Summary
Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.
Abstract
De Western blot technieken die oorspronkelijk werden opgericht in de late jaren 1970 zijn nog steeds actief gebruikt vandaag. Echter, deze traditionele methode van Western blotting heeft een aantal nadelen dat lage kwaliteit resolutie, onechte bands, verminderde gevoeligheid, en een slechte eiwit integriteit omvatten. Recente ontwikkelingen zijn drastisch verbeterd tal van aspecten van de standaard Western blot protocol om hogere kwalitatieve en kwantitatieve gegevens te produceren. De Bis-Tris gel systeem, een alternatief voor de conventionele Laemmli systeem, genereert een betere scheiding van eiwitten en resolutie, onderhoudt eiwit integriteit, en vermindert elektroforese een 35 min looptijd. Bovendien is de iBlot droge blotting systeem drastisch verbetert de effectiviteit en de snelheid van eiwit overdracht aan het membraan 7 minuten, dit in tegenstelling tot de traditionele eiwit overdrachtmethoden die vaak meer inefficiënt met lange overstaptijden. In combinatie met deze zeer innovatieve modificaties, eiwit detection met infrarood fluorescerende beeldvorming resulteert in een hogere kwaliteit, meer accurate en consistente gegevens vergeleken met de standaard Western blotting techniek van chemiluminescentie. Deze technologie kan simultaan twee verschillende antigenen op dezelfde membraan door gebruik tweekleurige nabij-infrarode kleurstoffen die worden gevisualiseerd in verschillende fluorescente kanalen. Bovendien zijn de lineariteit en grote dynamiek van fluorescerende beeldvorming maakt de precieze kwantificering van zowel sterke als zwakke eiwitbanden. Dus dit protocol beschrijft de belangrijkste verbeteringen van de klassieke Western blotting methode, waarbij deze ontwikkelingen verhogen de kwaliteit van gegevens tijdens de speeltijd van dit experiment sterk verminderen.
Introduction
De techniek van Western blotting werd ontwikkeld tussen 1977 en 1979 om een betere werkwijze te creëren voor het detecteren van eiwitten met behulp van antilichamen 1-3. Deze procedure gebruikt elektroforetische overdracht van eiwitten aan membranen van SDS-PAGE gels met doeleiwitten gevisualiseerd met secundaire antilichamen en gedetecteerd door autoradiografie, UV-licht, of een peroxidase reactieproduct 3. Aldus dezelfde basisprincipes nog steeds veel gebruikt in de huidige Western blot protocollen. Echter, deze klassieke Western blotting techniek biedt wel veel nadelen, zoals langzame elektroforese doorlooptijden, lage resolutie en kunstmatige eiwit bands, gevoeligheid voor afbraak van eiwitten, en beperkte gevoeligheid evenals een slechte kwaliteit van de gegevens 4. Daarom is dit protocol beschrijft significante vooruitgang en verbeteringen aan de standaard westernblotprocedure dat nauwkeuriger kwalitatieve en kwantitatieve gegevens genereert.
"> Het Laemmli voor het scheiden van een groot aantal eiwitten door SDS-PAGE is de meest gebruikte gel voor Western blotting 5. Ondanks de populariteit van deze Western blotting systeem kan deze werkwijze leiden band vervorming, verlies van resolutie, en onechte banden 4. Dit kan een gevolg van de deaminering en alkylering van eiwitten door de hoge pH (9,5) van de scheidende gel, re-oxidatie van gereduceerde disulfidebindingen vanwege de verschillende redox toestand van de gel, en splitsing van aspartyl-prolyl zijn peptidenbindingen vanwege het verwarmen van het eiwit in Laemmli buffer (pH 5,2) 4,6. De Bis-Tris gel systeem, dat werkt op een neutrale pH (7.0), biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de Lamemmli systeem. Dit systeem verbetert eiwitstabiliteit, minimaliseert eiwitmodificaties, onderhoudt eiwitten in hun verminderde staten, voorkomt aspartyl-prolyl decollete tijdens de elektroforese, en nog belangrijker, de elektroforese looptijd is 35 min. 4,6,7. Bovendien, thij Bis-Tris gel systeem produceert ook scherpere bands, hogere resolutie en scheiding, en verhoogde gevoeligheid resulteert in meer betrouwbare gegevens 4.In combinatie met de Bis-Tris gelsysteem, de iBlot droge blotting systeem maakt gebruik veldsterkte en stromen aanzienlijk verminderen de transfer van eiwitten uit gelen op membranen binnen 7 min. 8. Deze overdracht is gebaseerd op het droge blotting methode die een efficiënte en betrouwbare overdracht van eiwitten 8 genereert. Voor een gedetailleerde vergelijking van de werkzaamheid van het iBlot transfersysteem met de conventionele overdracht systemen verwijzen wij u naar de volgende website: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Het maakt gebruik van een anode en kathode stack, die bestaan uit een gelmatrix die de passende overdracht buffers, die als ion reservoirs 8 bevat. Tijdens de overdracht water elektrolyse helpt voorkomen de vorming van zuurstof uit de koperanode resulteert in een consistentere proteïnetransfer zonder dat vervorming band 8. Bovendien, deze overdracht verhoogt ook de snelheid van het verminderen van de afstand tussen de elektroden 8.
Hoewel chemiluminescentie is de meest voorkomende en traditionele techniek voor detectie van eiwit Western blot analyse, twee-kleuren infrarood fluorescerende detectie verbetert de gevoeligheid, kwaliteit en nauwkeurigheid van Western blot data. Deze detectiemethode gebruikt infrarood laser excitatie twee optimale golflengten 700 nmen 800 nm, een duidelijke beeldgegevens met de grootste signaal-ruisverhouding en de hoogste gevoeligheid 9 genereren. Aldus kunnen beide doeleiwitten tegelijkertijd gevisualiseerd op hetzelfde membraan met de 700 nm en 800 nm fluorescentiedetectie kanalen. Belangrijker is dat de lineariteit en dynamische bereik van infrarood fluorescentie maakt nauwkeurige kwantitatieve analyse van zowel sterke als zwakke eiwitbanden 9. Bovendien is dit protocol levert enorme voordelen en verbeteringen ten opzichte van de klassieke Western blotting techniek verlagen de elektroforese en overdrachtstijden van dit experiment zonder de werkzaamheid van deze processen gebruik infrarood fluorescerend eiwit detectie grotere kwalitatieve en kwantitatieve Western blot data produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Whole Cell Lysaten van Cultuur van de Cel
- Plaats celcultuurschalen op ijs en voeg koude PBS met 5 mM EDTA (bijv. 5 ml PBS met 5 mM EDTA/10 cm 2 plaat). Verwijder hechtende cellen van de schaal met een cel schraper en breng de celsuspensie aan een koude 15 ml conische buis.
- Pellet de celsuspensies door lage snelheid centrifugatie bij 1000 rpm (230 xg) gedurende 5 min bij 4 ° C. Plaats conische buizen op ijs en het supernatant voorzichtig zuigen zonder verstoring van de pellet.
- Was de pellet met 1 ml PBS met 5 mM EDTA en overbrengen celsuspensie een koude 1,5 ml centrifugebuis. Quick Spin suspensie bij 13.000 rpm (13.226 x g) gedurende 10 seconden om cellen te pelleteren. Verwijder supernatant voorzichtig zonder verstoring van de pellet en plaats buisjes op ijs.
- Resuspendeer de pellet in 25-200 pi (afhankelijk van de korrelgrootte, bijvoorbeeld 3 x 10 6 cellen commentaar ~ 150 ul RIPA-buffer) inRIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% NP-40) met vers toegevoegde protease en fosfataseremmers in een 2x eindconcentratie. Kort vortex elke buis en incubeer suspensie voor 20-30 minuten op ijs. Noot: er zijn verschillende lysis buffers die kunnen worden gebruikt om eiwitten te extraheren, die verschillen in hun vermogen om eiwitten en sterkte van de denaturering detergens (bijvoorbeeld SDS, Triton X-100 of NP-40) oplosbaar. RIPA buffer bruikbaar voor het bereiden gehele cellysaten en verstoren eiwit-eiwit interacties.
- Een post-nucleaire fractie centrifuge lysaten maken bij 14.000 rpm (15.339 x g) gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande naar een nieuwe buis zonder verstoring van de nucleaire verrijkte pellet en plaats buisjes op ijs. Let op: de kern-verrijkte pellet kan ook los van de buis bij het uitpakken van het supernatant. Om het verzamelen van de nucleaire verrijkte pellet te gaan, moet de pipet direct into de viskeuze-nucleaire verrijkte pellet en het op te stellen met de pipet om te beschikken.
- Bepaal de eiwitconcentraties van elk monster volgens de instructies van de fabrikant met dergelijke eiwitten kwantificering assays BCA of Bradford.
2. Monstervoorbereiding en elektroforese
- Bereid een monster volgens de volgende tabel hieronder beschreven. Als alternatief kan β-mercaptoethanol worden gebruikt bij een eindconcentratie van 2,5%. Toch moet het reductiemiddel aan elk monster tot een uur worden toegevoegd voordat de gel. Het totale volume is goed voor pipetteren variaties met slechts 20 pi van elke bereide monster geladen per putje.
REAGENS Deelmonster Eiwitmonster X pi 4x LDS Sample Buffer 6 pl 500 nM DTT Reducing Agent 2.4 pl Gedeïoniseerd Water Tot 15,6 ul Totaal Volume 24 pl - Warmte monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Terwijl de monsters zijn verwarming, voorbereiden 1000 ml 1x MES of MOPS Running Buffer (50 ml 20x MES of MOPS Running Buffer plus 950 ml gedemineraliseerd water). MOPS loopbuffer lost middelgrote eiwitten van 14-200 kDa, terwijl MES loopbuffer lost kleiner molecuulgewicht eiwitten tussen 2-200 kDa met een lagere pKa, waardoor de MES loopbuffer sneller dan de MOPS 4 lopen. Zo hebben deze twee buffers contrasterende effecten op de migratie van ionen in de stacking gel die leidt tot verschillen in de scheiding van de eiwitbanden 4. Zet opzij en combineer 200 ml van 1x MES of MOPS loopbuffer met 500 ui Antioxidant, die zal worden gebruikt om de bovenste Buffer kamer van het Min vulleni-Cell elektroforeseapparaat.
- Zodra de monsters worden afgewerkt verwarming, snelle draai monsters voordat u ze op ijs.
- Voor de montage van de prefab Bis-Tris-gels in de Mini-Cell eenheid voor elektroforese volg de instructies van de fabrikant. Let op: zorg ervoor dat elke gel is gericht op een zodanige wijze dat de kortere (kleinere) cassette van elke gel naar binnen gericht in de richting van de Buffer Core en de gels zijn niveau en stevig gedrukt tegen de Buffer Core om lekkage uit de Eerste Kamer Buffer vermijden.
- Vul het bovenste Buffer Kamer met de 200 ml 1x MES of MOPS Running Buffer met de Antioxidant en de Tweede Kamer Buffer van de Mini-Cell eenheid met ongeveer 600 ml 1x MES of MOPS Running Buffer. De extra 200-300 ml lopende buffer kan worden opgeslagen voor later gebruik. Het is echter niet aanbevolen de buffer tijdens de elektroforese run als pH en kwaliteit van de buffer kan worden gewijzigd recyclen.
- Plaats 20 gl van elk eiwit sample in elk putje. Als het snijden het membraan in verschillende stroken om sonde voor meerdere antilichamen (dat wil zeggen meer dan 2), is het sterk aanbevolen om 2-5 ul van de voorgekleurde eiwit standaard in de eerste en de laatste putjes van elke gel te laden als deze zal dienen als snij geleidingen voor het scheiden van de verschillende delen van het membraan zonder dat de beeldvorming van de eiwitbanden.
- Run gelen bij 200 V constant gedurende 35 minuten met een verwachte stroom van 110-125 mA / gel aan het begin en 70-80 mA per gel eind. Elektroforese is voltooid wanneer de tracking kleurstof migreert naar de platina draad langs de Buffer Core.
3. Eiwit Transfer De iBlot Dry Blotting System
- Volledig de mini-gels te scheiden door het breken van de gebonden zijkanten van de cassette (dit kan een knetterend geluid produceren). Gooi de kortere (kleinere) plaat en de gel zorgvuldig te brengen van de langere (gleuf) plaat in een bak met gedemineraliseerd water enVerwijder de dikke voeten gedeelte van de gel aan de onderkant. Opmerking: in zeldzame gevallen kan de gel het langer hechten aan de kortere plaat in plaats van, sleuven plaat. In dit geval, gooi het langer spleetplaat en verwijder de dikke voeten gedeelte van de gel aan de onderkant. Dan voorzichtig de gel te brengen van de kortere plaat om gedemineraliseerd water.
- Monteer de anode en kathode overdracht stapels volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: zowel nitrocellulose of PVDF-membranen bieden kwalitatief hoogwaardige en efficiënte overdracht van eiwitten en zijn compatibel met fluorescerende detectie 8. Echter, PVDF membraan heeft een hogere bindingscapaciteit (240 ug / cm 3) dan nitrocellulose (200 ug / cm 3) 8.
- Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen of lucht gevangen tussen de gel en membraan omdat dit een verstoring van het eiwit bands voorkomen tijdens de overdracht. Let op: doe het membraan of de transfer niet trimmener stapelen om uw gel maat passen, omdat dit zal direct contact tussen de anode en kathode stapels veroorzaken.
- Na het correct monteren van de overdracht stapels op het droge blotting apparaat, selecteert u de juiste spanning programma (dwz Programma 3: 20 V voor 7 min) en beginnen met de overdracht. Opmerking: eiwitten groter dan 150 kDa neiging migreren langzamer en kan een langere overstaptijd van 8-10 min is. Bovendien zal voorafgaande incubatie van de gel in 20% ethanol gedurende 5-10 minuten ook helpen om de overdracht efficiëntie van deze grote eiwitten verbeteren. Zodra de overdracht programma is voltooid, wordt het apparaat automatisch uitschakelen van de stroom. Het beste is om onmiddellijk te verwijderen van de membraan en doorgaan met het blokkeren procedure beter eiwitdetectie waarborgen en te voorkomen uitdroging van het membraan.
4. Infrarood Fluorescent Protein Detection
- Blok membraan (s) in een minimum van 0,8 ml / cm 2 van Odyssey Blocking Buffer (Do Not Add Tween-20) gedurende 1 uur ofovernacht bij 4 ° C. Membraan (s) kan ook worden geblokkeerd met niet vette droge melk, maar dit kan leiden tot hogere achtergrond en interfereren met eiwitdetectie.
- Incubeer membraan (s) in primair antilichaam in de gewenste concentratie in Odyssey Blocking buffer met 0,1% Tween-20 gedurende de nacht bij 4 ° C. Twee kleurdetectie, waarbij twee verschillende antigenen worden gevisualiseerd op dezelfde blot, moeten de twee primaire antilichamen afgeleid van verschillende gastheersoorten en gelijktijdig toegevoegd aan het membraan (s). Opmerking: voor het incuberen van het membraan (en) primair antilichaam, kan het membraan (s) worden gesegmenteerd in verschillende stukken om probe voor meerdere antilichamen (meer dan 2) op hetzelfde membraan.
- Was membraan (s) 3x gedurende 10 minuten in TBS plus 0,1% Tween-20 met voorzichtig schudden.
- Incubeer membraan (s) met de-fluorescent gelabelde secundaire antilichamen bij een verdunning van 1:20.000 voor de 700 nm kanaal en 1:6,000-1:10,000 voor de 800 nm kanaal in Odyssey Blocking buffer met 0,1% Tween-20 gedurende 30-60 min (incuberen membraan (s) langer dan 1 uur kunnen de achtergrond toenemen). Bescherm membraan (s) tegen licht. Opmerking: de secundaire antilichamen moeten worden afgeleid van dezelfde gastheersoort als elk van de primaire antilichamen en gelabeld met verschillende fluoroforen.
- Was membraan (s) 3x gedurende 10 minuten in TBS plus 0,1% Tween-20 met voorzichtig schudden. Bescherm membraan (s) tegen licht.
- Membraan (s) kunnen worden gedroogd of opgeslagen in TBS en PBS zonder Tween-20 bij 4 ° C totdat afgetast en afgebeeld met een infrarood Imaging System. Fluorescent signaal zal gedurende enkele maanden stabiel blijven indien goed beschermd tegen het licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twee-kleuren infrarood fluorescentie detecteert zowel sterke als zwakke banden op hetzelfde membraan met verbeterde gevoeligheid en de hoogste signaal-ruisverhouding duidelijke Western blot beelden te produceren. Typische resultaten die door twee kleuren Western blot detectie gevisualiseerd in zowel de 700 nm en 800 nm fluorescentie kanalen worden toegelicht in figuren 1 en 2. De bovenste Western blot in figuur 1 toont de gelijktijdige (overlay) detectie van totaal ERK1 / 2 in het kanaal 800 nm (groen) en β-actine in 700 nm (rood) van tweevoudige seriële verdunningen van lysaten van de menselijke afgeleide melanoomcellijn, WM793. Daarnaast heeft dit membraan ook gesneden in secties gebaseerd op de molecuulgewichten van het gewenste eiwit targets zodat meer dan twee antilichamen worden onderzocht op dezelfde blot. Zo werd het membraan in figuur 1 geanalyseerd tweeën gesneden om de onderste poort sondeion van het membraan met een derde antilichaam totale BIM (700 nm kanaal-rood) zonder het afleiden met de detectie van totale ERK1 / 2 en β-actine. Het eerste paneel van Figuur 2 toont de tweekleurige Western blot fluorescerende detectie van fosfo-ERK1 / 2 verder (800 nm kanaal-groen) en de totale ERK1 / 2 (700 nm kanaal-rood) met overlappende fosfo-ERK en de totale ERK signalen geel weergegeven van WM793 melanoom cellen behandeld in aanwezigheid en afwezigheid van de MEK1 / 2 remmer, PD0325901 (Meki), waarbij de ERK1 / 2 MAP-kinase-signaalroute onderdrukt. Bovendien kan de 700 nm en 800 nm fluorescerende beelden ook worden omgezet in de standaard zwart-wit Western blot afbeeldingen voor elk antilichaam (figuren 1 en 2). In het algemeen zal de meerderheid van Western blot beelden die door dit protocol resulteren in hoogwaardige beelden zoals getoond in figuren 1 en 2. Afhankelijk van de selectiviteit, specificiteit,en kwaliteit van het primaire antilichaam, minder dan optimaal beeld kan een klein deel van blots van deze methode geanalyseerd. Bijvoorbeeld, zoals waargenomen in de onderste twee panelen van figuur 2, de onvoldoende kwaliteit van de fosfo-BIM antilichaam in het WM793 melanoom cellen behandeld met en zonder MEK remming resulteerde in een Western blot beeld met zwakke eiwitbanden extreem hoge membraan achtergrond.
Gelijktijdige infrarood fluorescerende beeldvorming van twee doelen kunnen ook de gelegenheid voor de kwantitatieve analyse van Western blots over een breed, lineair dynamisch bereik door efficiënt en nauwkeurig opsporen van zowel sterke als zwakke bands op hetzelfde membraan. Kwantificering van eiwitbanden worden berekend als een geïntegreerde intensiteit die evenredig is met de hoeveelheid fluorescerend gemerkte antilichamen op het membraan en onafhankelijk is van de grootte van de vorm getekend rond de band en resolutie. Dit is gebaseerd op de volgende criteria: 1) zijneen van de vorm, 2) aantal pixels ingesloten in de vorm, 3) gemiddelde intensiteit van de geselecteerde als de achtergrond pixels en, 4.) totale intensiteit van de pixels ingesloten in het vormgegeven 10 Figuur 3A toont de kwantificering van het eiwit Western blots getoond in figuur 1. Kwantificering van totaal ERK1 / 2, β-actine, en de totale BIM vertonen een lineair verband tussen de toename van de geïntegreerde intensiteit van het fluorescerende signaal en de toename eiwitconcentratie (Figuur 3A). Bovendien Figuur 3B is een voorbeeld van hoe eiwitniveaus kwantificeren van tl Western blots, waarbij het eiwit kwantificering van fosfo-ERK1 / 2 genormaliseerd aan totale ERK1 / 2 eiwit niveaus WM793 melanoom cellen behandeld met en zonder MEK remming van figuur 2 toont . Hieruit kwantificering kan de gefosforyleerde ERK1 / 2 niveaus berekend als percentage van de controleniveaus. In deze caSE, fosfo-ERK niveaus van melanoma cellen behandeld met MEK remmer was 0,6% van de controle.
Figuur 1. Western blot analyse met behulp van twee-kleuren infrarood fluorescerend eiwit detecteren. Lysaten van tweevoudige seriële verdunningen van WM793-humaan melanoom afgeleide eiwitten werden gescheiden met een Novex NuPAGE Bis-Tris gel met overgebracht op PVDF-membraan eiwit met de iBlot overbrenginrichting . Membranen werden geblokkeerd Odyssey Blocking Buffer en onderzocht met de volgende primaire antilichamen: konijn anti-totaal ERK1 / 2, konijn anti-totaal BIM en muizen anti-β-actine. Antigeen-antilichaam-complexen werden gedetecteerd met fluorescerende geit anti-konijn IRDye 800 (groen) en 680 (rood) en geiten IRDye 680 (rood) secundaire antilichamen respectievelijk anti-muisen gevisualiseerd met de LI-COR Odyssey Classic Infrared Imaging System. De eerste Western Blot paneel is de overlay van de simultane detectie van het totaal ERK1 / 2 (800 nm kanaal-groen) en β-actine (700 nm kanaal-rood) fluorescerende signalen. Het tweede paneel de enkelkanaals fluorescentiedetectie totale BIM hetzelfde membraan dat werd gescheiden met een scheermesje basis van het molecuulgewicht van deze doeleiwitten. De onderste drie Western Blot panelen zijn de zwart-wit beelden van de afgescheiden single-channel fluorescerende beelden.
Figuur 2. Een voorbeeld van zowel een hoog-en een slechte kwaliteit Western Blot beeld met behulp van infrarood fluorescentie. WM793 melanoom cellen behandeld met ofwel DMSO (CTL) of 2 uM van de MEK-inhibitor, PD0325 901 (Meki), gedurende 18 uur werden geanalyseerd zoals beschreven in figuur 1. Het membraan werd gehybridiseerd met konijnen-anti-fosfo-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), muizen anti-totaal ERK1 / 2, en muis-anti-fosfo-BIM (Ser69) met antigeen-antistof complexen gedetecteerd met geiten anti-konijn IRDye 800 (groen) en geit anti-muis IRDye 680 (rood). De eerste Western Blot paneel is de overlay van de simultane detectie van zowel fosfo-ERK1 / 2 (800 nm kanaal-groen) en de totale ERK1 / 2 (700 nm kanaal-rood) fluorescerende signalen. De tweede en derde panelen zijn de zwart-wit beelden van de single-channel fluorescerende beelden van fosfor en totaal ERK1 / 2. De onderste twee panelen zijn de TL-en zwart-wit beelden van fosfo-BIM. Deze beelden vormen een voorbeeld van een alinea Western blot die kan resulteren deze methode door de mindere kwaliteit van het primaire antilichaam.
p_upload/51149/51149fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
Figuur 3. Voorbeelden eiwit kwantificering van de infrarood fluorescerende Western blots. A) Kwantificering van totaal ERK1 / 2, β-actine en BIM totale eiwitgehalte werd bepaald door de geïntegreerde intensiteit van elke eiwitband. De geïntegreerde intensiteit is evenredig met de hoeveelheid fluorescent gelabelde secundaire antilichamen op het membraan. R-kwadraat-waarden werden ook gebruikt om de lineaire regressie van elk van de antilichamen in figuur 1 geanalyseerd evalueren. B) Kwantificering fosfo-ERK1 / 2 genormaliseerd aan totale ERK1 / 2 eiwitniveaus in figuur 2 werd berekend met de geïntegreerde intensiteit van de fluorescentiesignaal en gegevens worden gepresenteerd als percentage van de DMSO-controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische stappen in het genereren van hoge kwaliteit, kwantitatieve Western blots volgens dit protocol zijn de volgende: 1) het meten proteïneconcentraties; 2) monstervoorbereiding, 3) het blokkeren van het membraan en, 4) kwaliteit en kaliber van het primaire antilichaam.
De nauwkeurigheid van het meten van het totale eiwit-concentraties kan een grote impact hebben op het kwantificeren van eiwit bands sinds de uitzonderlijke gevoeligheid van infrarood fluorescerende detectie eventuele kleine verschillen gevonden in het eiwit concentratie van de monsters zal gaan versterken. Om verschillen in de bepaling van de eiwitconcentratie, het genereren van een standaardcurve met een lineaire regressielijn of R-kwadraat zo dicht mogelijk bij 1 (R2 ≥ 0.99 of hoger) is in de precieze berekening van de eiwitconcentratie van elk monster te voorkomen . Bijvoorbeeld, als de R2 waarde beneden 0,99, die verse BSA standaarden met ultrazuiver water en voorzichtig herhaleneiwit kwantificering test kan helpen om de R2 verhogen. Het is ook best om te voorkomen dat met behulp van een multichannel pipet als deze inconsistenties in pipetteren die kunnen bijdragen tot een vermindering van R2 waarden en onjuistheden in het eiwit concentraties van de monsters zal genereren.
Monstervoorbereiding speelt een belangrijke rol bij het bepalen van de kwaliteit van de eiwitbanden die ook een direct effect op de kwantificering van deze banden. Bij gebruik van de Bis-Tris gel-systeem, is het sterk aanbevolen dat de monsters worden bereid met LDS Sample Buffer omdat het licht alkalische pH (8.5) van deze buffer zorgt voor de optimale conditie voor de reductie van zwavelbruggen en denaturatie 4. Dit monster buffer bevat ook een Coomassie G250 bijhouden kleurstof die een scherpe kleurstof front dat migreert met de bewegende ion voorzijde, die helpt om ervoor te zorgen dat kleine peptiden niet lopen van de gel 4 produceert. Belangrijker is dat de LDS SampleBuffer minimaliseert de splitsing van aspartyl-prolyl peptidebindingen als monsters verwarmd op 70 ° C door de pH van de buffer verandert 8,5-8,0 4. Dit resulteert in een ideale omgeving voor de reductie en alkylering van eiwitten, terwijl ook de integriteit van het eiwit. Indien een Tris-glycine SDS monsterbuffer plaats van de LDS monsterbuffer gebruikt, dit zal leiden tot de splitsing van de aspartyl-prolyl obligaties, een vermindering van de scherpte van de eiwitbanden en een toename eiwitfragmentatie 4. Het is ook relevant om de antioxidant toe te voegen aan de Upper Buffer Kamer van de Mini-Cell elektroforeseapparaat. Aangezien de Antioxidant kan comigreren met de monsters bij neutrale pH in het Bis-Tris gelsysteem, kan dit helpen handhaven eiwitten in gereduceerde toestand en beschermen disulfidebindingen en gevoelige aminozuren tegen oxidatie, terwijl de afwezigheid van de antioxidant leiden tot een diffuus eiwitbanden 4. Tenslotte is het hoogstaangeraden hetzij MES of MOPS loopbuffer met Bis-Tris-gels tegenstelling tot het gebruik Tris-Glycine SDS loopbuffer met dit soort gels. De combinatie van Tris-glycine SDS Running Buffer en Bis-Tris gels resulteert in de langzame migratie van glycine ionen waardoor een dramatische verhoging van de elektroforese looptijd met banden verschijnen meer gecomprimeerd en komvormig 4.
De blokkeringsstap is ook cruciaal voor het produceren Western blot beelden van hoge kwaliteit met fluorescentiedetectie als vele verschillende blokkerende middelen kunnen hoge membraan achtergrond genereren. Voor infrarood fluorescerende detectie, is het het beste om te gebruiken de Odyssey Blokkeringsbuffer omdat dit specifieke blokkerende middel verhoogt de gevoeligheid van eiwitdetectie behoud van een lage achtergrond. Hoewel magere melkpoeder, caseïne of BSA ook kan worden gebruikt als alternatieve blokkerende middelen kunnen dit soort oplossingen hogere membraan achtergrond veroorzaken en in sommige gevallen een afname van de binding affiniteit van het primaire antilichaam 10. Daarnaast kan op basis van melk blokkers IgG bevatten die kruisreageren met fosfo-epitopen en anti-geit-antilichamen, die kunnen interfereren met de nauwkeurigheid van eiwitdetectie en goede antilichaambinding 9,11. Indien een Western blot beeld wordt geplaagd door hoge achtergrond, niet-specifieke banden of zwak / geen signaal, dan gebruik een van deze alternatieve blokkerende middelen kan helpen om de beeldkwaliteit te verbeteren. Bovendien is het ook aanbevolen om te voorkomen afwasmiddel in de blokkerende stap lange incubaties blokkeren omdat dit kan leiden tot een verhoging van achtergrond en / of verlies van het doeleiwit uit het membraan 9,12.
Tegelijkertijd detecteren van twee verschillende antigenen op dezelfde blot met infrarood antilichamen gemerkt met een 700 nm en 800 nm kanalen kleurstof behoedzaam selectie van zowel de primaire als secundaire antilichamen. De twee primaire antilichamen worden afgeleid van verschillende host species. Bijvoorbeeld, als een primair antilichaam verkregen uit konijn, dan moet de tweede primaire antilichaam worden afgeleid van een ander dan konijn verschillende soorten, zoals muis. Evenzo moet de infrarood secundaire antilichamen ook worden afgeleid van dezelfde gastheersoort als elk van de primaire antilichamen en gelabeld met verschillende fluoroforen. Bijvoorbeeld kan een geit anti-konijn in de 800 nm kanaal worden gecombineerd met een geit anti-muis de 700nm kanaal om het eiwit signaal nauwkeurig waarnemen van twee verschillende primaire antilichamen die zijn afgeleid van konijn en muis.
Primaire antilichamen verschillen aanzienlijk in hun kwaliteit, affiniteit, en gevoeligheid voor hun antigeen. Dit kan resulteren in een significante vermindering van signaal of een verhoging van de specifieke binding van eiwitten aan het membraan waardoor er moeilijk is om visualiseren doeleiwit. Aldus met een alternatieve blokkerende oplossing, zoals magere melkpoeder ofcaseïne in PBS opgelost, kan helpen om het eiwit detectie met slechte kwaliteit primaire antilichamen 10 te verbeteren. Bovendien kan de detergensconcentratie van invloed op de binding van het primaire antilichaam aan het doelantigeen en voorzorgen te worden genomen bij het bepalen van de concentratie van detergens om wassen vermijden weg het antilichaam. Een lage concentratie SDS (0,01-0,02%) kan verminderen achtergrond en niet-specifieke binding wanneer toegevoegd aan het verdunde secundaire antilichaam, zeker bij PVDF-membraan 10. Echter, SDS ook verstoren antigeen-antilichaam binding leidt tot een ernstige vermindering van de signaalsterkte.
Bovendien is de nieuwe wijzigingen in dit protocol beschreven voorbeeld van een moderne benadering van de traditionele Western blotting techniek. Deze cutting-edge ontwikkelingen drastisch verbeteren van de effectiviteit, consistentie, en de gevoeligheid van de westerse gegevens en zorgt voor de accurate kwantificering van meerdere doeleiwittenop dezelfde membraan ongeacht hun signaalsterkte. Wat nog belangrijker is, deze waardevolle wijzigingen ook een aanzienlijke vermindering van de experimentele tijd van het uitvoeren van een Western blot, terwijl het produceren van hoge kwalitatieve en kwantitatieve gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen graag alle leden van de McMahon laboratorium bedanken voor hun hulp en steun. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM) en Institutioneel Onderzoek en Academische Career Development Award (IRACDA naar JS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 | |
| 4x NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | |
| 10x NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 | |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 | |
| 20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX | |
| SeeBlue Plus2 Prestained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 | |
| iBlot Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 | |
| β-Actin | Sigma | A2228 | |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A | |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 | |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 | |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 | |
| Odyssey Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Odyssey Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- iBlot Dry Blotting System. Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).
- Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).
- Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L. Human Milk Composition. Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
