse ottico come il fattore limitante nella rappresentazione dei tessuti profondi. Considerando che le tecniche nanoscopia si concentrano sulla lotta contro i limiti di diffrazione solo, è necessaria una tecnologia che migliora la risoluzione assiale e il contrasto contrastando sia la diffrazione ed effetti di distorsione delle onde-front per imaging ad alta risoluzione intravitale. Idealmente, questa tecnica dovrebbe essere anche abbastanza veloce per consentire il monitoraggio delle dinamiche cellulari.

La correzione in tempo reale di aberrazioni di FPF e la perdita di contrasto utilizzando ottiche adattive in TPLSM è stato ampiamente studiato e migliorato negli ultimi dieci anni 13,14,16-18 ed è quindi la scelta migliore attualmente disponibile che porta ad una migliore gestione dell'eccitazione balistico Fotoni 14. Ancora, a causa del fatto che la maggior onda correzione anteriore approcci utilizzati in ottica adattiva sono iterativo e che ettarove essere ripetuto per piccole aree (pochi 10 x 10 micron 2) a causa dell'elevata eterogeneità dell'indice di rifrazione nel tessuto, la velocità di acquisizione è significativamente inferiore a quello necessario per la motilità cellulare imaging e comunicazione. Inoltre, il limite fisico in adattativi ottica migliorata TPLSM è ancora determinato dalla diffrazione.

Modulazione spaziale di illuminamento (SPIN) e modulazione temporale sul lato rivelazione (SPADE) sono stati teoricamente proposto da applicare alla microscopia a scansione laser per migliorare la risoluzione. La loro applicazione pratica nel campo dell'imaging intravitale resta da dimostrare 19.

Presi insieme, vi è una forte domanda per lo sviluppo di tecnologie che migliorano la risoluzione per l'imaging del tessuto profondo nel vivere animali adulti. In questo lavoro, raggiungiamo la modulazione spaziale del modello di eccitazione controllando il processo di scansione in multi-beam strisce-illuminazione multi-fotone laser-smicroscopia conserviera (MB-SI-MPLSM) 20. Contrariamente agli approcci illuminazione strutturati, in cui la sezione di eccitazione traversa è spazialmente modulata, usiamo solo il processo di scansione per ottenere la modulazione spaziale della eccitazione. Espandendo l'eccitazione di una lunghezza d'onda, siamo in grado di migliorare sia la risoluzione spaziale e rapporto segnale-rumore in tessuto profondo fortemente diffondenti di tessuto (per esempio linfonodi, cammino libero-dispersione 47 micron 6), indipendentemente dalla ottica segnale non lineare si rileva, ad esempio, fluorescenza, generazione di seconda armonica o altra frequenza di miscelazione fenomeno. Usando questo approccio a lunghezze d'onda di eccitazione fino a 900 nm, possiamo dinamicamente immagine strutture proteiche cellulare su scala di poche molecole in centri germinali dei linfonodi del mouse. Così, si può visualizzare meglio l'interazione tra unità di antigene trasportano sulla superficie delle cellule follicolari dendritiche e cellule B nel processo di tastatura antiGen durante la risposta immunitaria in organi linfoidi secondari.

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Protocol

Impostazione Multi-beam per Striped-illuminazione TPLSM

L'installazione utilizzato qui è un multi-fascio a due fotoni microscopio a scansione laser specializzato, come descritto in precedenza 6,20. Il sistema è illustrato nella Figura 1. L'approccio può essere applicato ad altri microscopi scansione laser a due fotoni, che sono in grado di sincronizzare l'acquisizione telecamera con il movimento degli specchi galvoscanner, anche se sono solo in grado di eseguire la scansione monotrave . In questo caso, lo svantaggio sarà una velocità di acquisizione più basso, ma simile alla velocità di acquisizione in TPLSM basato PMT standard. Al fine di ottenere una qualità ottimale per quanto risoluzione e contrasto sono interessati, al photobleaching più basso e fotodanneggiamento e l'acquisizione più veloce, è consigliabile prendere in considerazione le seguenti fasi di regolazione del setup:

  1. Controllare la potenza del laser del laser Tisa: controllare al 100%, confrontare con i valori originali di fabbrica e previonoi possediamo letture e usarlo come è se è necessario una lunghezza d'onda di eccitazione nell'intervallo 700-1.000 nm.
  2. Testare l'indicazione telecomando per la Ti: Sa beam splitter, cioè controllare 0% e le impostazioni 100%. Se c'è una trave Tisa restante al 100%, quindi controllare e ripristinare la posizione nullo motore passo-passo. Il Ti: Sa beam splitter è costituito da un λ / 2 piastra di ordine e un polarizzatore, che divide i raggi laser perpendicolarmente polarizzate su percorsi ottici perpendicolari: uno è diretto nel microscopio per l'eccitazione, l'altra è usata per pompare l'parametrico ottico oscillatore (OPO). Ruotando automaticamente la piastra λ / 2, una regolazione continua del Ti: Sa e potenza OPO, rispettivamente, si ottiene.
  3. Regolare la OPO alla lunghezza d'onda desiderata e misurare la potenza di uscita. Se la potenza è troppo bassa (con un 4 W Ti: Sa laser a 800 nm, si dovrebbe essere in grado di ottenere 0,8-1 W del fascio di OPO a circa 1,050-1,100 nm) ottimizzare la lunghezza d'onda di pompaggio e controllare le impostazioni del secoloe specchio e del cristallo ventaglio. Scegli i loro valori raccomandati ottimali, spesso disponibili come grafici o diagrammi, e poi perfezionare fino al OPO risuona in uscita lunghezza d'onda desiderata e la potenza aumenta.
    1. Se la potenza è ancora bassa, regolare i due specchi accessibili della OPO con le quattro manopole specchi a regolazione accessibili. Fare questo passo molto lentamente e in movimenti molto piccoli, alternando gli specchi anteriori e finale.
  4. Controllare che il Ti: Sa e / o OPO travi colpire gli specchi d'ingresso al proprio, posizione centrale.
    1. Usare un pezzo di carta bianca (non molto lucido o riflettente!) E un visualizzatore ad infrarossi per osservare il fascio OPO e maggiore lunghezza d'onda Ti: Sa travi.
      1. Quando si lavora con NIR Ti Indossare occhiali protettivi: travi Sa (di solito fino a 720-750 nm è visibile per la persona media).
    2. Impostare la potenza del laser (s) più basso possibile per la procedura di allineamento in modo da MInimize potenziali danni agli occhi.
    3. Tenere sempre le luci ambientali della stanza, in modo che la pupilla dell'occhio è ristretto.
    4. Tenete a mente che la potenza del laser è bene-controllata da attenuatori costituiti da una piastra e polarizzatori λ / 2, che non sono ancora in vigore quando il Ti: Sa raggio entra nella scansione testa!
  5. Verificare che il diaframma punto di ingresso viene colpito al centro del Ti: Sa e / o OPO fascio; se non, regolare gli ultimi due specchi prima che il raggio laser entra nella testa di scansione.
    1. Utilizzare il visualizzatore IR e un piccolo pezzo di bianco (ma non lucido / riflettente!) Carta.
    2. Chiudere sempre il diaframma all'ingresso nel microscopio, in modo che la posizione del raggio laser può essere giudicato più precisamente. Importante: Non dimenticare di riaprire il diaframma prima di procedere al punto 6!
  6. Regolare il laser percorso fascio di luce riflesso nel microscopio di conseguenza. Fate questo in piccoli segmenti ed eseguire iterativo fascio-walking.
    1. Controllare l'intera luce-percorso se la luce emessa dalla lente obiettivo non è adeguata.
    2. Controllare sempre il percorso della luce quando si utilizza il sistema per la prima volta dopo un lungo periodo di inattività, una riparazione, sostituzione di elementi ottici, o se i problemi sono sospettati di esistere con l'uscita.
  7. Assicurarsi che tutte le superfici ottiche attive sono pulite, soprattutto che essi siano privi di polvere! Se le superfici sono ricoperte da uno strato di polvere, il fronte d'onda è distorto anche prima di entrare nella lente obiettivo e il fascio laser risultante sarà mai fornire un'immagine nitida del campione!
    1. Se necessario, pulire gli specchi con un pezzo di carta piegato lente, inumidito con etanolo o isopropanolo.
  8. Verificare che il fascio arriva indietro verso lo specchio che si trova direttamente sopra lo specchio registrazione al termine del compressore di impulsi basato prismatica, dopo il percorso ottico è impostato. Da qui, il raggio viene riflesso into il multiplexer trave (BM).
  9. Verificare se il raggio laser colpisce la membrana che si trova all'ingresso del multiplexer fascio, direttamente prima piastra λ / 2, cambiando la polarizzazione del fascio laser per soddisfare i requisiti per una larga banda di trasmissione 50% e il 50% di riflessione all'interno del BM.
    1. Innanzitutto, chiudere il diaframma in modo che la posizione del raggio può essere giudicata con maggiore precisione ed eseguire longheroni tra i due diaframmi, cioè quello in ingresso nel microscopio e l'altra all'ingresso BM. Per gli altri microscopi a scansione a singolo raggio del diaframma dovrebbe essere situato presso l'ingresso nel xy-scanner.
    2. Se il raggio non colpisce il centro dell'apertura chiusa a tendina regolare lo specchio sopra indicati, posto direttamente prima dell'entrata diaframma BM. Importante: Non dimenticare di riaprire il diaframma prima di procedere al punto 10.
  10. Con il diaframma riaperto, controllare se il raggio laser colpisce gli specchi BM inloro punto mediano. Utilizzare una stretta striscia di carta in modo da non bloccare un'altra parte del complesso luminoso percorsi del BM!
  11. Controllare se il raggio colpisce la metà degli specchi di uscita: specchio migliore per polarizzazione parallela "P", specchio di fondo per perpendicolare polarizzazione "S". In caso contrario, regolare lo specchio entrata prima del BM.
  12. Controllare se la "S" e "P" fascio polarizzato consente gruppi entrano nel cubo polarizzatore e si sovrappongono in modo appropriato al momento dell'entrata in xy scanner. Salta alla seguente procedura in caso di un microscopio a scansione a singolo raggio viene utilizzato.
  13. Controllare se la luce laser passa centralmente la scansione e le lenti di tubi e passa attraverso il centro della lente dell'obiettivo 'aereo per tornare focale. Importante: questo passaggio deve essere fatto con il fascio laser in posizione centrale, non in una posizione di parcheggio!
    1. Sostituire la lente obiettivo con uno strumento di puntamento ("occhio di bue") e verificare se il raggio laser colpisce il bersaglio nel mezzo, e se lal'illuminazione è ancora.
    2. Se questo sembra essere il caso, chiudere il diaframma prima della BM e verificare se viene visualizzato un modello di interferenza circolare, con un cerchio nero al centro (minima interferenza).
      1. Regolare lo specchio voce se c'è un cambiamento significativo rispetto al centro dell'occhio del toro.
  14. Ora di sostituire l'occhio del toro con un obiettivo, ad esempio con un obiettivo 20X immersione in acqua.
    1. Controllare la spia-campo di output con un pezzo di carta bianca. Questo deve essere brillante, uniforme e in posizione centrale.
    2. Misurare la potenza di uscita: al 100% OPO con il 100% di pompaggio Ti: Sa (4 W), si dovrebbe ottenere ca. 100-150 mW dopo la lente a 1.100 nm (nel microscopio utilizzato qui). Potenze laser inferiori non saranno sufficienti per l'esecuzione multi-beam SI-TPLSM. Per la scansione a singolo raggio SI-TPLSM, 5-10 mW sono sufficienti. Il raggio laser deve rimanere nella posizione centrale senza essere scanned!
  15. Se si esegue l'MB-SI-TPLSM, allineare gli specchi in BM come segue:
    1. Porre un campione omogeneo fluorescente, ad esempio una fluorescenza rosso diapositiva, sul palco e focalizzare il fascio laser all'interno del campione, ma vicino alla superficie superiore (cioè vicino alla lente 'anteriore dell'obiettivo).
    2. Impostare il microscopio per la modalità multi-beam e scegliere il numero di raggi, all'inizio, preferibilmente solo raggio, e la polarizzazione, ad esempio "P".
      1. Trovare il raggio laser da parte di imaging diapositiva fluorescente: impostare l'otturatore "P" aperto ed eseguire la camera CCD continuamente mentre la focalizzazione del fascio.
      2. Assicurarsi che il fascio è in posizione centrale, e che lo scanner sia spento. Assicurarsi che il fascio non viene scansionato!
      3. Trova il fascio cercando un punto luminoso vicino al centro del chip della fotocamera.
      4. Focalizzare il fascio fino a quando il punto è la più brillante e nitida, vale a dire il piano immagine dimicroscopio corrisponde alla posizione del chip telecamera; diminuire la potenza del laser in modo che il punto non è saturo. Con un sistema ben allineato ciò significa che la potenza del laser deve essere vicino minimo quando si lavora in modalità one-trave (circa 0,6 mW di potenza laser dovrebbe funzionare).
      5. Se il punto è significativamente fuori centro, avvicinarlo al centro, regolando lo specchio davanti al BM (o dello scanner per la scansione a raggio singolo).
      6. Quando si allinea anche l'altra polarizzazione, cioè "S" beam, ora passare alla modalità 2 raggi, aprire l'otturatore "S" e controllare la posizione del raggio (solo raggio si può vedere se solo l'otturatore "S" è aperto ).
      7. Al termine, passare alla modalità a 4 raggi e utilizzare la modalità "P" polarizzazione (shutter "P" aperta). Ora appariranno due beamlets.
      8. Disporre le due beamlets essere parallela perfettamente al bordo inferiore di vista della telecamera, e li al 2,8 micron a parte.
          Se essi non sono allineati correttamente, regolare il primo specchio del BM.
        1. Mai allineare la vite centrale, usa invece le due viti periferici per spostare lo specchio finché le due travi sono 2,8 um a parte e perfettamente disposti orizzontalmente.
      9. Ora passare alla modalità 8-fascio in polarizzazione "P", e regolare il secondo specchio BM (anche senza il punto rosso) fino le 4 beamlets sono equidistanti a 2,8 um, e sono disposti parallelamente al bordo inferiore dell'immagine.
      10. Ripetere in 16 - e la modalità a 32 fasci, regolando gli specchi BS 3 ° e 4 ° rispettivamente. E 'importante per i piccoli fasci di essere equidistante perché SI-algoritmi, il più semplice è l'algoritmo min-max (Hilo), si basano su questo presupposto.
  16. Sostituire il campione uniformemente fluorescente con uno eterogeneo strutturato, ad esempio cross-tinto radici Convallaria.
    1. Andare alla posizione di parcheggio del fascio di eccitazione, which è di solito collocato a grandi valori delle coordinate scanner, ad esempio (10.000, 10.000).
    2. Scansione un'immagine (multi-beam) con la camera CCD. Controllare che l'immagine appare nitida, uniforme e diritta.
    3. Regolare la fotocamera se l'immagine appare ruotata: ruotare il corpo macchina assialmente attorno all'asse verticale a mano (essere gentile!) Fino a quando l'immagine viene raddrizzata.
  17. Avviare xy scanner per controllare il processo di scansione per generare il modello di eccitazione, cioè immagine strisce.
    1. Nel caso di scansione a più raggi, spostare lo specchio y-scanner, cioè. perpendicolare alla linea beamlet, in modo tale da generare un'immagine a strisce quadratica.
    2. Se il campo visivo generato come descritto al punto 17.1. è troppo piccolo, estendere la routine di scansione spostando lo specchio x-scanner in posizione garantire che la linea di fascio-let viene raddoppiato e le beamlets equidistanti lungo tutta la linea. Ripetere l'esatto movimentodello specchio y-scanner dopo lo specchio x-scanner viene spostato per generare l'immagine strisce più grande.
    3. Nel caso di scansione a raggio singolo, alternare il movimento dello specchio y-scanner con x-scanner movimento dello specchio ripetutamente in posizioni equidistanti - definite dallo scienziato - per generare l'immagine strisce desideri.
    4. Assicurarsi di utilizzare per il movimento dello specchio y-scanner un comando di velocità costante (ridotta accelerazione / decelerazione) e per il x-scanner specchio uno alla velocità massima (massima accelerazione / decelerazione).
  18. Acquisire automaticamente e salvare l'immagine a strisce con la fotocamera (campo-detector). Pertanto, sincronizzare la fotocamera con lo scanner e utilizzare lo scanner come trigger master.
  19. Ripetere l'acquisizione di immagini a strisce (protocollo di scansione in cui al protocollo 17) spostando lo specchio x-scanner a posizioni differenti come segue:
    1. Scegli passi ripetizione a sufficienza e la lunghezza del passo adeguato tradue successive immagini di strisce per coprire la distanza tra due piccoli fasci consecutivi (in questo caso 2,8 micron e un passo degli specchi scanner uguale a 25 nm); può essere opportuno consentire un po sovrapposizione, cioè un ulteriore 0,3-0,4 micron.
    2. Impostare la x-shift a un valore che corrisponde al limite di risoluzione laterale alla lunghezza d'onda determinata. Come esempio, utilizzando 10 passi dello specchio x-scanner per turno e 12 o 13 turni comporta meglio sia assiali e laterali risultati risoluzione in questo sistema. Controllare con uno scivolo strutturato, per esempio Convallaria radici diapositiva, che i numeri funzionano meglio nel sistema in uso.
    3. Ottimizzare questi due valori finché l'immagine Convallaria diventa il più nitido: utilizzare lo strumento linea di profilo sulle immagini SI calcolate ed confrontare la larghezza dei profili delle righe (che è il segnale di fluorescenza da pareti cellulari Convallaria).
    4. Acquisire ogni immagine strisce sincronizzato con il movimento dello scanner e salvarlo separatamente, ad esempio,
  20. Aprire un set completo di immagini a strisce come matrici, ossia matrice 3D, nella routine di valutazione e utilizzare l'algoritmo min-max o un algoritmo a trasformata di Fourier per generare una matrice 2D del SI-immagine ad alta risoluzione. Gli algoritmi sono stati precedentemente descritti dettagliatamente 20.

Topi immunizzazione e preparazione per Imaging intravitale

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle commissioni nazionali appropriate per il benessere degli animali (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino) e sono state eseguite in conformità alle direttive e ai regolamenti (animale esperimento licenza G0153/08) attuali.

  1. L'induzione di una risposta centro germinativo nel linfonodo popliteo e preparazione del campo dell'imaging stata eseguita come descritto prima 4. Purificare cellule B immunomagnetically dalla milza di B1-8 + / +- / -e le cellule B di B1-8 + / +- / - GFP + topi.
  2. Iniettare per via endovenosa 3 x 10 6 cellule NP-specifiche B con una purezza> 95% con ⅛ B1-8 + / +- / - GFP + e ⅞ non fluorescente B1-8 + / +- / - in C57Bl / 6 destinatari .
  3. Un giorno dopo il trasferimento di cellule immunizzare i beneficiari con 10 microgrammi di NP-CGG (nitrofenil-pollo ɣ globulina) emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA) nella parte destra pad cibo posteriore.
  4. Etichetta Fab frammenti di anticorpi anti-CD21/CD35 con ester ATTO590-succinimidyl.
    1. Per evidenziare la rete di cellule follicolari dendritiche (FDC) all'interno del centro germinale in vivo, iniettare 10 mg di fluorocromi marcato Fab frammenti nel diritto zampa posteriore del mouse 12-24 ore prima di eseguire l'analisi intravitale.

Le seguenti operazioni devono essere considerosso per la preparazione del linfonodo popliteo per l'imaging intravitale (8-10 giorni dopo l'immunizzazione):

  1. Anestetizzare topo mediante iniezione ip di ketamina / xilazina, la quantità a seconda del loro peso.
  2. Testare riflessi per monitorare la profondità dell'anestesia durante l'intero periodo di imaging.
  3. Shave gambe, schiena e fianco destro del mouse rigorosa e usare la crema DEPILATORIO per eliminare i peli residui completamente.
  4. Fissare trocantere destro importante: individuare Chip ossuto con le dita, impostare una piccola incisione cutanea con le forbici fino a quando appare una piccola fascia a forma di triangolo bianco.
  5. Bloccare circuito osseo di sotto di questa fascia con una pinzetta a punta del dispositivo di immobilizzazione.
  6. Fissare la colonna vertebrale nella zona lombare con pinzette dentate.
  7. Fissare gamba destra posteriore sul restrainer e serrare la vite.
  8. Nastro coda per mantenere la gamba nella giusta posizione.
  9. Sul lato caudale della coscia, creare una incisione nella pelle, nella zona in cui dall'ente vena poplitea prominenters il tessuto, separare la pelle dal tessuto sottostante con le pinzette smussate e seguire la vena poplitea da prossimale a distale.
  10. Esporre il linfonodo utilizzando pinzette smussate, cercare di evitare il taglio al fine di proteggere le belle vasi linfatici (mantenere il linfonodo in PBS durante l'esposizione).
  11. Creare un cerchio di grasso per vuoto intorno al linfonodo, riempire questo pozzanghera con PBS.
  12. Mettere vetrino nella sua posizione e posizionare il termometro-sonda (mantenere la temperatura a 37 ° C, altrimenti la velocità varierà notevolmente).
  13. Lungo il bordo superiore del vetrino aggiungere un cerchio di grasso per vuoto.
  14. Mettere la bobina di riscaldamento nella sua posizione sul grasso per vuoto, crea una tenuta in un modo simile come prima e aggiungere acqua / PBS sul vetrino di vetro per immergere l'obiettivo in.
  15. Dopo l'imaging, il mouse viene tenuto in anestesia, aumentando le dosi di ketamina / xilazina ad una dose letale, seguita da dislocazione cervicale.

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Representative Results

Risoluzione spaziale nei linfonodi

Le dimensioni della funzione del punto di diffusione efficace (EPSF) corrispondono alla risoluzione spaziale di un microscopio 12. Abbiamo misurato questa funzione tre dimensionale acquisendo il segnale di seconda generazione armoniche di fibre collagene nei linfonodi dal nostro MB-SI-TPLSM rispetto alle stabiliti tecniche di microscopia a scansione laser a due fotoni, cioè TPLSM rilevamento di campo (mediante telecamere CCD) e TPLSM rilevazione del punto (mediante PMT).

Da queste misurazioni diventa evidente che alla superficie del campione, sia le risoluzioni laterali e assiali corrispondono ai valori attesi previsti dalla teoria di diffrazione 20. Tuttavia, con l'aumento della profondità di imaging e quindi con l'aumentare del cammino ottico sia di eccitazione e di emissione di radiazione attraverso mezzi altamente variabile con indice di rifrazione, la risoluzione spaziale deteriora considerevolmente, indedentemente del setup impiegato (Figura 2). By MB-SI-TPLSM abbiamo raggiunto, indipendentemente da profondità di immagini, di ca. 20% migliore risoluzione laterale e di risoluzione assiale 220% migliore rispetto agli approcci TPLSM standard.

Dinamica dei complessi immuni sulle cellule follicolari dendritiche nei centri germinali

La selezione clonale delle cellule B durante la risposta immunitaria, all'interno di organi linfoidi secondari di topi adulti è il primo passo sul loro modo di differenziarsi in cellule B di memoria o plasmacellule 4. In questo processo, l'interazione altamente dinamico tra cellule follicolari dendritiche (FDC) e cellule B a livello di strutture complesse immunitarie (raggruppamenti di alcune molecole proteiche) all'interno di centri germinativi si ritiene svolga un ruolo centrale. Solo utilizzando una tecnologia ad alta risoluzione microscopia intravitale è possibile sezionare la comunicazione cellulare e le sue implicazioni per la risposta immunitaria. Il nostro approccio di MB-SI-TPLSM fornisce per la prima volta la possibilità di intravitally visualizzare e quantificare le dimensioni dei cluster di depositi complessi immuni come etichettato da anti-CD21/35-Fab-ATTO590 sulle cellule dendritiche follicolari, fino a 120 micron di profondità centri germinali dei linfonodi poplitea (figure 3a e 3b). Mentre tali strutture non sono visibili da approcci TPLSM normali, potremmo identificare individualmente e anche visualizziamo le loro dinamiche utilizzando il nostro approccio. Figure 3e e 3f sosteniamo questa intuizione, mostrando il confronto diretto tra l'immagine di fluorescenza 3D di depositi di cellule immunitarie in un centro germinale come acquisita da TPLSM convenzionale (PMT-based) e MB-SI-TPLSM. Inoltre, le interazioni dei depositi di complessi immuni con centro germinale cellule B possono essere altamente risolti (figure 3c e 3d, filmati 1 e 2) e ora possono essere investigated in combinazione con sonde funzionali intravitale per la proliferazione, la differenziazione o apoptosi. In una fase successiva, useremo il nostro approccio per indagare anche la comunicazione dinamica delle cellule B germinali con le cellule T helper, che si ritiene costituiscano l'altro fenomeno decisivo per cellule B selezione clonale negli organi linfoidi secondari.

Figura 1
.. Figura 1 Principio e la configurazione del multi-beam strisce-illuminazione a due fotoni microscopio a scansione laser Il fascio di un sintonizzabile fs-pulsata Ti: Sa laser (lunghezza d'onda 690-1,080 nm, 140 fsec, 80 MHz) è attenuato da un modulo costituito da una piastra λ / 2 e un polarizzatore a film sottile, gli impulsi vengono precompressa in un modulo GVD-compensazione basata prismatica e infine divisi in 2, 4, 8, 16, 32, o 64 fasci,formando una linea beamlet. Due piccoli fasci consecutivi all'interno della linea hanno polarizzazioni ortogonali (etichettati rosso e verde in linea beamlet) e sono spostati nel tempo, al fine di evitare interferenze. Il time-shift tra due piccoli fasci consecutivi è pari a 3 psec. Per l'acquisizione di immagini, la linea beamlet è focalizzata nel campione da una lente obiettivo (20X immersione in acqua lente obiettivo, NA 0.95, WD 2 mm) e perpendicolarmente a scansione, in modo da generare un pattern periodico ben definito. Questo modello viene traslato lungo la linea beamlet. La serie di immagini generato in questo modo vengono rilevati attraverso filtri interferenziali montati su una ruota filtro da una telecamera EM-CCD ed infine valutati da un algoritmo minima e massima. TPLSM singolo raggio basato su PMT-rilevazione è stata effettuata con lo stesso microscopio. In questo caso, abbiamo utilizzato un solo raggio laser per la scansione del campione e vi spettralmente risolto il segnale di fluorescenza con specchi dicroici corrispondenti e filtri di interferenza prima di rilevarezione con tubi fotomoltiplicatori. In alternativa, invece del Ti:. Fascio laser Sa, il raggio di un oscillatore parametrico ottico può essere accoppiato al microscopio effettuare lunghezza d'onda MB-SI-TPLSM Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Risoluzione spaziale di multi-beam strisce-illuminazione TPLSM rispetto al TPLSM basato CCD standard PMT-based e multifocale. (A) i profili assiali Rappresentante nonché xy e le proiezioni XZ di SHG in fibre di collagene a 100 micron di profondità all'interno di linfa nodo. lexc = 900 nm, lunghezza d'onda di rilevamento spaziano 447 ± 30 nm, flusso di fotoni Φ = 4,75 x 10 2 · sec. (B) giallo-verde fluorescenti perle incorporati in agarosio registrata dagli MB-SI-TPLSM e TPLSM convenzionale (SB-PMT). λ = exc 850 nm, lunghezza d'onda di rilevamento vanno 525 ± 25 nm, flusso di fotoni Φ = 2.08 x 10 29 fotoni / cm 2 · sec, unità maglie = 3.7 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 immagini intravitale di centri germinali di MB-SI-TPLSM (a) fluorescenza immagine 3D della zona di luce di un centro germinale etichettato da CD21/35-Fab-ATTO590 (rosso) in un topo immunizzato con haptene -.. Γ pollo -globulin (NP-CGG) dopo il trasferimento adottivo di B1-8 EGFP + B cellule (verdi). I depositi di complessi immuni (etichettatura CD21/35) sulle cellule follicolari dendritiche (FDC) possono essere visualizzate singolarmente, come osservato nel zoom-in (b) dell'immagine (a), e avere dimensioni (sia laterali e assiali) nella gamma di 400-800 nm fino a 120 micron di profondità. Le cellule B del centro germinativo nel immunizzato B1-8 EGFP + Mouse vengono rilevati (c), mentre i contatti (d) in parte responsabili della maturazione della risposta immunitaria può ora anche essere visualizzati. λ = exc 850 nm, lunghezza d'onda di rilevamento vanno 605 ± 20 nm (ATTO590) e 525 ± 25 nm (EGFP), flusso di fotoni Φ = 7,05 x 10 28 fotoni / cm 2 · sec. Barra di scala (a) 20 pm, (b) 10 pm, (c) 30 um, (d) 10 micron. Immagini di fluorescenza 3D della stessa area all'interno dellazona di luce di un centro germinale etichettato da CD21/35-Fab-ATTO590 come registrato da MB-SI-TPLSM (e) e convenzionale (a base di PMT) TPLSM (f), rispettivamente. cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.

Movie didascalie

Movie-1 e -2

Dinamica dei depositi immuni complessi sulle cellule follicolari dendritiche (FDC) secondari e la loro interazione con centro germinale B Cells come registrato da MB-SI-TPLSM. I depositi complessi immuni sono etichettati da CD21/35-Fab-ATTO590 (rosso), mentre le cellule del centro germinativo B sono B1-8 Jk - / - + cellule EGFP (verde).

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Discussion

Lo scopo di imaging ottico intravital è di visualizzare dinamicamente e funzionalmente motilità e interazioni cellulari per comprendere tessuto e funzione degli organi in salute e malattia 5. Il più potente tecnologia per ottenere questo, multi-fotone microscopia a scansione laser, deve ancora superare le limitazioni relative a onda distorsioni anteriori, dispersione, acquisizione lenta, photobleaching e photodamage, che limitano la sua risoluzione spaziale, contrasto nonché la sua risoluzione temporale .

Ci sono due soluzioni di successo per ottenere una eccitazione migliore (e delle emissioni) gestione di fotoni in tessuto profondo che porta a migliori risoluzioni spaziali, maggiore contrasto (aumento del rapporto segnale-rumore, a causa di un aumento del segnale) e, quindi, fotoscolorimento ridotto e fotodanneggiamento : gli approcci adaptive-ottici e l'utilizzo di lunghezze d'onda di eccitazione più lunghi - sintonizzabile di eccitazione infrarossi 6. Negli ultimi dieci anni, il concetto di fronte d'onda corrispondentection da ottiche adattive è stato trasferito dall'astronomia alla rappresentazione bio-ottica e anche per la microscopia multi-fotone. Mentre la prima ottica adattiva si avvicina per la microscopia a due fotoni invocato sensing fronte d'onda e aveva bisogno di un riferimento subdiffraction, vale a dire una "guida stella", simile alla astronomia, i sistemi attuali sono più adatti al tessuto profondo di imaging 12. Ad esempio, usano la coerenza-gating della radiazione di eccitazione per il fronte d'onda di rilevamento 13,15, o non usano alcun rilevamento del fronte d'onda esterna a tutti, ma sviluppano algoritmi di adattamento basate o sulla correlazione incrociata delle immagini dopo pupilla Segmentazione 17 o sulla ricerca stocastica iterativa dei parametri ideali e conseguente interferenza con l'immagine non corretta in quanto ottenuti dalla precedente iterazione passo - IMPACT 16, o usano foto-acustica per caratterizzare le distorsioni del fronte d'onda e gli effetti di scattering 20. Ancora, a causa di un refr altamente variabileindice attiva nel tessuto, gli approcci ottica adattiva sono piuttosto lento, poiché il passo di correzione deve essere ripetuta per aree relativamente ridotte (circa 10 x 10 micron 2) 16. Inoltre, sia con fronte d'onda o correzione effetto di dispersione, la risoluzione massima ottenibile spaziale è ancora limitata dalla diffrazione.

Il nostro approccio è in grado di superare in parte gli oneri di aberrazione del fronte d'onda e di dispersione, ma anche la risoluzione spinge oltre il limite di diffrazione. Utilizzo di lenti dell'obiettivo con una maggiore apertura numerica, i valori assoluti per la risoluzione assiale può migliorare a circa 400 nm 20. Il prezzo per la risoluzione migliorata è un decadimento più ripido del rapporto segnale-rumore in tessuto profondo rispetto a TPLSM convenzionale. Ciò è dovuto alla necessità di utilizzare il rilevamento in campo MB-SI-TPLSM. Come mostrato prima del 15, l'uso di rilevatori di campo, invece di rilevatori puntiformi è associato a questo decadimento più ripido di SNR due alla dispersione maggiore di luce emessa, che è rilevante solo per il rilevamento di campo. Così, la profondità massima di imaging per il campo i metodi di rilevazione TPLSM è di ca. 25% di riduzione rispetto al convenzionale (cioè la rilevazione del punto based) TPLSM. Una soluzione pratica semplice è quella di applicare lunghezze d'onda di eccitazione più lunghi e di rilevare lunghezze d'onda più lunghe. Naturalmente, questo migliora il SNR profondità dipendente TPLSM convenzionale nella stessa misura come in MB-SI-TPLSM.

Per quanto riguarda la velocità di acquisizione è interessato, MB-SI-TPLSM è limitata solo dalla velocità dello scanner galvanometrico e / o dal-out lettura della telecamera e profitti del frazionamento fascio di 32 fascio laser consente. Rispetto allo standard multi-fascio basato su telecamera TPLSM, MB-SI-TPLSM è leggermente più lento a causa della necessità non solo per la scansione, ma anche di acquisire in modo sincrono ciascun ca. 10 strisce illuminate immagini per generare l'immagine finale ad alta risoluzione. Tuttavia, la nostra tecnica mantiene un clvantaggio di velocità all'orecchio sopra la TPLSM tradizionale (basato sulla scansione a singolo raggio e la rilevazione punto). Quindi, il tempo di acquisizione di una 150 x 150 micron 2 (512 x 512 pixel) è 841 msec utilizzando TPLSM convenzionale (frequenza di scansione di 800 Hz) e 109 msec con MB-SI-TPLSM. In tal modo, la potenza di eccitazione per fascio e il tempo di sosta per pixel sono uguali per entrambi convenzionale e MB-SI TPLSM, in modo che il segnale è comparabile per entrambe le configurazioni. Come già dimostrato 20, photobleaching ed effetti fotodanneggiamento negli esperimenti MB-SI-TPLSM sono bassi e paragonabili a ben eseguita TPLSM convenzionale.

In futuro sarebbe auspicabile combinare gli approcci complementari adattivo-ottica e strisce-illuminazione nella gamma degli infrarossi per migliorare ulteriormente TPLSM intravital, simile ai risultati ottenuti in ottica adattiva per strutturato illuminazione 21. Tuttavia, al fine di raggiungere questi obiettivi, approcci notevolmente più veloce adattivo-otticideve essere sviluppato.

L'alto impatto atteso dell'approccio strisce-illuminazione per le bioscienze e della biomedicina risiede nella sua capacità di migliorare la risoluzione e migliorare il contrasto in tessuto profondo, contrastare la distorsione del fronte d'onda e gli effetti di diffusione, ma anche andando oltre i limiti di diffrazione di microscopi laser-scansione, per semplicemente controllare il processo di scansione e la scelta di un rilevatore di campo opportunamente sensibile.

L'alto impatto atteso dell'approccio strisce-illuminazione per le bioscienze e della biomedicina risiede nella sua capacità di migliorare la risoluzione e migliorare il contrasto in tessuto profondo, contrastare la distorsione del fronte d'onda e gli effetti di diffusione, ma anche andando oltre i limiti di diffrazione di microscopi laser-scansione, per semplicemente controllare il processo di scansione e la scelta di un rilevatore di campo opportunamente sensibile.

L'approccio a strisce-illuminazione può essere applicato per intravital im tessuti profondiinvecchiamento in tutti i microscopi a scansione laser a due fotoni che sono in grado di sincronizzare rilevamento telecamera con il movimento galvoscanner nella scansione a raggio singolo. In questo caso, le strisce unico all'interno del modello di eccitazione sono generati successivamente e non simultaneamente come in MB-SI-TPLSM. Utilizzando la scansione singola trave SI-TPLSM abbiamo naturalmente aspettiamo un tasso leggermente più lento di acquisizione delle immagini di fluorescenza rispetto al TPLSM convenzionale (scansione fascio singolo, punto rivelatore a base TPLSM), ma la stessa miglioramento della risoluzione spaziale e di contrasto, come dimostrato per MB- SI-TPLSM. La velocità di acquisizione inferiore insieme con la limitazione in profondità di imaging riduce notevolmente il campo di applicazione del singolo raggio SI-TPLSM rispetto al MB-SI-TPLSM.

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Disclosures

Volker Andresen è azionista di LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Germania. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Ringraziamo R. Heintzmann per discussioni fruttuose durante lo sviluppo di un approccio strisce-illuminazione, K. Rajewsky e A. Haberman per fornire C57BL / 6 B1-8 GFP topi transgenici. Riconosciamo la Deutsche Forschungsgemeinschaft in concessione NI1167/3-1 (a RN), HA5354/4-1 e SFB633, A15 progetto (AEH), la Charité in concessione Rahel-Hirsch borsa di studio (per RN) per il sostegno finanziario. In particolare, ci riconosciamo la rete JIMI per le discussioni fruttuose e supporto infrastrutturale

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

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References

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Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal
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Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

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