Summary
Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.
Abstract
Intravital derin doku çoklu foton mikroskobu ile hücresel iletişimi izleme sağlığı ve hastalıkları, kalın doku örneklerinin ve organları içinde bağışıklık hücrelerinin kaderini anlamak için anahtardır. Çoklu foton mikroskopi tarama desenini ve uygun sayısal algoritmaları uygulayarak, biz daha iyi eksenel çözünürlük ve daha gelişmiş sinyal-gürültü oranı, yani kontrast, 3 kat elde etmemizi sağladı ki, bir çizgili-aydınlatma yaklaşım geliştirdi standart çok-foton mikroskopi ile karşılaştırıldığında son derece lenfoid organların doku saçılma içinde 100 mikron doku derinliği. Görüntüleme derinlik nedeniyle alan detektörlerinin kullanılması ile biraz daha düşük iken, toplama hızı hem de ışıkla ağartma ve fotohasar etkileri, standart foto çoğaltıcı dayalı tekniğe benzer. Çizgili-aydınlatma yaklaşımı kullanarak, ikincil foliküler dendritik hücreler üzerinde immün kompleks mevduat dinamiklerini gözlemlemek mümkün ̵1; germinal merkezlerinde bir kaç protein molekülünün bir seviyede.
Introduction
İki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM), kızılötesi ultra kısa atımlı uyarma 1 ilgili derin doku görüntüleme için avantajları ile çeşitli motilite ve etkileşim kalıplarını ortaya koyarak bir tek hücre düzeyinde hayati süreçleri hakkındaki görüşümüzü devrim yarattı hayvanların 2-5 yaşayan hücre alt. Ancak, mevcut teknoloji, sağlık ve hastalık dokuları içinde hücresel yanıtın moleküler temeli hakkında sadece seyrek bilgiler vermektedir beri, yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için bir ön koşul olarak organ fonksiyonu ve disfonksiyonu mekanizmaları aydınlatmak için hala yetersizdir. Mevcut teknoloji saçılma nedeniyle birkaç yüz mikron sadece bir mekansal pencere açar ve mekansal çözünürlükte ve yetişkin hayvanların son derece kompakt dokusunda özellikle ortada sinyal-gürültü oranı 6, üzerinde ön distorsiyon etkileri dalga. Bu saçılma ve dalga ön distorsiyon etkileri oldukça heterojen An nedeniyle3 boyutlu uzamsal çözünürlük bir derinliğe bağlı bozulması için bir birinci aşamada dokularda kırılma indeksi d anizotropik dağıtım ve son balistik uyarılma fotonlarının, sinyal-gürültü oranı yani kaybından kaynaklanan sinyalin toplam kaybına bağlanmıştır. Bioscientific ve biyomedikal derin doku uygulamaları açısından, bu sinyal-gürültü oranının azalması sistemi bazı ardı neden olur oysa düşük çözünürlük yalancı pozitif etkileşimlerin yol açacak, çünkü mevcut teknoloji tümden hücresel iletişimi ortaya çıkarmak için mümkün olduğu anlamına gelir Loş yapılar arasındaki etkileşimler.
Net bir şekilde dinamik bir şekilde hücresel etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük derin doku içinde gereklidir. Örneğin özel sayısal algoritmalar, ilk uyarılmış durum incelmesi örneğin yapısı-aydınlatma yaklaşımlar, dayalı anda tanıtıldı güçlü nanoscopy teknikleri örneğin dSTORM, PALM, sabit hücrelerin yanı sıra canlı hücre kültürlerinde 7'de birçok uygulama bulduk. Ancak, doku bölümleri, canlı doku ve organizmalar için bu uygulamaları genişletmek için biz hala ciddi teknik zorlukların üstesinden gelmek gerekir. İki foton uyarma farklı dalga boylarına sahip hem de uyarma için, tek bir dalga boyunda (sw2PE-STED) ile STED ve emisyon aynı anda sırasıyla gömülü hücrelerin 9, beyin dilimleri 8 ya da yapay matrislerde yanal çözünürlüğünü geliştirmek için uygulanmış uyarılmış standart TPLSM olarak eksenel çözünürlük. Tek-foton STED'i kullanarak, dendritik dikenler dinamikleri 67 nm 10 çözünürlükte bir yaşam Thy1 EGFP fare beyin korteksinin (kadar 10-15 mikron derinlik) yüzeyinde görüntülü olabilir. Gelişimsel biyoloji için çok yönlü bir araç iki kat geliştirilmiş 2D sağlayan multifokal yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu tarafından sağlanmaktadırçözünürlük. Ancak, bu teknik sadece bu zebra balığı embriyolar 11 gibi ışık saçılması düşük bir eğilimi olan organizmalar kullanılabilir. Yine de, bu tekniklerin hiçbiri, doğum sonrası başlangıçlı hastalıkların biyomedikal ve klinik araştırmalar için önemli bir model olan birkaç yüz mikrometre arasında, yetişkin hayvanların yüksek saçılma dokusunda uygulanabilir.
Nokta dağılım fonksiyonu (PSF), yani kırınım-sınırlı dalga ön şeklini hesaplamak için kullanılan yaklaşım, bağımsız, bir lens aracılığıyla odaklama sonra, optik eksen (eksenel çözünürlük) boyunca PSF genişliği en az üç kat daha büyük Optik eksenin (lateral çözünürlük) 12 dik PSF genişliği. Önemli ölçüde özellikle optik boyunca çok daha büyük PSFs, önde gelen derin doku görüntülemede odaklı elektromanyetik dalga dalga ön şekli değiştirmek Zernike katsayıları ile ölçülebilir farklı siparişlerin ön bozulmaları dalgadiğerleri 13-15 eksen. Bu nedenle, kırılma kanunları ve dalga ön bozulma etkileri hem derin doku görüntülemede sınırlayıcı faktör olarak optik eksen boyunca çözünürlüğe işaret. Nanoscopy teknikleri kırınım sınırlarını mücadele odaklanmak Oysa sadece eksenel çözünürlük ve kırılması ve dalga-ön bozulma etkileri hem mücadele ile kontrastı artıran bir teknoloji, yüksek-çözünürlüklü Intravital görüntüleme için gereklidir. İdeal olarak, bu tekniğin yeterince hızlı hücresel dinamikleri izlenmesini sağlamak için de olmalıdır.
PSF sapmaları ve TPLSM uyarlanabilir optik kullanarak kontrast kaybı gerçek-zamanlı düzeltme yoğun çalışılan ve son on yılda 13,14,16-18 geliştirilmiş ve bu nedenle balistik uyarma daha iyi bir yönetime giden anki mevcut en iyi seçimdir olmuştur 14 fotonlar. Yine nedeniyle en ön düzeltme adaptif optik kullanılan yaklaşımlar dalga gerçeği iteratif ve onlar ha vardırnedeniyle dokuda kırılma indeksi yüksek heterojen küçük alanlar için (birkaç 10 x 10 mikron 2) tekrarlanmasını ettik, toplama hızı görüntüleme hücre motilitesi ve iletişim için gerekli önemli ölçüde daha düşüktür. Ayrıca, adaptif-optik olarak fiziksel sınır TPLSM yine kırınımı ile belirlenir geliştirilmiş.
Aydınlatma (SPIN) ve algılama tarafında (SPADE) temporal modülasyon Mekansal modülasyonu teorik çözünürlüğü artırmak için lazer tarama mikroskopisi için uygulanacak önerilmiştir. Intravital görüntülemede pratik uygulama hala 19 gösterilmelidir kalır.
Birlikte ele alındığında, yetişkin hayvanların canlı derin doku görüntüleme için çözünürlüğünü artırmak teknolojilerin gelişimi için yüksek bir talep var. Bu çalışmada, çoklu ışın çizgili-aydınlatma çoklu foton lazer-s tarama işlemini kontrol ederek uyarma desen mekansal modülasyon eldekonserve mikroskobu (MB-SI-MPLSM) 20. Uyarım kiriş kesiti uzaysal modüle edildiği yapılandırılmış aydınlatma yaklaşımlar, aksine, biz uyarma uzaysal modülasyonunu elde etmek için sadece tarama işlemini kullanır. Uzun dalga boyuna uyarım genişleterek, biz bağımsız optik, yüksek doku (örneğin lenf düğümü, serbest-saçılım yolu 47 mikron 6) saçılma derin doku mekansal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranını hem de geliştirmek mümkün biz tespit non-lineer bir sinyal, örneğin floresan, ikinci harmonik üretimi veya diğer frekans fenomen karıştırma. 900 nm eksitasyon dalga boyu kadar bu yaklaşımı kullanarak fare lenf nodu germinal merkezlerinde az molekül ölçeğinde dinamik görüntü hücresel protein yapıları edebiliyoruz. Bu nedenle, daha iyi bir anti tarama işleminde foliküler dendritik hücreler ve B hücrelerinin yüzeyi üzerinde antijen taşıyan birimleri arasındaki etkileşimin görselleştirmekikincil lenfoid organlarda immün yanıtı sırasında gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çizgili-aydınlatma TPLSM için Multi-ışın Kurulumu
Burada kullanılan, daha önce Kur 6,20 tarif edildiği gibi, özel bir çoklu ışın iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu. Bu sistem, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Yaklaşımı, tek ışın tarama yapmak için tek sahip olsa bile, galvoscanner ayna hareketi ile senkronize makinesi satın mümkün olan diğer iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu, uygulanabilir . Bu durumda, standart dezavantaj PMT tabanlı TPLSM olarak satın alma hızına benzer, ancak bir alt tedarik hızı olacaktır. Kadar çözünürlük ve kontrast ile ilgili olarak en iyi kaliteyi elde etmek için, düşük ağartmanın ve fotohasar ve hızlı edinimi de, bu kurulum aşağıdaki ayarlama adımları dikkate tavsiye edilir:
- Tisa lazer lazer gücünü kontrol edin: orijinal fabrika değerlerine ve onceki ile karşılaştırmak,% 100 kontrolBize okumaları ve kendi aralığı 700-1,000 nm bir uyarım dalga boyu gerekli ise o olarak kullanabilirsiniz.
- Ti için uzaktan kumanda göstergesi test: Sa ışın ayırıcı, yani% 0 kontrol ve% 100 ayarları. % 100 geri kalan Tisa kiriş, sonra orada kontrol ve step motor sıfır konumunu sıfırlayın. Ti: Sa ışın ayırıcı dik ışın yolları üzerinde dik olarak polarize lazer ışınlarını böler düşük düzen λ / 2 plaka ve bir polarize oluşur: bir uyarım için mikroskop içine yönlendirilir, diğer optik parametrik pompalamak için kullanılır osilatör (AFE). Otomatik olarak λ / 2 plaka, Ti sürekli bir ayarı döndürerek: Sa ve OPO güç sırasıyla elde edilir.
- İstenilen dalga boyu OPO ayarlayın ve çıkış gücünü ölçmek. Gücü çok düşükse: pompalama dalgaboyu optimize etmek ve inci ayarlarını kontrol (Ti W 4 ile Sa lazer 800 nm, bir çevrede 1,050-1,100 nm OPO ışın W 0,8-1 almak gerekir)e ayna ve kristal akın etti. OPO istenen dalga boyu çıkışta yankı ve gücü artar kadar onların önerilen optimal çizelgeler veya grafik gibi genellikle mevcut değerleri ve daha sonra ince ayar onları seçin.
- Gücü hala düşükse, dört erişilebilir ayna ayarlama düğmeleri ile OPO iki erişilebilir aynaları ayarlayın. Çok yavaş ve çok küçük hareketlerde, ön ve uç aynalar arasında değişen bu adımı yapmak.
- Sa ve / veya OPO kirişler uygun, merkezi konumda giriş aynalar çarptı: Ti kontrol edin.
- Sa kirişler: beyaz bir kağıt (! Çok parlak veya yansıtıcı olmayan) bir parçası ve ışın OPO gözlemlemek için bir kızılötesi görüntüleyici ve yüksek dalga boyu Ti kullanın.
- NUR Ti ile çalışırken koruyucu gözlük: Sa kirişler (genellikle 720-750 nm kadar ortalama kişi için görünür).
- Mi şekilde hizalama işlemi için mümkün olduğunca düşük lazer güç (ler) Setpotansiyel göz hasarı nimize.
- Gözbebekleri daralıp, böylece her zaman, ilgili odanın ortam ışık tutmak.
- Sa ışın tarama kafası girer: lazer güç ince kontrollü Ti zaman henüz yürürlükte olmayan bir λ / 2 plakası ve polarize, dışarı oluşan zayıflatıcıların tarafından unutmayın!
- Sa kirişler: beyaz bir kağıt (! Çok parlak veya yansıtıcı olmayan) bir parçası ve ışın OPO gözlemlemek için bir kızılötesi görüntüleyici ve yüksek dalga boyu Ti kullanın.
- Giriş noktası diyafram Ti ortasında isabet olduğunu kontrol edin: Sa ve / veya OPO kiriş; değilse, lazer ışını tarama kafası girmeden önce, son iki ayna ayarlayın.
- IR görüntüleyici ve beyaz (yansıtıcı / ama parlak değil!) Küçük bir kağıt parçası kullanın.
- Lazer ışını konumu daha kesin karar olabilir, böylece her zaman, mikroskop girdiği anda diyafram kapatın. Önemli: 6. adıma geçmeden önce diyaframı yeniden unutmayın!
- Buna göre mikroskop içine yansıtılan lazer ışını ışık yolunu ayarlayın. Küçük kesimleri bunu yapmak ve iteratif kiriş-wa gerçekleştirmeklking.
- Objektif lens gelen ışık çıkışı yeterli değilse, tüm ışık yolunu kontrol edin.
- Cihaz uzun süre, büyük bir onarım, optik elemanların herhangi bir değişimi sonrası ilk kez sistemini kullanırken her zaman ışık yolunu kontrol ya da sorunlar çıkışı ile mevcut şüphesi varsa.
- Onlar tozsuz özellikle olduğunu, tüm aktif optik yüzeylerin temiz olduğundan emin olun! Yüzeyleri toz tabakası ile kaplı ise, dalga ön bile objektif lens girmeden önce bozuk ve elde edilen lazer ışını numunenin net bir görüntü sunmak asla!
- Eğer gerekli ise, etanol veya izopropanol ile nemlendirilmiş lens kağıt katlanmış parça ile aynalar temizleyin.
- Işın ışık yolu ayarlandıktan sonra, prizma tabanlı darbe kompresör sonunda doğrudan giriş ayna üzerinde bulunan aynaya geri geldiğinde kontrol edin. Buradan, ışın yansıtılır iışın çoklayıcı (BM) Nto.
- Lazer ışını, bir geniş-bant% 50 ve% 50 aktarım yansıma gereksinimlerini uygun lazer ışınının polarizasyon değişen doğrudan λ / 2 levha önce, ışın çoklayıcı girişinde yer alan diyafram vurursa Giriş BM içinde.
- Birinci ışın pozisyonu daha kesin karar olabilir, böylece diyafram kapatın ve BM girişinde mikroskop ve diğer girmesinden da bir, yani, iki kiriş arasında diyafram yürüme gerçekleştirin. Diğer tek-ışınlı tarama mikroskopları için diyafram xy-tarayıcı içine girişinde yer almalıdır.
- Kiriş kapalı aşağı açıklık merkezi isabet etmezse, BM giriş diyafram önce doğrudan yerleştirilir, yukarıda belirtilen ayna ayarlayın. Önemli: 10. adıma geçmeden önce diyaframı yeniden unutmayın.
- Diyafram açıldı ile lazer ışını BM aynalar vurur olmadığını kontrolonların orta-nokta. BM karmaşık ışık yollarının başka bir bölümünü bloke etmeyecek şekilde kağıt dar bir şerit kullanın!
- Paralel polarizasyon için üst ayna "P", dik polarizasyon "S" için alt ayna: ışın çıkış aynaların ortasında vurur olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, DM'nin önce giriş ayna ayarlayın.
- "S" ve "P" polarize ışın grupları polarize küp girin ve xy-tarayıcıya girdiği anda uygun örtüşme sağlar olmadığını kontrol edin. Durumda bu adımları tek-ışınlı tarama mikroskobu kullanılmaktadır atlayın.
- Lazer ışığı merkezi tarama ve tüp lensler geçer ve objektif lens 'arka odak düzlemi ortasından alırsa edin. Önemli: Bu adım, bir park konumunda, orta konumda, lazer ışını ile yapılmalıdır!
- Bir amaçlayan bir araç ("boğa gözü") ile objektif lens değiştirin ve lazer ışını ortasında hedef vurur olmadığını kontrol edin ve olsunaydınlatma çifttir.
- Bu durumda gibi görünüyor, BM önce açıklığı kapatmak ve dairesel bir girişim deseni görünürse ortasında (parazit az) siyah bir daire ile kontrol edin.
- Turnayı gözünden merkezine göre önemli bir değişim var ise giriş aynayı ayarlayın.
- Şimdi 20X su daldırma lens ile örneğin bir objektif lens ile turnayı gözünden değiştirin.
- Beyaz bir kağıt parçası ile çıkış ışık alanını kontrol edin. Bu, parlak düzgün ve merkezi olarak yerleştirilmiş olmalıdır.
- Çıkış gücü ölçün:% 100 Ti pompalama ile% 100 OPO at: Sa (4 W), bir yaklaşık almalısınız. (Burada kullanılan mikroskop) 1100 nm'de lens sonra 100-150 mW. Alt lazer güçler çoklu ışın SI-TPLSM gerçekleştirmek için yeterli olmayacaktır. Tek-ışınlı tarama SI-TPLSM için, 5-10 mW yeterlidir. Lazer ışını scanne olmadan orta konumda kalmalıdırd!
- MB-SI-TPLSM performans aşağıdaki gibi, BM de aynalar align:
- Sahnede bir homojen floresanlama örnek, örneğin kırmızı floresan slayt, yerleştirin ve numune içine ancak (objektif lens 'ön yani yakın) üst yüzeye yakın lazer ışını odaklanır.
- Çoklu ışın moduna ayarlayın ve mikroskop başında kirişlerin sayısı, tercihen tek bir ışın ve kutuplaşma, örneğin "P" seçin.
- Floresan slayt görüntüleme ile lazer ışınını bul: açık "P" çekim ayarlamak ve ışın odaklama iken sürekli CCD kamera çalıştırın.
- Kiriş orta konumda olan ve tarayıcının kapalı olduğundan emin olun. Işın taranan değil emin olun!
- Kamera çipi merkezine yakın bir parlak nokta bakarak ışınını bulun.
- Nokta görüntü düzleminin, yani parlak ve keskin kadar ışın odaklamakmikroskop, kamera çipinin konumuna karşılık gelir; nokta doymuş değildir, böylece, lazer gücü azaltmak. Iyi hizalanmış sistemi ile bu lazer gücü bir ışın modunda (yaklaşık 0.6 mW lazer gücü çalışmalıdır) çalışırken yakın en az olmak zorunda olduğu anlamına gelir.
- Nokta merkezine kapalı anlamlı ise, ön BM (veya tek-ışın tarama için tarayıcının) ayna ayarlayarak yakın merkezine doğru hareket ettirin.
- Ayrıca, yani "S" kiriş diğer kutuplaşmayı hizalama zaman, şimdi, 2-ışın moduna "S" sürgüsünü açın ve sadece "S" obtüratör açık ise (sadece tek bir ışın görülebilir ışın konumunu kontrol .)
- Bittiğinde, 4-ışın moduna geçmek ve "P" polarizasyon modu ("P" obtüratör açık) kullanın. Şimdi iki beamlets görünecektir.
- İki beamlets mükemmel kameranın bakış alt kenarına paralel ve ayrı 2.8 mikron olarak bunları ayarlamak için düzenlemek.
- Düzgün hizada değilse, BM ilk aynayı ayarlayın.
- İki kiriş um ayrı ve mükemmel bir şekilde yatay olarak düzenlenmiş 2,8 kadar yerine ayna hareket ettirmek için iki çevresel vida kullanarak, ortada vida hizalamak yok.
- Şimdi "P" kutuplaşma 8-ışın moduna ve 4 beamlets 2.8 um de eşit uzaklıkta olan ve görüntünün alt kenarına paralel düzenlenmiş kadar ikinci BM ayna (ayrıca kırmızı nokta olmadan) ayarlayın.
- Sırasıyla, ve 32-ışın modu, 3. ve 4. BS aynasını ayarlama - 16 içinde tekrarlayın. SI-algoritmaları, basit min-max (HiLo) algoritması olan, bu varsayıma dayanmaktadır çünkü beamlets eşit uzaklıkta olması için önemlidir.
- W, uyarım kirişin park konumuna githich genellikle tarayıcı koordinatları, örneğin (; 10,000 10,000) büyük değerleri yerleştirilir.
- CCD kamera ile (multi-ışın) görüntüyü tarayın. Görüntü, keskin üniforma ve düz görünür olduğunu kontrol edin.
- Görüntü döndürülmüş görünüyorsa kamerayı ayarlayın: Görüntü doğruldu kadar (! Nazik olun) elle eksenel düşey eksen etrafında kamera gövdesini bükün.
- Çoklu ışın tarama durumunda, yani y-tarayıcı ayna hareket eder. ikinci dereceden çizgili bir görüntü oluşturmak için böyle bir şekilde küçük ışın hattı diktir.
- Aşama 17.1 'de tarif edildiği gibi, görüş alanı elde edin. kiriş-let hattı ikiye katlandı ve beamlets tüm hat boyunca eşit uzaklıkta olmasını sağlamak bir konuma x-tarayıcı aynayı hareket ettirerek tarama rutin uzatmak, çok küçük. Tam hareketi tekrarlayınx-tarayıcı daha büyük olan ayna çizgili görüntü oluşturmak için taşınır y-tarayıcı ayna sonra.
- İstenilen çizgili görüntü oluşturmak için - bilim adamı tarafından tanımlanan - tek ışın tarama durumunda, eşit pozisyonlarda defalarca x-tarayıcı ayna hareketi ile y-tarayıcı ayna hareketi alternatif.
- Sabit hızda (azaltılmış hızlanma / yavaşlama) için y-tarayıcı ayna bir komut hareketi için ve maksimum hız (maksimum hızlanma / yavaşlama) de x-tarayıcı ayna biri için kullandığınızdan emin olun.
- Yeterince tekrarlama adımları arasındaki uygun adım uzunluğunu seçinbirbirini takip eden iki beamlets (bu durumda 2.8 um ve tarayıcı aynalar bir adım 25 nm eşittir) arasındaki mesafeyi kapatmak için birbirini takip eden iki şeritli görüntüleri; biraz üst üste izin vermek için uygun olabilir, ek 0.3-0.4 um, yani.
- Verilen dalga uzunluğunda yanal çözünürlük limiti ile eşleşen bir değere x-shift ayarlayın. Bir örnek olarak, vardiya ve 12 veya 13 vardiya başına x-tarayıcı aynanın 10 adımları kullanarak yol iyi eksenel ve bu sistemde yanal çözünürlük sonuçları hem. Sayılar kullanılan sistemde iyi çalışacak bir yapılandırılmış slayt, örneğin Convallaria kökleri slayt, kontrol edin.
- Convallaria görüntü keskin hale gelinceye kadar bu iki değer Optimize: hesaplanan SI görüntülerde çizgi profil aracını kullanın ve çizgi profillerinin (Convallaria hücre duvarlarından floresan sinyali olan) genişliğini karşılaştırın.
- Tarayıcı hareketi ile senkronize her çizgili görüntü elde ayrı kaydedebilirsiniz, örneğin
Intravital Görüntüleme için Fare aşılama ve hazırlanması
Hayvan deneyleri hayvan refahı (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) için uygun eyalet komiteleri tarafından onaylanmış ve geçerli kurallara ve yönetmeliklere (hayvan deneyi lisans G0153/08) ile uygun olarak yapıldı.
- 4 daha önce anlatıldığı gibi popliteal lenf düğümü ve görüntüleme alanının hazırlanması için bir germinal merkez yanıtın başlatılması gerçekleştirilmiştir. Immünomanyetik dalaklarından B hücrelerinin saflaştırmak B1-8 + / + JK - / -ve B1-8 + / + JK B hücreleri - / - GFP + fareler.
- - / - + / + JK ⅛ B1-8 ile>% 95 bir saflığı olan damar 3 x 10 6 NP özgü B hücreleri enjekte GFP + ve ⅞ nonfluorescent B1-8 + / + JK - / - C57BL / 6 alıcılarda .
- Hücre transferi, bir gün sonra NP-CGG sağ arka gıda yastığa Tam Freund katkı maddesi (CFA) içerisinde emülsifiye (nitrofenil-tavuk ɣ globulin) 10 ug ile alıcı bağışıklık kazandırır.
- ATTO590-süksinimidil ester ile anti-CD21/CD35 antikorların Etiket Fab fragmanları.
- , In vivo olarak germinal merkezi içinde foliküler dendritik hücrelerin ağ (FDC) gelmek intravital analizi yapılmadan önce fareler, 12-24 saat sağ arka ayak tabanından florokrom etiketli Fab fragmanlarının 10 ug enjekte etmek.
Aşağıdaki adımlar conside olmalıdırintravital görüntüleme için popliteal lenf düğümü (gün 8-10 bağışıklık kazandırma işleminden sonra) bileşiğinin hazırlanması için kırmızı:
- Ketamin / ksilazin ip enjeksiyonu, kendi ağırlığına bağlı olarak miktarı ile fare anestezisi.
- Bütün görüntüleme dönemde anestezi derinliği izlemek için refleksleri test edin.
- Sırt bacak ve titiz farenizin sağ kanadını tıraş ve tamamen artık saç kaldırmak için kıllarını alıcı krem kullanın.
- Büyük sağ trokanteri Fix: parmakları ile kemik çip bulmak, bir küçük beyaz üçgen şeklindeki fasya görünene kadar makas ile küçük bir deri kesisi ayarlayın.
- Süzgeç sivri cımbız ile bu fasya altında kemik çip kelepçe.
- Dişli cımbız kullanarak lomber bölgede omurga düzeltmek.
- Süzgeç sağ arka bacak düzeltmek ve vidayı sıkın.
- Doğru pozisyonda bacak tutmak için bant kuyruk.
- Uyluk kaudal tarafında, bölgedeki belirgin ve popliteal Ente olarak, deride bir insizyon oluşturmakrs doku, künt cımbız ile altta yatan doku cilt ayırmak ve distal proksimal popliteal ven izleyin.
- Künt cımbız kullanarak lenf düğümü Açığa, (açığa sırasında PBS içinde lenf düğümü tutmak) ince lenf damarları korumak amacıyla kesme kaçınıyorum.
- Lenf düğümünde etrafında vakum gres bir daire oluşturun, PBS ile bu su birikintisi doldurun.
- Pozisyonunda kapak kayma koyun ve termometre-prob (aksi hücre hız önemli ölçüde değişir, 37 ° C'de sıcaklığı tutmak) yerleştirin.
- Kapak kayma üst kenarı boyunca vakum yağ bir daire ekleyin.
- , Vakum yağ üzerindeki konumunda ısıtma bobini koyun daha önce olduğu gibi benzer bir şekilde bir yalıtım oluşturmak ve objektif içine daldırma için, cam kapak slip üzerinde su / PBS ilave edin.
- Ölümcül dozda ketamin / ksilazin dozları artırırken görüntüleme sonra, fare servikal dislokasyon takiben, anestezi tutulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lenf düğümlerinde Mekansal çözünürlük
Etkili nokta dağılım fonksiyonu (epsf) boyutları bir mikroskop 12 mekansal çözünürlükte gelmektedir. Biz (CCD kameralar vasıtasıyla) kurulan iki-foton lazer tarama mikroskopi teknikleri, yani alan algılama TPLSM göre bizim MB-SI-TPLSM tarafından lenf düğümlerinde kollajen liflerinin ikinci harmonik nesil sinyal alarak bu üç boyutlu fonksiyonu ölçülür ve nokta tespiti TPLSM (PMT vasıtasıyla).
Bu ölçümlerden bu numunenin yüzeyinde, her iki yanal ve eksenel çözünürlükleri kırınım teori 20 tarafından tahmin edilen beklenen değerlere karşılık olduğu belli olur. Ancak, artan görüntüleme derinliği olan ve bu nedenle son derece farklı kırılma endeksi ile ortam aracılığıyla uyarma ve emisyon radyasyonunun hem de optik yolu artan, uzamsal çözünürlük inde, önemli ölçüde bozulurasılı halde kullanılan kurulum (Şekil 2). MB-SI-TPLSM ile biz, bağımsız bir şekilde, görüntüleme derinlik, bir yaklaşık ulaşmıştır. % 20 daha iyi yanal çözünürlük ve standart TPLSM yaklaşımlara kıyasla% 220 daha iyi eksenel çözünürlük.
Germinal merkezlerinde foliküler dendrit hücreleri üzerinde immün komplekslerin dinamiği
, Bağışıklık tepkisi sırasında B hücrelerinin klonal seçimi, yetişkin farelerin, ikincil lenfoid organların içindeki bellek B hücreleri ya da plazma hücrelerine farklılaşmak 4 yolunda ilk adımdır. Bu süreçte, germinal merkezleri içinde immün kompleks yapıların (birkaç protein moleküllerinin kümeleri) seviyesinde, foliküler dendrit hücrelerinin (FDC) ve B hücreleri arasındaki etkileşimin yüksek dinamik bir rol oynadığına inanılmaktadır. Sadece yüksek derecede çözülmesi intravital mikroskopik teknolojisi kullanılarak bu hücresel iletişim ve immün tepkisi için etkilerini incelemek mümkündür. M Bizim yaklaşımımızB-SI-TPLSM ilk kez en fazla 120 mikron derinliğinde, foliküler dendritik hücreler üzerinde anti-CD21/35-Fab-ATTO590 etiketli olarak intravitally immün kompleks mevduat kümelerin boyutlarını görselleştirilmesi ve nicel imkanı sağlar popliteal lenf düğümlerinde (Şekiller 3a ve 3b) germinal merkezleri. Bu tür yapılar standart TPLSM yaklaşımlarla görünür olmasa da, biz bunları tek tek belirlemek ve hatta bizim bir yaklaşım kullanarak kendi dinamikleri görselleştirmek. Şekil 3e ve bu anlayış destekleyen 3f, bir germinal merkezde immün hücre mevduat 3D floresan görüntü arasındaki doğrudan karşılaştırmasını gösteren olabilir geleneksel TPLSM tarafından satın olarak (PMT-temelli) ve MB-SI-TPLSM. Ayrıca, germinal merkez B hücreleri ile immün kompleks mevduat etkileşimleri son derece (Şekil 3c ve 3d, Sinema 1 ve 2) çözülebilirdi ve şimdi ben olabilirçoğalması, farklılaşması ya da apoptosis için intravital fonksiyonel problar ile birlikte nvestigated. Bir sonraki adımda, aynı zamanda, ikincil lenfoid organlarda B hücre klonal seçimi için diğer belirleyici fenomen oluşturduğuna inanılan T yardımcı hücreleri ile germinal B hücrelerinin iletişimini dinamik araştırmak için bir yaklaşım kullanır.
.. Ayarlanabilir bir fs-darbeli Ti Şekil 1 Prensibi ve multi-ışın çizgili-aydınlatma iki-foton lazer tarama mikroskobu kurulumu kiriş: Sa lazer (dalga boyu aralığı 690-1,080 nm, 140 FSEC, 80 MHz) zayıflatılmış a λ / 2 plaka ve bir ince film polarize yapılmış bir modül olarak, darbeler bir prizma bazlı GVD dengeleme modülü, önceden sıkıştırılmış ve son olarak bölünmüş 2, 4, 8, 16, 32, veya 64 profil,Bir küçük ışın hattı oluşturur. Çizgi içinde iki ardışık beamlets (küçük ışın doğrultusunda kırmızı ve yeşil etiketli) dik kutuplaşmalar var ve girişimi önlemek için zamanında kaydırılır. İki ardışık beamlets arasındaki zaman kaydırma 3 İcra Komitesinin TL'dir. Iyi tanımlanmış bir periyodik desen oluşturulur böylece görüntü elde etmek için, küçük ışın hattı, objektif lensi (20X su daldırma objektif lens, NA 0.95, WD 2 mm) ile numune içine odaklanmış ve dik taranır. Bu model, küçük ışın hattı boyunca çevrilmiştir. Görüntülerin dizi bu yolu nihayet bir minimum-maksimum algoritması tarafından değerlendirilir EM-CCD kamera ve bir filtre tekerleği üzerine monte girişim filtreleri ile tespit edilir üretti. PMT-tespitine dayanan tek ışın TPLSM aynı mikroskobu ile yapıldı. Bu durumda, örnek taramak için tek bir lazer ışını kullanılan ve spektral gelen dikroik ayna ve girişim filtreleri önce tespit olan floresan sinyali çözülmüşfoto-çoğaltıcı tüpler ile ing. Alternatif olarak, yerine Ti:. Sa lazer ışını, bir optik parametrik osilatör ışın uzun dalga boyu MB-SI-TPLSM gerçekleştirmek için mikroskop birleştiğinde olabilir , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Standart PMT-temelli ve multifokal CCD tabanlı TPLSM göre çoklu ışın çizgili-aydınlatma TPLSM Şekil 2.. Mekansal çözünürlük. (A) Temsilci eksenel profilleri yanı sıra xy ve lenf içinde 100 mikron derinliğinde kollajen liflerde SHG xz projeksiyonları düğüm. lexc = 900 nm, algılama dalga boyları 447 ± 30 nm, foton akı Φ = 4.75 x 10 aralık
Şekil 3, MB-SI-TPLSM ile germinal merkezlerin intravital görüntüleme hapten ile bağışıklık kazandırılmış bir fare CD21/35-Fab-ATTO590 (kırmızı) ile işaretlenmiş bir germinal merkezi ışık bölgesinin (a) 3D floresan görüntü -.. Tavuk γ -globulin (NP-CGG) B1-8 EGFP + B hücreleri (yeşil) evlatlık transferinden sonra. Foliküler dendrit hücrelerinin (FDC) üzerinde immün kompleks çökeltileri (CD21/35 etiketleme) zum-in (b) görüntünün (a) 'de görüldüğü gibi, tek tek görüntülenmiştir ve de (lateral ve hem de eksenel) boyutlara sahip olabilir kadar 120 mikron derinliğinde 400-800 nm aralığı. Bağışıklık B1-8 EGFP + fare germinal merkez B hücreleri (c), bağışıklık tepkisinin olgunlaşması için kısmen sorumlu kontakların (d) iken artık görselleştirilebilir tespit edilir. λ EXC = 850 nm, algılama dalga boyları 605 ± 20 nm (ATTO590) ve 525 ± 25 nm (EGFP), foton akı Φ = 7.05 x 10 28 foton / cm 2 · sn arasında değişmektedir. Ölçek çubuğu (a) 20 mikron, (b) 10 mikron, (c) 30 um, (d) 10 um. Içinde aynı bölgede 3D floresan görüntüleriMB-SI-TPLSM (e) ve konvansiyonel (PMT-temelli) TPLSM tarafından kaydedilen CD21/35-Fab-ATTO590 tarafından etiketlenmiş bir germinal merkez ışık bölgesi (f), sırasıyla. , bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
Film başlıklar
Film-1 ve -2
Immün kompleks ikincil foliküler dendritik hücreler üzerinde mevduat (FDC) ve germinal merkez B hücreleri ile etkileşimi MB-SI-TPLSM tarafından kaydedilen dinamiği. - / - EGFP + hücreler (yeşil) germinal merkez B hücreleri, B1-8 Jk iken immün kompleks çökeltileri CD21/35-Fab-ATTO590 (kırmızı) ile etiketlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravital optik görüntüleme amacı dinamik ve fonksiyonel doku ve sağlık ve hastalık 5 organ işlevini anlamak amacıyla hücresel hareketliliğini ve etkileşimleri görselleştirmek için. Bu, çoklu foton lazer tarama mikroskobu elde etmek için en güçlü teknoloji, hala, onun uzaysal çözünürlüğü sınırlamak ön çarpıtmalar, saçılması, yavaş edinimi, ışıkla ve fotohasar, dalga ilişkin sınırlamaları aşmak kontrast yanı sıra zaman çözünürlüğü vardır .
Iki başarılı bir daha uyarma elde etmek için çözümler (ve emisyon) derin doku daha iyi mekansal kararları açan, artmış kontrast (artan sinyal artmış sinyal-gürültü oranı) ve böylece azaltılmış photobleaching ve fotohasar foton yönetimi vardır : adaptif-optik yaklaşımlar ve daha uzun uyarma dalga boyu kullanımı - ayarlanabilir kızılötesi uyarma 6. Son on yılda, dalga ön ilgili SIM kavramıuyarlamalı optik tarafından avranış çoklu foton mikroskopi de biyo-optik görüntüleme astronomi transfer edilmiş ve. İlk uyarlamalı optik dalga ön algılama dayanıyordu ve astronomi benzer bir subdiffraction başvuru, yani bir "rehber yıldız", gerekli iki-foton mikroskopi için yaklaşımlar olsa da, mevcut sistem derin doku görüntüleme 12 daha uygundur. Örneğin, onlar 13,15 algılama dalga cephesi uyarma radyasyon tutarlılık-yolluk kullanın veya öğrenci 17 segmentasyon veya sonra onlar hiç bir dış wave front algılamayı kullanmak, ama ya görüntülerin çapraz korelasyon dayalı adaptasyon algoritmaları geliştirmek yok IMPACT 16, ya da dalga ön çarpıtmalar ve saçılma etkileri 20 karakterize etmek için foto-akustik kullanın - ideal parametreler ve düzeltilmemiş görüntü ile sonradan müdahale önceki yineleme adımından elde edilen tekrarlı stokastik arama. Yine de, son derece farklı Refr nedeniyledüzeltme adım nispeten küçük alanlar için tekrarlanmalıdır beri dokusunda aktif endeksi, uyarlamalı optik yaklaşımlar, (yaklaşık 10 x 10 mikron 2) 16 oldukça yavaş. Ayrıca, ya dalga ön veya saçılma etkisi düzeltme tarafından, maksimum elde uzamsal çözünürlük yine kırınımı ile sınırlıdır.
Bizim yaklaşım, kısmen dalga ön sapmaları ve saçılma yükünü üstesinden değil, aynı zamanda kırılma sınırın ötesinde çözünürlüğü iter. Yüksek sayısal diyafram ile objektif lens kullanarak, eksenel çözünürlük için mutlak değerler etrafında 400 nm 20 artırabilir. Geleneksel TPLSM kıyasla geliştirilmiş çözünürlük için fiyat derin dokuda sinyal-gürültü oranı dik bir çürüme olduğunu. Bu MB-SI-TPLSM saha algılama kullanmak için zorunluluk nedeniyle. 15 önce gösterildiği gibi, yerine nokta dedektörleri alan dedektörlerinin kullanılması SNR du bu dik çürümesi ile ilişkiliSadece alan bir algılama için uygun olan yayılan ışığın daha güçlü saçılma e. Bu nedenle, alan algılama TPLSM yöntemleri için en fazla görüntüleme derinliği yaklaşık. Konvansiyonel (tabanlı yani nokta tespiti) TPLSM kıyasla% 25 azaltılmış. Bir basit pratik bir çözüm daha uzun uyarım dalga boylarına uygulamak ve daha uzun dalga boylarında emisyon tespit etmektir. Doğal olarak, bu MB-SI-TPLSM olduğu gibi aynı ölçüde geleneksel TPLSM derinlik bağımlı SNR geliştirir.
Bildiğim kadarıyla toplama hızı söz konusu olduğunda, MB-SI-TPLSM sadece galvanometrik tarayıcı ve / veya 32 lazer ışını sağlayan için ışın bölme kamera ve kar okuması ile hızı ile sınırlıdır. Standart çoklu ışın kamera esaslı TPLSM ile karşılaştırıldığında, MB-SI-TPLSM nedeniyle taramak için değil, aynı zamanda eşzamanlı olarak yaklaşık her elde etmek için sadece ihtiyaç biraz daha yavaştır. 10 çizgili son yüksek çözünürlüklü görüntü oluşturmak için görüntüleri aydınlattı. Ancak, bizim teknik bir cl korur(tek-ışınlı tarama ve nokta tespiti dayalı) geleneksel TPLSM üzerinde kulak hız avantajı. Bu nedenle, 150 x 150 mikron 2 (512 x 512 piksel) edinimi süresi MB-SI-TPLSM kullanarak geleneksel TPLSM (tarayıcı frekansı 800 Hz) ve 109 msn'den kullanarak 841 msn. Her iki sinyal kurulumları için benzer olduğunu, suretle, ışın başına uyarım gücü ve piksel başına kalma süresi, geleneksel ve MB-SI TPLSM her ikisi için de aynıdır. Daha önce, foto ağartıcı 20 gösterdi ve MB-SI-TPLSM deneylerde fotohasar etkisi düşük ve iyi bir performans geleneksel TPLSM karşılaştırılabilir gibi.
İleride daha da yapılandırılmış-21 aydınlatma için uyarlanabilir optik başarılar benzer intravital TPLSM geliştirmek için kızılötesi aralıkta adaptif-optik ve çizgili-aydınlatma tamamlayıcı yaklaşımları kombine edilmesi istenebilecektir. Ancak, bu hedeflere ulaşmak için, oldukça hızlı adaptif optik yaklaşımlargeliştirilmelidir.
Biyolojik bilimler ve biyomedikal için çizgili-aydınlatma yaklaşımın beklenen yüksek darbe çözünürlüğünü arttırmak ve derin doku kontrastı geliştirmek, dalga ön bozulma mücadele ve efektler saçılma, aynı zamanda lazer tarama mikroskopları sapma sınırlarının ötesine gidiyor, tarafından kapasitesi yatıyor sadece tarama süreci kontrol ve uygun bir şekilde hassas bir alan dedektörü seçimi.
Biyolojik bilimler ve biyomedikal için çizgili-aydınlatma yaklaşımın beklenen yüksek darbe çözünürlüğünü arttırmak ve derin doku kontrastı geliştirmek, dalga ön bozulma mücadele ve efektler saçılma, aynı zamanda lazer tarama mikroskopları sapma sınırlarının ötesine gidiyor, tarafından kapasitesi yatıyor sadece tarama süreci kontrol ve uygun bir şekilde hassas bir alan dedektörü seçimi.
Çizgili-aydınlatma yaklaşımı Intravital derin doku im için uygulanabilirTek ışın tarama galvoscanner hareketi ile kamera algılama eşitlemek için yetenekli tüm iki-foton lazer tarama mikroskopları yaşlanma. Bu durumda, uyarım desendeki en tek çizgili olup, daha sonra eş zamanlı olarak MB-SI-TPLSM olarak oluşturulur. Biz doğal olarak konvansiyonel TPLSM (tek ışınlı tarama, nokta dedektör-tabanlı TPLSM) ancak gösterdiği gibi mekansal çözünürlükte ve aksine aynı iyileşme göre floresan görüntüleri biraz daha yavaş bir kazanım oranı bekliyoruz SI-TPLSM tek ışın tarama kullanarak MB- SI-TPLSM. Birlikte görüntüleme derinlemesine sınırlama ile alt kazanım hızı önemli ölçüde MB-SI-TPLSM göre tek-ışın SI-TPLSM uygulama aralığını azaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Volker Andresen Almanya LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, bir hissedar olduğunu. Diğer yazarların herhangi bir çatışmaları yok.
Acknowledgments
Biz C57BL / 6 B1-8 GFP transgenik fareler sağlamak için çizgili-aydınlatma yaklaşımı, K. ve A. Rajewsky Haberman'da gelişimi sırasında verimli tartışmalar için R. Heintzmann teşekkür ederim. Biz mali destek için Deutsche hibe NI1167/3-1 altında Forschungsgemeinschaft (RN), HA5354/4-1 ve SFB633, proje A15 (AEH için), hibe Rahel-Hirsch burs kapsamında Charite (RN) kabul. Biz özellikle verimli tartışmalar ve altyapı desteği için ağ Jimi kabul
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. Advanced optical imaging. , Springer Verlag. Berlin. (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
