Summary
هذا البروتوكول يستكشف أحدث التطورات في أداء تحليلات لطخة غربية. هذه التعديلات رواية توظف نظام هلام مكرر تريس مع 35 دقيقة الكهربائي تشغيل الوقت، جافة نظام نقل النشاف 7 دقائق، والأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري والتصوير الذي يولد دقة أعلى، والجودة، والحساسية، وتحسين دقة البيانات الغربية.
Abstract
لا تزال تستخدم تقنيات لطخة غربية التي أنشئت أصلا في أواخر 1970s بنشاط اليوم. ومع ذلك، وهذه الطريقة التقليدية للالنشاف الغربية لديها العديد من السلبيات التي تشمل دقة منخفضة الجودة، والعصابات زائفة، وانخفاض حساسية، وضعف النزاهة البروتين. التطورات الحديثة قد تحسنت بشكل كبير جوانب عديدة من بروتوكول لطخة غربية القياسية لإنتاج بيانات نوعية وكمية أعلى. نظام هلام مكرر تريس، بديلا لنظام Laemmli التقليدية، ويولد أفضل فصل البروتين والقرار، ويحافظ على سلامة البروتين، ويقلل الكهربائي لفترة 35 دقيقة التشغيل. وعلاوة على ذلك، فإن النظام النشاف الجاف iBlot، ويحسن بشكل كبير من فعالية وسرعة نقل البروتين إلى غشاء في 7 دقائق، والذي هو على النقيض من الأساليب نقل البروتين التقليدية التي غالبا ما تكون غير فعالة أكثر مع أوقات نقل طويلة. في تركيبة مع هذه التعديلات المبتكرة، البروتين دetection باستخدام نتائج التصوير بالأشعة تحت الحمراء الفلورسنت في ذات جودة أعلى وأكثر دقة وبيانات متسقة بالمقارنة مع تقنية النشاف الغربية القياسية من معان كيميائي. هذه التكنولوجيا يمكن الكشف عن مستضدات مختلفة في وقت واحد اثنين على نفس الغشاء من خلال الاستفادة من اللونين الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء التي تصور في قنوات مختلفة الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، والخطي واسعة النطاق الديناميكي التصوير الفلورسنت يسمح لتقدير الدقيق للنطاقات على حد سواء القوي والضعيف البروتين. وهكذا، يصف هذا البروتوكول التحسينات الرئيسية لطريقة النشاف الغربية الكلاسيكية، والتي هذه التطورات إلى زيادة كبيرة في نوعية البيانات مع خفض كثيرا من الوقت أداء هذه التجربة.
Introduction
وقد تم تطوير هذه التقنية من النشاف الغربية الأولى بين عامي 1977 و 1979 من أجل خلق أفضل طريقة للكشف عن البروتينات باستخدام الأجسام المضادة 1-3. هذا الإجراء يستخدم الكهربي نقل البروتينات من الهلام إلى الغشاء من SDS-PAGE مع البروتينات الهدف تصور باستخدام الأجسام المضادة الثانوي والكشف عنها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية، أو ناتج التفاعل البيروكسيديز 3. وبالتالي، لا تزال تستخدم على نطاق واسع نفس هذه المبادئ الأساسية في البروتوكولات لطخة غربية اليوم. ومع ذلك، هذه التقنية النشاف الغربية الكلاسيكية يفعل الحاضر العديد من العيوب، مثل أوقات الشدة المدى الكهربائي، دقة منخفضة وشرائح البروتين الاصطناعي، وقابلية للتحلل البروتين، وحساسية محدودة فضلا عن ضعف جودة البيانات 4. لذا، يصف هذا البروتوكول السلف وتحسينات كبيرة لإجراء طخة غربية القياسية التي يولد البيانات النوعية والكمية أكثر دقة.
"> نظام Laemmli لفصل مجموعة واسعة من البروتينات باستخدام SDS-PAGE هو النظام الأكثر استخداما على نطاق واسع هلام لالنشاف الغربية 5. على الرغم من شعبية هذا النظام النشاف الغربية، ويمكن هذا الأسلوب يؤدي إلى تشويه الفرقة، وفقدان القرار، و نطاقات زائفة 4. هذا قد يكون نتيجة لنزع الأمين والألكلة من البروتينات نظرا لارتفاع درجة الحموضة (9.5) من هلام فصل، عودة التأكسد انخفاض السندات ثاني كبريتيد بسبب حالة الأكسدة متفاوتة من هلام، والانقسام من aspartyl-prolyl السندات الببتيد بسبب تسخين البروتين في Laemmli العازلة (درجة الحموضة 5.2) 4،6. نظام هلام مكرر تريس، التي تعمل في درجة الحموضة محايد (7.0)، ويوفر فوائد كبيرة على النظام Lamemmli. يحسن هذا النظام الاستقرار البروتين، ويقلل التعديلات البروتين، ويحافظ على البروتينات في ولاياتهم انخفاض، ويمنع aspartyl-prolyl الانقسام خلال الكهربائي، والأهم من ذلك، الكهربائي تشغيل الوقت هو 35 دقيقة 4،6،7. وبالإضافة إلى ذلك، رنظام هلام انه مكرر تريس تنتج أيضا العصابات أكثر وضوحا، وارتفاع القرار، والانفصال، وزيادة حساسية مما أدى إلى المزيد من البيانات الموثوقة 4.بالتزامن مع نظام هلام مكرر تريس، يستخدم النظام النشاف الجاف iBlot عالية القوة الميدانية والتيارات إلى الحد بشكل كبير من الوقت نقل البروتينات من الهلام على الأغشية خلال 7 دقائق 8. ويستند هذا النظام على طريقة نقل النشاف الجاف الذي يولد نقل أكثر كفاءة وموثوق بها من البروتينات 8. لمقارنة تفصيلية لفعالية نظام التحويل iBlot إلى أنظمة نقل التقليدية يرجى الرجوع إلى الموقع التالي: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . فإنه يستخدم أنود والكاثود المكدس، والتي تتألف من مصفوفة هلام التي تحتوي على مخازن النقل المناسب، والتي تكون بمثابة خزانات أيون 8. أثناء عملية النقل، التحليل الكهربائي للماء يساعد على منع توليد الأكسجين من الأنود النحاس مما أدى إلى نقل بروتين أكثر اتساقا دون التسبب في تشويه الفرقة 8. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام نقل أيضا يزيد من سرعة نقل عن طريق تقليل المسافة بين أقطاب 8.
على الرغم من أن لمعان كيميائي هو الأسلوب الأكثر شيوعا والتقليدية للكشف عن البروتين لطخة غربية التحليلات، وهما لونا الأشعة تحت الحمراء كشف الفلورسنت يحسن إلى حد كبير حساسية، والجودة، ودقة البيانات لطخة غربية. يستخدم هذا الأسلوب الكشف بالأشعة تحت الحمراء ليزر الإثارة في اثنين من موجات الأمثل، 700 نانومترو 800 نانومتر، لتوليد صورة بيانات واضحة مع نسبة أكبر إشارة إلى الضوضاء وأعلى حساسية 9. وبالتالي، يمكن تصور اثنين من البروتينات المستهدفة في وقت واحد على نفس الغشاء باستخدام نانومتر 700 و 800 نانومتر القنوات كشف الفلورسنت. الأهم من ذلك، والنطاق الديناميكي الخطي مضان الأشعة تحت الحمراء يسمح للتحليل الكمي الدقيق للنطاقات البروتين سواء القوي والضعيف 9. علاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مزايا وتحسينات هائلة على تقنية النشاف الغربية الكلاسيكية من خلال خفض الكهربائي ومرات نقل هذه التجربة دون المساس فعالية هذه العمليات وذلك باستخدام الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري لإنتاج أكبر لطخة غربية البيانات النوعية والكمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الخلية لست الجامعة من خلية ثقافة
- وضع أطباق زراعة الخلايا على الجليد وإضافة PBS الباردة مع 5 ملي EDTA (مثلا 5 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 ملي EDTA/10 سم 2 لوحة). إزالة الخلايا الملتصقة من الطبق باستخدام مكشطة الخلية ومن ثم نقل تعليق خلية إلى الباردة أنبوب 15 مل المخروطية.
- بيليه تعليق خلية بواسطة السرعة المنخفضة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة (230 x ج) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع أنابيب مخروطية على الجليد ونضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
- غسل بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 ملي EDTA ونقل تعليق خلية إلى 1.5 مل الباردة أنبوب الطرد المركزي. تعليق سريع تدور في 13،000 دورة في الدقيقة (13،226 XG) لمدة 10 ثانية لتكوير الخلايا. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه ومكان أنابيب على الجليد.
- resuspend وبيليه في 25-200 ميكرولتر (اعتمادا على حجم بيليه، أي لمدة 3 × 10 6 خلايا إضافة ~ 150 ميكرولتر من العازلة RIPA) فيRIPA العازلة (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.5 ملي EDTA، 10 ملي ناف، 0.1٪ SDS، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 1٪ NP-40) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني وأضاف طازجة ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز بتركيز نهائي 2X. لفترة وجيزة دوامة كل أنبوب واحتضان لمدة 20-30 دقيقة التعليق على الجليد. ملاحظة: هناك العديد من مخازن تحلل والتي يمكن استخدامها لاستخراج البروتينات، والتي تختلف في قدرتها على ذوبان البروتينات وقوة على تغيير طبيعة المنظفات (أي SDS، تريتون X-100، أو NP-40). العازلة RIPA مفيد لإعداد لست] خلية كاملة وتعطيل البروتين البروتين التفاعلات.
- لإنشاء جزء آخر النووية، لست] أجهزة الطرد المركزي في 14،000 دورة في الدقيقة (15339 x ج) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل طاف لأنبوب جديد دون تعطيل بيليه ومكان أنابيب التخصيب النووي على الجليد. ملاحظة: بيليه التخصيب النووي قد فصل أيضا من الأنبوب أثناء استخراج طاف. لتجنب جمع بيليه التخصيب النووي، ضع طرف ماصة مباشرة طn لبيليه التخصيب النووي لزجة واستدراجه حتى مع ماصة من أجل التخلص منه.
- تحديد تركيزات البروتين من كل عينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام هذه المقايسات البروتين الكمي كما BCA أو برادفورد.
2. عينة إعداد والكهربائي
- إعداد كل عينة وفقا للجدول التالي المبين أدناه. كبديل، يمكن أن تستخدم أيضا β-المركابتويثانول في تركيز النهائي من 2.5٪. ومع ذلك، يجب إضافة عامل مختزل لكل عينة تصل إلى ساعة قبل تحميل هلام. مجموع الحسابات عن الاختلافات حجم pipetting لمع فقط 20 ميكرولتر من كل عينة أعدت تحميلها لكل بئر.
REAGENT نموذج تخفيض البروتين عينة X ميكرولتر 4X LDS العازلة عينة 6 ميكرولتر 500 نانومتر DTT الأحمرucing كيل 2.4 ميكرولتر المياه منزوع الأيونات ما يصل إلى 15.6 ميكرولتر اجمالى حجم التداول 24 ميكرولتر - عينات الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في حين أن العينات يتم تسخين، وإعداد 1،000 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة (50 مل 20x وزارة التربية والعلم أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت بالإضافة إلى 950 مل من الماء منزوع الأيونات). اجتماعات الأطراف تشغيل عازلة يحل البروتينات متوسطة الحجم بين 14-200 كيلو دالتون، في حين MES تشغيل المخزن المؤقت يحل البروتينات الوزن الجزيئي أصغر بين 2-200 كيلو دالتون مع انخفاض الباكاف الحمضية، والذي يسمح للMES تشغيل مؤقت لتشغيل أسرع من اجتماعات الأطراف 4. وبالتالي، هذه المخازن المؤقتة اثنين والمتناقضة الآثار على هجرة الأيونات داخل هلام التراص الذي يؤدي إلى اختلافات في فصل العصابات البروتين 4. جانبا والجمع بين 200 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت مع 500 ميكرولتر من مضادات الأكسدة، والتي سيتم استخدامها لملء الغرفة العازلة العلوي من الحد الأدنىط خلية وحدة الكهربائي.
- حالما يتم الانتهاء من عينات التدفئة، وعينات تدور بسرعة قبل وضعها على الجليد.
- لتجميع مسبقة الصنع المواد الهلامية مكرر تريس في وحدة مصغرة الخليوي لالكهربائي اتباع تعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: التأكد من أنها موجهة لكل هلام في مثل هذه الأزياء التي أقصر (أصغر) الكاسيت كل هلام يواجه الداخل نحو العازلة الأساسية والمواد الهلامية هي مستوى والضغط بإحكام ضد العازلة الأساسية لتجنب تسرب من غرفة المخزن العلوي.
- ملء الغرفة العازلة العلوي مع 200 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة التي تحتوي على مضادات الأكسدة والغرفة السفلى العازلة وحدة مصغرة الخليوي مع حوالي 600 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت. يمكن حفظ اضافية 200-300 مل من العازلة على التوالي لاستخدامها لاحقا. ومع ذلك، فمن غير المستحسن لإعادة تدوير العازلة المستخدمة أثناء التشغيل الكهربائي مثل الرقم الهيدروجيني ونوعية المخزن المؤقت يمكن تغييرها.
- تحميل 20 ميكرولتر من كل عصيدة البروتينلو في كل بئر. إذا باجتزاء الغشاء في مختلف شرائط من أجل تحقيق عن الأجسام المضادة متعددة (أي أكثر من 2)، فمن المستحسن للغاية لتحميل 2-5 ميكرولتر من مستوى البروتين prestained في الآبار الأول والأخير من كل الجل لأن هذا سيكون بمثابة قطع أدلة لفصل أجزاء مختلفة من الغشاء دون التأثير على التصوير من العصابات البروتين.
- المواد الهلامية في تشغيل 200 V المستمر لمدة 35 دقيقة مع تيار المتوقعة من 110-125 مللي أمبير / هلام في بداية و70-80 مللي أمبير في هلام في نهاية المطاف. الكهربائي اكتمال عندما يهاجر الصبغة تتبع لسلك البلاتين على طول العازلة الأساسية.
3. نقل البروتين باستخدام نظام التنشيف iBlot الجاف
- تماما فصل المواد الهلامية-مصغرة عن طريق كسر الجانبين المستعبدين من الكاسيت (و يمكن أن تنتج ضوضاء طقطقة). تجاهل أقصر (أصغر) لوحة ونقل بعناية الجل من أطول (مشقوق) لوحة في وعاء مع الماء منزوع الأيونات وإزالة الجزء السميك القدمين من هلام الموجود في الجزء السفلي. ملاحظة: في حالات نادرة، وهلام قد نعلق على لوحة أقصر بدلا من أطول وفترة زمنية محددة لوحة. في هذه الحالة، تجاهل لفترة أطول، لوحة فترة زمنية محددة وإزالة الجزء السميك القدمين من هلام الموجود في الجزء السفلي. ثم، ونقل بعناية الجل من لوحة أقصر في الماء منزوع الأيونات.
- تجميع القطب الموجب والسالب مداخن نقل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: تقديم كل النيتروسليلوز أو PVDF الأغشية عالية الجودة وكفاءة نقل البروتينات ومتوافقة مع كشف الفلورسنت 8. ومع ذلك، غشاء PVDF لديها القدرة ملزمة أعلى (240 ميكروغرام / سم 3) من النيتروسليلوز (200 ميكروغرام / سم 3) 8.
- إزالة بعناية وأي فقاعات الهواء المحبوس أو بين جل وغشاء لأن هذا منع أي تشويه للنطاقات البروتين أثناء عملية النقل. ملاحظة: لا تقليم الغشاء أو TRANSFإيه كومة لتتناسب مع حجم الجل الخاص بك وهذا سوف يسبب الاتصال المباشر بين القطب الموجب والسالب المداخن.
- بعد تجميع صحيح مداخن نقل على الجهاز النشاف الجاف، حدد البرنامج الجهد المناسب (أي البرنامج 3: 20 V لمدة 7 دقائق) وتبدأ عملية النقل. ملاحظة: البروتينات أكبر من 150 كيلو دالتون تميل تهاجر ببطء أكثر، وربما تتطلب وقتا أطول من نقل 8-10 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، سوف الحضانة مسبقة من هلام في الإيثانول 20٪ لمدة 5-10 دقيقة تساعد أيضا على تحسين كفاءة نقل هذه البروتينات الكبيرة. مرة واحدة في برنامج نقل كاملة، سوف تغلق الجهاز تلقائيا الحالي. فمن الأفضل لإزالة الغشاء فورا والشروع في إجراءات حجب لضمان أفضل كشف عن البروتين وتجنب جفاف الغشاء.
4. الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري
- كتلة الغشاء (ق) في ما لا يقل عن 0.8 مل / سم 2 من أوديسي حجب العازلة (لا تقم بإضافة توين 20) لمدة 1 ساعة أوبين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ويمكن أيضا غشاء (ق) يكون قد تم حظره مع الحليب الجاف الخالي، ولكن هذا قد يسبب الخلفية أعلى وتتداخل مع الكشف عن البروتين.
- احتضان الغشاء (ق) في الأجسام المضادة الأولية في التركيز المطلوب في أوديسي حظر مؤقت مع 0.1٪ توين 20 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. للكشف عن اللونين، والتي هي تصور اثنين من مستضدات مختلفة على نفس وصمة عار، ويجب أن تستمد اثنين من الأجسام المضادة الأولية من مختلف الأنواع المضيفة، وأضاف في وقت واحد لغشاء (ق). ملاحظة: قبل احتضان الغشاء (ق) في الأجسام المضادة الأولية، وغشاء (ق) يمكن مقطوع الى قطع مختلفة من أجل تحقيق عن الأجسام المضادة متعددة (أي أكثر من 2) على نفس الغشاء.
- يغسل الغشاء (ق) 3X لمدة 10 دقيقة في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 مع الهز لطيف.
- احتضان الغشاء (s) مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في التخفيف من 1:20،000 للقناة 700 نانومتر و1:6،000-1:10،000 للقناة 800 نانومتر في Odysseذ حظر مؤقت مع 0.1٪ توين 20 لمدة 30-60 دقيقة (تفرخ غشاء (ق) لمدة أطول من 1 ساعة قد تزيد الخلفية). حماية الغشاء (ق) من الضوء. ملاحظة: في حاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية التي يمكن جنيها من الأنواع المضيفة نفس كل واحد من الأجسام المضادة الأولية والمسمى مع fluorophores مختلفة.
- يغسل الغشاء (ق) 3X لمدة 10 دقيقة في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 مع الهز لطيف. حماية الغشاء (ق) من الضوء.
- غشاء (ق) قد تكون جافة أو تخزينها في أي TBS أو برنامج تلفزيوني بدون توين 20 في 4 درجات مئوية حتى الممسوحة ضوئيا والمصورة مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء. سوف إشارة الفلورسنت تبقى مستقرة لعدة أشهر إذا محمية بشكل صحيح من الضوء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اللونين مضان الأشعة تحت الحمراء بالكشف عن العصابات القوية والضعيفة على حد سواء على نفس الغشاء مع زيادة في الحساسية وإشارة إلى نسبة الضوضاء أعلى لإنتاج واضحة الصور لطخة غربية. ومن الأمثلة على النتائج النموذجية التي تم إنشاؤها بواسطة اللونين الكشف طخة غربية تصور في كل من نانومتر 700 و 800 نانومتر القنوات الفلورسنت في أرقام 1 و 2. لطخة غربية تحتل مركز الصدارة في الشكل 1 يبين المتزامنة (تراكب) الكشف عن مجموع ERK1 / 2 في القناة 800 نانومتر (الأخضر) وβ-أكتين في القناة 700 نانومتر (الأحمر) من التخفيفات المسلسل من شقين لست] من الإنسان المستمدة من خط الخلية سرطان الجلد، WM793. بالإضافة إلى ذلك، كما تم خفض هذا الغشاء إلى أقسام على أساس الأوزان الجزيئية من الأهداف البروتين المطلوب من أجل السماح لأكثر من عقدين من الأجسام المضادة التي يتعين بحثها على نفس وصمة عار. على سبيل المثال، تم قطع الغشاء تحليلها في الشكل 1 في نصف بغية تحقيق انخفاض الميناءأيون الغشاء مع الضد الثالث، مجموع BIM (700 نانومتر القناة الحمراء) دون استنتاج مع الكشف عن كل من إجمالي ERK1 / 2 و β-أكتين. الفريق الأول من الشكل 2 يوضح كذلك اللونين طخة غربية كشف الفلورسنت من الفوسفات-ERK1 / 2 (800 نانومتر قناة خضراء) ومجموع ERK1 / 2 (700 نانومتر القناة الحمراء) مع تداخل الإشارات الفوسفات إرك ومجموع إرك عرض في الصفراء من خلايا سرطان الجلد WM793 المعالجة في وجود وعدم وجود المانع MEK1 / 2، PD0325901 (مكي)، الذي يقمع ERK1 / 2 MAP كيناز يشير المسار. علاوة على ذلك، يمكن أيضا تحويل نانومتر 700 و 800 نانومتر الفلورسنت الصور إلى صور لطخة غربية سوداء وبيضاء موحدة لكل الأجسام المضادة (الشكلان 1 و 2). بشكل عام، فإن غالبية الصور لطخة غربية التي ينتجها هذا البروتوكول ينتج عنه صور عالية الجودة كما عرضت في أرقام 1 و 2. ومع ذلك، اعتمادا على الانتقائية، والنوعية،ونوعية الأجسام المضادة الأولية، أقل من الصور الأمثل يمكن أن يؤدي في جزء صغير من البقع تحليلها من قبل هذه المنهجية. على سبيل المثال، كما لوحظ في الجزء السفلي فريقين من الشكل 2، نتج نوعية سوببر من الأجسام المضادة الفوسفات-BIM في خلايا سرطان الجلد WM793 تعامل مع مجاهدي خلق ودون تثبيط في صورة لطخة غربية مع العصابات البروتين خافت والخلفية غشاء عالية للغاية.
في وقت واحد التصوير بالأشعة تحت الحمراء الفلورسنت من هدفين يمكن أن توفر أيضا الفرصة للتحليل الكمي من البقع الغربية أكثر من ذلك، مجموعة ديناميكية الخطية واسعة من قبل بكفاءة ودقة الكشف عن العصابات القوية والضعيفة على حد سواء على نفس الغشاء. يتم حساب الكمي للنطاقات البروتين باعتباره شدة المتكاملة، والتي تتناسب مع كمية الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى على الغشاء ومستقلة عن كل من حجم وشكل رسمها حول الفرقة والقرار. ويستند هذا على المعايير التالية: 1) هي(أ) من الشكل؛ 2) عدد وحدات البكسل المغلقة في الشكل؛ 3) متوسط كثافة البيكسل المحددة كخلفية و؛ 4) كثافة مجموعه بكسل المغلقة في شكل معين 10 ويبين الشكل 3A الكمي من البروتين البقع الغربي هو موضح في الشكل 1. الكمي من مجموع ERK1 / 2، β-أكتين، ومجموع المعرض BIM وجود علاقة خطية بين زيادة في كثافة متكاملة للإشارة الفلورسنت والزيادة في تركيز البروتين (الشكل 3A). علاوة على ذلك، الشكل 3B هو مثال آخر على كيفية قياس مستويات البروتين من البقع الغربية الفلورسنت، مما يدل على تقدير البروتين من الفوسفات-ERK1 / 2 في مجموع تطبيع مستويات ERK1 / 2 البروتينية للخلايا سرطان الجلد WM793 تعامل مع مجاهدي خلق ودون تثبيط من الشكل 2 . من هذا التحديد الكمي، ويمكن حساب فسفرته مستويات ERK1 / 2 كنسبة مئوية من مستويات الرقابة. في هذا كاليفورنياحد ذاتها، وكانت مستويات الفوسفات-إرك من خلايا سرطان الجلد تعامل مع مجاهدي خلق المانع 0.6٪ من عنصر التحكم.
تم فصل الشكل 1. تحليل لطخة غربية باستخدام اللونين الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري. لست] من شقين التخفيفات التسلسلي للWM793 البروتين المشتق من سرطان الجلد البشري باستخدام هلام NuPAGE NOVEX مكرر تريس مع بروتين نقل على غشاء PVDF باستخدام جهاز نقل iBlot . سدت في الأغشية أوديسي حظر مؤقت وبحث مع الأجسام المضادة الأولية التالية: أرنب المضادة للمجموع ERK1 / 2، أرنب المضادة للمجموع BIM، والماوس المضادة للβ-أكتين. تم الكشف عن مركبات ضد مستضد باستخدام الفلورسنت الماعز المضادة للأرنب IRDye 800 (أخضر) أو 680 (أحمر) والماعز المضادة للماوس IRDye 680 (الحمراء) الأجسام المضادة الثانوية، على التوالي،وتصور مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء الكلاسيكية أوديسي LI-النواب. أول لوحة لطخة غربية هي تراكب للكشف في وقت واحد من الكل ERK1 / 2 (800 نانومتر قناة خضراء) وβ-أكتين (700 نانومتر القناة الحمراء) إشارات الفلورسنت. الفريق الثاني هو على قناة واحدة كشف الفلورسنت من بيم اجمالي على نفس الغشاء الذي يفصل باستخدام شفرة حلاقة على أساس الأوزان الجزيئية لهذه البروتينات المستهدفة. انخفاض ثلاث لوحات لطخة غربية هي الصور بالأبيض والأسود للقناة واحدة الصور الفلورسنت فصلها.
الشكل 2. مثال على حد سواء ذات جودة عالية الفقراء وصورة لطخة غربية باستخدام مضان الأشعة تحت الحمراء. WM793 خلايا سرطان الجلد تعامل مع أي DMSO (CTL) أو 2 ميكرومتر من المانع مجاهدي خلق، PD0325 901 (مكي)، لمدة 18 ساعة وقد تم تحليل كما هو موضح في الشكل 1. تم بحثها الغشاء مع الأرنب مكافحة الفوسفات-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204)، والماوس المضادة للمجموع ERK1 / 2، والماوس المضادة للالفوسفات-BIM (Ser69) مع مركبات ضد مستضد الكشف مع الماعز المضادة للأرنب IRDye 800 (الأخضر) والماعز المضادة للماوس IRDye 680 (الحمراء). أول لوحة لطخة غربية هي تراكب للكشف في وقت واحد من كل من إجمالي ERK1 / 2 (700 نانومتر القناة الحمراء) إشارات الفلورسنت الفوسفات-ERK1 / 2 (800 نانومتر قناة خضراء) و. لوحات الثانية والثالثة هي الصور بالأبيض والأسود من الصور على قناة واحدة الفلورسنت من الفوسفات ومجموع ERK1 / 2. والجزء السفلي من لوحات هي الصور الفلورسنت والأسود والأبيض من الفوسفات-BIM. هذه الصور تمثل مثالا لطخة غربية سوببر التي يمكن أن تؤدي مع هذا الأسلوب نظرا لنوعية دون المستوى المطلوب من الأجسام المضادة الأولية.
p_upload/51149/51149fig3highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
الرقم 3. تم تحديد أمثلة من البروتين الكمي من البقع الغربية الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء. A) الكمي من مجموع ERK1 / 2، β-أكتين، ومجموع مستويات البروتين BIM عن طريق حساب كثافة متكاملة من كل فرقة البروتين. كثافة متكامل يتناسب مع كمية الأجسام المضادة الثانوية فلوري المسمى على الغشاء. تم احتساب استخدمت القيم التربيعي أيضا لتقييم الانحدار الخطي لكل من الأجسام المضادة التي تم تحليلها في الشكل رقم 1. B) الكمي من الفوسفات-ERK1 / 2 في مجموع تطبيع ERK1 / 2 مستويات البروتين من الشكل 2 باستخدام شدة المتكاملة لل يتم تقديم إشارة والبيانات الفلورسنت كنسبة مئوية للسيطرة DMSO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في توليد عالية الجودة، والبقع الغربية الكمي وفقا لهذا البروتوكول هي التالية: 1) قياس تركيزات البروتين؛ 2) إعداد العينات؛ 3) منع الغشاء و؛ 4) ذات جودة وعيار الأجسام المضادة الأولية.
دقة قياس تركيزات البروتين الكلي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على قياس البروتين العصابات منذ حساسية استثنائية من الكشف عن الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت وتضخيم أي اختلافات طفيفة جدت في تركيز البروتين من العينات. لتجنب التضارب في تحديد تركيز البروتين، وتوليد منحنى القياسية مع خط الانحدار الخطي أو قيمة الجذر التربيعي أقرب إلى 1 ممكن (R 2 ≥ 0.99 أو أفضل) مهم في حساب دقيق للتركيز البروتين من كل عينة . على سبيل المثال، إذا انخفض R 2 قيمة أقل من 0.99، وإعداد معايير BSA جديدة مع الماء عالى النقاء وتكرار بعنايةالبروتين الكمي الفحص قد يساعد على زيادة قيمة R 2. بل هو أيضا أفضل لتجنب باستخدام pipettor الأقنية لأن هذا سوف يولد تناقضات في pipetting لأنه قد يسهم في خفض R 2 القيم وعدم الدقة في تركيزات البروتين من العينات.
إعداد نموذج يلعب دورا هاما في تحديد نوعية العصابات البروتين، والتي يمكن أن يكون لها أيضا تأثير مباشر على القياس الكمي لهذه العصابات. عند استخدام نظام هلام مكرر تريس، ينصح بشدة أن يتم إعداد العينات مع LDS عينة العازلة لأن درجة الحموضة القلوية قليلا (8.5) من هذا المخزن المؤقت يوفر الظروف المثلى للحد من السندات ثاني كبريتيد وتمسخ 4. يحتوي هذا المخزن المؤقت عينة أيضا صبغة تتبع Coomassie G250 التي تنتج جبهة صبغ الحادة التي يهاجر مع تحريك الجبهة أيون، مما يساعد على ضمان أن الببتيدات الصغيرة لا تعمل قبالة هلام 4. الأهم من ذلك، عينة LDSالعازلة يقلل من الانقسام السندات الببتيد aspartyl-prolyl عندما يتم تسخين العينات عند 70 درجة مئوية ويرجع ذلك إلى درجة الحموضة من المخزن المؤقت تغيير 8،5-8،0 4. هذه النتائج في بيئة مثالية لخفض والألكلة من البروتينات مع الحفاظ أيضا على سلامة البروتين. ومع ذلك، إذا تم استخدام عينة العازلة تريس، جليكاين SDS بدلا من LDS عينة العازلة، وهذا سوف يؤدي إلى الانقسام من السندات aspartyl-prolyl، انخفاض في الحدة من العصابات البروتين، وزيادة تجزئة البروتين 4. الجدير أيضا لإضافة مضادات الأكسدة إلى الدائرة العازلة العلوي من وحدة الكهربائي البسيطة خلية. منذ مضادات الأكسدة قادرة على comigrate مع العينات في درجة الحموضة محايدة في النظام هلام مكرر تريس، وهذا يمكن أن يساعد في الحفاظ على البروتينات في حالة انخفاض وحماية السندات ثاني كبريتيد وكذلك الأحماض الأمينية الحساسة ضد الأكسدة، في حين أن غياب المضادة للأكسدة يمكن يؤدي إلى العصابات البروتين منتشر 4. وأخيرا، فمن غايةأوصت لاستخدام إما MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة مع المواد الهلامية مكرر تريس بدلا من استخدام تريس، جليكاين SDS تشغيل المخزن المؤقت مع هذه الأنواع من المواد الهلامية. مزيج من تريس، جليكاين SDS تشغيل العازلة ومكرر تريس المواد الهلامية النتائج في الهجرة بطء أيونات الجلايسين مما تسبب في زيادة كبيرة في الكهربائي تشغيل الوقت مع العصابات التي تظهر أكثر مضغوط و 4 على شكل الكأس.
الخطوة عرقلة أمر حاسم أيضا لإنتاج صور عالية الجودة لطخة غربية باستخدام الكشف الفلوري أكبر عدد ممكن من مختلف وكلاء عرقلة يمكن أن تولد خلفية غشاء عالية. للكشف عن الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت، فمن الأفضل لاستخدام أوديسي حظر مؤقت لأن هذا الوكيل حجب محددة يزيد من حساسية كشف عن البروتين مع المحافظة على خلفية منخفضة. على الرغم من أن الحليب الخالي الجافة، الكازين، أو BSA يمكن أيضا أن تستخدم وكلاء حجب البديلة، هذه الأنواع من الحلول يمكن أن يسبب ارتفاع الخلفية الغشاء وفي بعض الحالات انخفاض في بيندينانوغرام تقارب من الأجسام المضادة الأولية 10. بالإضافة إلى ذلك، قد تحتوي على حاصرات بالحليب مفتش التي يمكن أن تتفاعل مع الصليب الفوسفات-الحواتم والأجسام المضادة للماعز، والتي يمكن أن تتداخل مع دقة كشف عن البروتين والأجسام المضادة المناسبة ملزمة 9،11. ومع ذلك، إذا تم ابتليت صورة لطخة غربية عن طريق الخلفية عالية، والعصابات غير محددة، أو ضعيفة / أي إشارة، ثم استخدام واحد من هذه العوامل حجب بديلة قد تساعد على تحسين جودة الصورة. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن أيضا لتجنب إضافة المنظفات إلى الخطوة الحجب وحضانات حظر دام هذا قد يؤدي إلى زيادة في الخلفية و / أو فقدان البروتين الهدف من الغشاء 9،12.
كشف في وقت واحد اثنين مستضدات مختلفة على نفس طخة باستخدام الأجسام المضادة بالأشعة تحت الحمراء المسمى مع 700 نانومتر و 800 نانومتر صبغ قناة الحكمة يتطلب اختيار كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. يجب أن تكون مستمدة من الأجسام المضادة الأولية اثنين من ملتحقا مختلفةالأنواع ر. على سبيل المثال، إذا مشتق واحد من الأجسام المضادة الأولية أرنب، ثم يحتاج الأجسام المضادة الأولية الثانية التي يمكن جنيها من مختلف الأنواع الأخرى من الأرانب، مثل الماوس. وبالمثل، في حاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية الأشعة تحت الحمراء أيضا لتكون مستمدة من الأنواع المضيفة نفس كل واحد من الأجسام المضادة الأولية والمسمى مع fluorophores مختلفة. على سبيل المثال، الماعز المضادة للأرنب في القناة 800 نانومتر يمكن دمجها مع الماعز المضادة للماوس في القناة 700nm من أجل مراقبة بدقة إشارة البروتين من اثنين من الأجسام المضادة الأولية المختلفة التي هي مستمدة من الأرانب والفئران.
الأجسام المضادة الأولية تختلف اختلافا كبيرا في نوعيتها، تقارب، والحساسية للمستضد بهم. هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض كبير في إشارة أو زيادة في الربط غير محدد من البروتينات إلى غشاء مما خلق صعوبات في تصور بدقة البروتين الهدف. وبالتالي، باستخدام حل حجب البديلة، مثل الحليب الجاف الخالي أوالكازين الذائب في برنامج تلفزيوني، قد تساعد على تحسين الكشف عن البروتين مع ذات نوعية رديئة الأجسام المضادة الأولية 10. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للتركيز المنظفات تؤثر أيضا على ملزمة من الأجسام المضادة الأولية للمستضد هدف وقائي يجب أخذها في الاعتبار عند تحديد تركيز المنظفات من أجل تجنب غسل بعيدا الأجسام المضادة. على تركيز منخفض من SDS (0.01-0.02٪) يمكن أن تقلل من خلفية غير محددة وملزمة عندما تضاف إلى الأجسام المضادة الثانوية المخفف، وخاصة عند استخدام غشاء PVDF 10. ومع ذلك، يمكن أيضا تعطيل SDS مستضد الضد ملزمة مما يؤدي إلى انخفاض شديد في قوة الإشارة.
وعلاوة على ذلك، فإن التعديلات الرواية الموصوفة في هذا البروتوكول يجسد نهجا الحديثة لتقنية النشاف الغربية التقليدية. هذه التطورات المتطورة بشكل كبير تحسين فعالية واتساق، وحساسية البيانات الغربية ويسمح لتقدير دقيق لعدة البروتينات المستهدفةعلى نفس الغشاء بغض النظر عن قوة الإشارة الخاصة بهم. الأهم من ذلك، هذه التعديلات أيضا قيمة الحد بشكل كبير من الوقت التجريبية على أداء لطخة غربية في حين أن إنتاج البيانات الكمية والنوعية العالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر مكماهون قدموه من مساعدة والدعم. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح من / NCI R01 CA176839-01 (لMM) وجائزة البحوث المؤسسية والأكاديمية التطوير الوظيفي (IRACDA لJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 | |
| 4x NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | |
| 10x NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 | |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 | |
| 20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX | |
| SeeBlue Plus2 Prestained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 | |
| iBlot Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 | |
| β-Actin | Sigma | A2228 | |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A | |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 | |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 | |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 | |
| Odyssey Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Odyssey Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- iBlot Dry Blotting System. Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).
- Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).
- Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L. Human Milk Composition. Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
