Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

Summary

Questo protocollo esplora le ultime innovazioni in esecuzione di analisi di Western Blot. Queste nuove modifiche impiegano un sistema gel Bis-Tris con elettroforesi eseguire tempo 35 min, un sistema di trasferimento blotting secco 7 min, e infrarossi rilevamento proteina fluorescente e di imaging che genera maggiore risoluzione, qualità, sensibilità e maggiore precisione dei dati occidentali.

Abstract

Le tecniche di Western Blot che sono stati originariamente stabiliti alla fine del 1970 sono ancora attivamente utilizzati oggi. Tuttavia, questo metodo tradizionale di Western blotting ha diversi inconvenienti che includono risoluzione bassa qualità, bande spurie, diminuita sensibilità e integrità proteina poveri. I recenti progressi hanno drasticamente migliorato numerosi aspetti del protocollo Western Blot standard per la produzione di dati qualitativi e quantitativi più elevati. Il sistema gel Bis-Tris, in alternativa al sistema Laemmli convenzionale, genera una migliore separazione delle proteine ​​e risoluzione, mantiene l'integrità proteine, e riduce elettroforesi per un tempo di 35 min di esecuzione. Inoltre, il sistema blotting secco iBlot, migliora notevolmente l'efficacia e la velocità di trasferimento proteina alla membrana in 7 min, che è in contrasto con i tradizionali metodi di trasferimento proteine ​​che sono spesso più inefficiente con lunghi tempi di trasferimento. In combinazione con queste modifiche altamente innovative, proteine ​​detection utilizzando risultati di imaging fluorescente infrarosso in qualità superiore, più accurato e dati coerenti rispetto alla tecnica Western blotting tenore di chemiluminescenza. Questa tecnologia può rilevare simultaneamente due antigeni differenti sullo stesso membrana utilizzando due colori coloranti vicino infrarosso che vengono visualizzati in canali fluorescenti differenti. Inoltre, la linearità e la gamma dinamica di immagini fluorescenti consente per la quantificazione precisa di bande proteiche sia forti e deboli. Così, questo protocollo descrive i principali miglioramenti al classico metodo di Western blotting, in cui questi progressi aumentano notevolmente la qualità dei dati riducendo notevolmente il tempo di esecuzione di questo esperimento.

Introduction

La tecnica del Western blotting è stato sviluppato tra il 1977 e il 1979 al fine di creare un metodo migliore per rilevare proteine ​​utilizzando anticorpi ^1-3. Questa procedura utilizzata trasferimento elettroforetico delle proteine ​​di membrane da gel SDS-PAGE con proteine ​​bersaglio visualizzati usando anticorpi secondari e rilevati mediante autoradiografia, luce UV, o un prodotto di reazione perossidasi ^3. Così, questi stessi principi di base sono ancora ampiamente utilizzati in protocolli di Western blot di oggi. Tuttavia, questa tecnica classica Western blotting fa presenti molti svantaggi, quali tempi lenti corsa elettroforetica, bassa risoluzione e bande proteiche artificiali, suscettibilità alla degradazione delle proteine, e limitata sensibilità nonché scarsa qualità dei dati ^4. Pertanto, questo protocollo descrive progressi e miglioramenti significativi alla procedura di Western Blot standard che genera dati qualitativi e quantitativi più precisi.

"> Il sistema di Laemmli per separare una vasta gamma di proteine ​​mediante SDS-PAGE è il sistema gel più utilizzato per Western blotting ^5. Nonostante la popolarità di questo sistema di Western blotting, questo metodo può portare a una distorsione band, perdita di risoluzione, e bande spurie ^4. Questa può essere una conseguenza della deaminazione e alchilazione di proteine ​​a causa del pH elevato (9.5) del gel di separazione, riossidazione di legami disolfuro ridotto grazie alla variabile di stato redox del gel e scissione di aspartil-prolil prestiti stessi al riscaldamento della proteina in tampone Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptidici. Il sistema gel Bis-Tris, che opera ad un pH neutro (7.0), fornisce vantaggi significativi rispetto al sistema Lamemmli. Questo sistema migliora la stabilità della proteina, minimizza modificazioni delle proteine, mantiene le proteine ​​nei loro stati ridotti, impedisce aspartyl-prolyl scissione durante l'elettroforesi, e, soprattutto, il tempo di elettroforesi familiare è 35 min ^4,6,7. Inoltre, tSistema di gel lui Bis-Tris produce anche fasce più nitide, maggiore risoluzione e separazione, e una maggiore sensibilità conseguente dati più affidabili ^4.

In combinazione con il sistema gel Bis-Tris, il sistema blotting secco iBlot utilizza alta intensità di campo e le correnti di ridurre significativamente il tempo di trasferimento delle proteine ​​dal gel su membrane in 7 min ^8. Questo sistema di trasferimento si basa sul metodo blotting secco che genera un trasferimento più efficiente e affidabile di proteine ^​​8. Per un confronto dettagliato dell'efficacia del sistema di trasferimento iBlot ai sistemi di trasferimento convenzionali consultare il seguente sito web: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Si utilizza uno stack anodo e catodo, che sono costituiti da una matrice di gel contenente i buffer di trasferimento appropriate, che fungono da serbatoi di litio ^8. Durante il trasferimento, elettrolisi dell'acqua aiuta a prevenire la generazione di ossigeno dall'anodo rame conseguente trasferimento proteina più coerente senza causare distorsioni banda ^8. Inoltre, questo sistema di trasferimento aumenta anche la velocità di trasferimento riducendo la distanza tra gli elettrodi ^8.

Anche se chemiluminescenza è la tecnica più comune e tradizionale per la rilevazione della proteina di Western Blot analisi, rilevazione fluorescente a raggi infrarossi a due colori migliora notevolmente la sensibilità, la qualità e l'accuratezza dei dati Western Blot. Questo metodo di rilevamento utilizza infrarossi eccitazione laser in due lunghezze d'onda ottimali, 700 nme 800 nm, per generare un'immagine chiara dati con il massimo rapporto segnale-rumore e massima sensibilità ^9. Così, due proteine ​​bersaglio possono essere visualizzate contemporaneamente sulla stessa membrana utilizzando il 700 nm e 800 nm canali di rilevamento fluorescenti. Ancora più importante, la linearità e la gamma dinamica di fluorescenza a raggi infrarossi permette di precisa analisi quantitativa sia forti e deboli bande proteiche ^9. Inoltre, questo protocollo fornisce enormi vantaggi e miglioramenti rispetto alla classica tecnica Western blotting diminuendo l'elettroforesi e tempi di trasferimento di questo esperimento senza compromettere l'efficacia di questi processi e utilizzando rilevazione proteina fluorescente infrarosso per produrre maggiori dati di Western blot qualitativi e quantitativi.

Protocol

1. Preparazione dei lisati cellulari intero di coltura cellulare

1. Posizionare cellule di coltura piatti su ghiaccio e aggiungere PBS freddo con 5 mM EDTA (es. 5 ml di PBS con 5 EDTA/10 mm cm ² piastra). Rimuovere le cellule aderenti dal piatto usando un raschietto cellulare e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml freddo.
2. Agglomerare le sospensioni di cellule per centrifugazione a bassa velocità a 1000 rpm (230 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Mettere tubi conici su ghiaccio e aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
3. Lavare il pellet con 1 ml di PBS con 5 mM EDTA e trasferire sospensione cellulare ad un raffreddore 1,5 ml provetta da centrifuga. Sospensione giro veloce a 13.000 rpm (13.226 xg) per 10 secondi a pellet cellule. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare i tubi pellet e posto sul ghiaccio.
4. Risospendere il pellet in 25-200 ml (a seconda delle dimensioni del pellet, cioè per 3 x 10 ⁶ cellule aggiungere ~ 150 ml di tampone RIPA) inTampone RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% sodio desossicolato, 1% NP-40) contenente proteasi appena aggiunto e inibitori di fosfatasi ad una concentrazione finale 2x. Brevemente vortice ogni provetta e incubare sospensione per 20-30 minuti in ghiaccio. Nota: ci sono diversi buffer di lisi che possono essere utilizzati per estrarre proteine, che differiscono nella loro capacità di solubilizzare le proteine ​​e la forza della loro detersivo denaturazione (cioè SDS, Triton X-100, o NP-40). RIPA buffer è utile per la preparazione di lisati cellulari totali e interrompere le interazioni proteina-proteina.
5. Per creare una frazione post-nucleare, lisati centrifuga a 14.000 rpm (15.339 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta senza interrompere il pellet e posizionare i tubi nucleare arricchito su ghiaccio. Nota: il pellet nucleare arricchito può anche staccare dal tubo durante l'estrazione del surnatante. Per evitare di raccogliere il pellet nucleare arricchito, posizionare la punta della pipetta direttamente into il pellet nucleare arricchito viscoso e tirarla su con la pipetta, al fine di disporne.
6. Determinare le concentrazioni di proteine ​​di ciascun campione secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando tali dosaggi della proteina di quantificazione come BCA o Bradford.

2. Preparazione del campione e elettroforesi

1. Preparare ogni campione in base alla seguente tabella descritto di seguito. In alternativa, β-mercaptoetanolo può anche essere utilizzato ad una concentrazione finale di 2,5%. Tuttavia, l'agente riducente deve essere aggiunto a ciascun campione fino a un'ora prima di caricare il gel. I conti del volume totale delle variazioni di pipettaggio con soli 20 ml di ogni campione preparato caricati per bene.

   REATTIVO	CAMPIONE RIDOTTO
   Protein Sample	X microlitri
   4x LDS Sample Buffer	6 pl
   500 nM DTT Reducing agente	2.4 microlitri
   L'acqua deionizzata	Fino a 15.6 ml
   Volume totale	24 microlitri

2. Campioni di calore a 70 ° C per 10 min. Mentre i campioni sono il riscaldamento, preparare 1.000 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa (50 ml 20x MES o MOPS tampone di corsa più 950 ml di acqua deionizzata). MOPS tampone di corsa risolve proteine ​​di medie dimensioni tra 14-200 kDa, mentre MES tampone di corsa si risolve più piccole proteine ​​di peso molecolare tra 2-200 kDa con un pKa inferiore, che permette il MES tampone di corsa per correre più veloce rispetto alle MOPS ^4. Pertanto, questi due buffer hanno effetti sulla migrazione di ioni all'interno del gel di impilamento che porta a differenze nella separazione delle bande proteiche ⁴ contrastanti. Mettere da parte e unire 200 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa con 500 ml di antiossidanti, che saranno utilizzati per riempire il buffer Sezione del Min SuperioreUnità di elettroforesi i-Cell.
3. Una volta che i campioni sono finiti riscaldamento, campioni giro veloce prima di immetterli sul ghiaccio.
4. Per il montaggio dei prefabbricati gel Bis-Tris nell'unità di Mini-Cell per elettroforesi seguire le istruzioni del produttore. Nota: assicurarsi che ogni gel è orientata in modo tale che il più breve (minore) cassette di ogni gel rivolto verso l'interno verso il Buffer Core e gel sono di livello e ben premuto contro il buffer core per evitare perdite dal Buffer Camera Alta.
5. Riempire il Buffer Camera Alta con 200 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa contenente la antiossidante e Buffer Camera dell'unità Mini-Cell con circa 600 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa inferiore. I supplementari 200-300 ml di tampone di corsa possono essere salvate per un uso successivo. Tuttavia, non è consigliabile per riciclare il buffer utilizzato durante la corsa elettroforetica come il pH e la qualità del buffer possono essere modificati.
6. Caricare 20 ml di ogni samp proteinele in ogni pozzetto. Se sezionare la membrana in varie strisce, al fine di verificare la presenza di anticorpi multipli (cioè più di 2), si consiglia vivamente di caricare 2-5 microlitri della norma proteina prestained nel primo e ultimo pozzetti di ogni gel come questo servirà come guide di taglio per separare le varie sezioni della membrana senza influenzare la rappresentazione delle bande proteiche.
7. Gel funzionare a 200 V costante per 35 min con una corrente previsto di 110-125 mA / gel all'inizio e 70-80 mA per gel alla fine. L'elettroforesi è completa quando il colorante inseguimento migra verso il filo di platino lungo il buffer core.

3. Proteina di trasferimento Uso del Blotting sistema iBlot Dry

1. Completamente separare i mini-gel rompendo le parti incollate della cassetta (puo 'produrre un rumore crepitante). Eliminare il corto (piccolo) piastra e trasferire accuratamente il gel dalla più lunga (intaglio), piastra in un contenitore con acqua deionizzata erimuovere la parte spessa zampe del gel trova nella parte inferiore. Nota: in rari casi, il gel può allegare alla piastra inferiore invece della più lunga, intaglio piatto. In questo caso, scartare il più lungo, piastra scanalata e rimuovere la parte spessa zampe del gel trova nella parte inferiore. Poi, trasferire accuratamente il gel dalla piastra inferiore di acqua deionizzata.
2. Montare l'anodo e catodo trasferimento pile secondo le istruzioni del produttore. Nota: entrambi nitrocellulosa o PVDF membrane di fornire alta qualità ed efficiente trasferimento delle proteine ​​e sono compatibili con la rilevazione fluorescente ^8. Tuttavia, membrana PVDF ha una elevata capacità di legame (240 g / cm ³⁾ di nitrocellulosa (200 g / cm ^{3) 8.}
3. Rimuovere accuratamente eventuali bolle o aria intrappolata tra il gel e la membrana in modo da evitare qualsiasi distorsione delle bande proteiche durante il trasferimento. Nota: non tagliare la membrana o il trasfer impilare per misura il vostro formato gel come questo farà sì che il contatto diretto tra anodo e catodo stack.
4. Dopo aver montato correttamente le pile di trasferimento sul dispositivo assorbente asciutto, selezionare il programma tensione appropriata (ad esempio Programma 3: 20 V per 7 min) e iniziare il trasferimento. Nota: proteine ​​superiore a 150 kDa tendono migrare più lentamente e possono richiedere un tempo più lungo di trasferimento 8-10 min. Inoltre, prima incubazione del gel in etanolo al 20% per 5-10 min contribuirà anche a migliorare l'efficienza di trasferimento di queste grandi proteine. Una volta che il programma di trasferimento è completo, il dispositivo si spegne automaticamente la corrente. È meglio rimuovere immediatamente la membrana e procedere con la procedura di blocco per garantire una migliore rilevazione delle proteine ​​ed evitare di seccare la membrana.

4. La rilevazione infrarossa proteina fluorescente

1. Membrana Block (s) in un minimo di 0,8 ml / cm ² di Odyssey Blocking Buffer (non aggiungere Tween-20) per 1 ora onotte a 4 ° C. Membrana (s) può anche essere bloccato con latte in polvere senza grassi, ma puo causare alto sfondo ed interferire con il rilevamento di proteine.
2. Incubare membrana (s) in anticorpo primario alla concentrazione desiderata in Odyssey tampone di bloccaggio con 0.1% Tween-20 notte a 4 ° C. Per il rilevamento di due colori, in cui due antigeni differenti vengono visualizzati sullo stesso blot, i due anticorpi primari devono essere derivati ​​da diverse specie ospiti e aggiunte contemporaneamente alla membrana (s). Nota: prima dell'incubazione la membrana (s) in anticorpo primario, la membrana (s) può essere sezionato in vari pezzi, al fine di rilevare anticorpi multipli (cioè più di 2) sulla stessa membrana.
3. Lavare membrana (s) 3x per 10 min in TBS più 0,1% Tween-20 con un leggero scuotimento.
4. Incubare membrana (s) con gli anticorpi secondari fluorescenza marcata ad una diluizione di 1:20.000 per il canale 700 nm e 1:6,000-1:10,000 per il canale 800 nm in Odyssey tampone di bloccaggio con 0.1% Tween-20 per 30-60 min (incubando membrana (s) per più di 1 ora può aumentare background). Proteggere membrana (s) dalla luce. Nota: gli anticorpi secondari devono essere ottenuto dalla stessa specie ospiti ciascuno degli anticorpi primari e marcato con differenti fluorofori.
5. Lavare membrana (s) 3x per 10 min in TBS più 0,1% Tween-20 con un leggero scuotimento. Proteggere membrana (s) dalla luce.
6. Membrane (s) può essere essiccato o conservato sia in TBS o PBS senza Tween-20 a 4 ° C fino digitalizzato e ripreso con un sistema di imaging a raggi infrarossi. Segnale fluorescente rimane stabile per diversi mesi se adeguatamente protetto dalla luce.

Representative Results

Due colori di fluorescenza a raggi infrarossi rileva bande sia forti e deboli sulla stessa membrana con una maggiore sensibilità e il più alto rapporto segnale-rumore per produrre immagini chiare di Western blot. I risultati tipici generati da due colori rilevamento Western blot visualizzato sia nel 700 nm e 800 nm canali fluorescenti sono esemplificati nelle figure 1 e 2. Il Western blot superiore nella Figura 1 mostra la concomitante (overlay) rivelazione di totale ERK1 / 2 nel canale 800 nm (verde) e β-actina nel canale 700 nm (rosso) di diluizioni seriali duplici di lisati dalla umana derivata da linea di cellule di melanoma, WM793. Inoltre, questa membrana è anche stato tagliato in sezioni in base ai pesi molecolari delle proteine ​​bersaglio desiderati per consentire per più di due anticorpi da esaminare sullo stesso blot. Per esempio, la membrana analizzato in figura 1 è stato tagliato a metà per sondare la porta inferioreione della membrana con un terzo anticorpo, BIM totale (700 nm canale-rosso) senza dedurne con il rilevamento di totale ERK1 / 2 e β-actina. Il primo pannello della figura 2 dimostra ulteriormente la rilevazione fluorescente Western Blot due colori di fosfo-ERK1 / 2 (800 nm canale verde) e totale ERK1 / 2 (700 nm canale rosso) con segnali di ERK fosfo-ERK e totale sovrapposizione visualizzato in giallo di WM793 cellule di melanoma trattate in presenza e in assenza di inibitore MEK1 / 2, PD0325901 (Meki), che sopprime la via di segnalazione ERK1 / 2 MAP chinasi. Inoltre, la 700 nm e 800 nm immagini fluorescenti possono anche essere convertiti alle immagini di Western blot standard di bianco e nero per ciascun anticorpo (Figure 1 e 2). In generale, la maggior parte delle immagini di Western blot prodotte da questo protocollo si tradurrà in immagini di alta qualità come mostrato nelle figure 1 e 2. Tuttavia, a seconda della selettività, specificità,e qualità dell'anticorpo primario, a meno di immagini ottimali può provocare una piccola porzione di macchie analizzati da questa metodologia. Ad esempio, come osservato in fondo due pannelli di Figura 2, la qualità scadente dell'anticorpo fosfo-BIM nelle cellule WM793 melanoma trattati con e senza inibizione MEK comportato una immagine Western blot con bande proteiche deboli ed elevatissime sfondo membrana.

Simultanea di imaging fluorescente infrarosso di due obiettivi può anche fornire l'opportunità per l'analisi quantitativa di Western blot su un ampio intervallo dinamico lineare, da efficiente e preciso rilevamento bande sia forti e deboli sulla stessa membrana. Quantificazione di bande proteiche sono calcolate come intensità integrata, che è proporzionale alla quantità di anticorpi fluorescenti marcati sulla membrana ed è indipendente sia le dimensioni della forma disegnata intorno alla fascia e risoluzione. Questo si basa sui seguenti criteri: 1) sonouna della forma; 2) numero di pixel racchiusi nella forma; 3) intensità media dei pixel selezionati come sfondo e;. 4) intensità totale dei pixel racchiusi nella forma data ¹⁰ Figura 3A mostra la quantificazione della proteina Western blot illustrati nella Figura 1. Quantificazione del totale ERK1 / 2, β-actina, e totale BIM mostra una relazione lineare tra un aumento dell'intensità integrato del segnale fluorescente e l'aumento della concentrazione di proteina (Figura 3A). Inoltre, la figura 3B è un altro esempio di come quantificare i livelli di proteine ​​da Western blot fluorescenti, che mostra la quantificazione della proteina di fosfo-ERK1 / 2 normalizzata a livelli totali di ERK1 / 2 proteici di cellule di melanoma trattate con WM793 e senza inibizioni MEK dalla figura 2 . Da questa quantificazione, i fosforilate ERK1 / 2 livelli possono essere calcolati come percentuale dei livelli di controllo. In questo caSE, livelli fosfo-ERK di cellule di melanoma trattate con l'inibitore MEK erano 0,6% del controllo.

Figura 1. Analisi Western blot utilizzando due colori infrarossi rilevamento proteina fluorescente. Lisati di due diluizioni seriali di WM793 proteina melanoma di derivazione umana sono stati separati usando un gel NuPAGE Novex Bis-Tris con proteine ​​trasferite su membrana PVDF usando l'apparecchio di trasferimento iBlot . Le membrane sono state bloccate in Odyssey tampone di bloccaggio e sondato con i seguenti anticorpi primari: Coniglio ERK1 anti-totale / 2, coniglio anti-totale BIM, e mouse anti-β-actina. Complessi antigene-anticorpo sono stati rilevati utilizzando anti-coniglio IRDye 800 (verde) o 680 (rosso) e di capra anti-topo IRDye 680 (rosso) anticorpi secondari, rispettivamente capra fluorescente,e visualizzati con l'Odissea Classic Infrared Imaging System LI-COR. Il primo pannello Western blot è la sovrapposizione della rilevazione simultanea di segnali fluorescenti totale ERK1 / 2 (800 nm canale verde) e β-actina (700 nm canale-rosso). Il secondo pannello è la rivelazione fluorescente monocanale di BIM totale sulla stessa membrana che è stato separato con una lama di rasoio in base ai pesi molecolari di queste proteine ​​bersaglio. I tre pannelli Western Blot inferiori sono le immagini in bianco e nero delle immagini fluorescenti monocanale separati.

Figura 2. Un esempio di entrambi una qualità scadente-alta e immagine Western blot utilizzando fluorescenza a raggi infrarossi. WM793 cellule di melanoma trattati con DMSO (CTL) o 2 mM dell'inibitore MEK, PD0325 901 (Meki), per 18 ore sono stati analizzati come descritto nella Figura 1. La membrana è stata sondata con coniglio anti-fosfo-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), mouse anti-totale ERK1 / 2, mouse e anti-fosfo-BIM (Ser69) con complessi antigene-anticorpo rilevati con capra anti-coniglio IRDye 800 (verde) e di capra anti-topo IRDye 680 (rosso). Il primo pannello Western blot è la sovrapposizione della rilevazione simultanea di entrambi ERK1 / 2 (700 nm canale-rosso) segnali fluorescenti totale fosfo-ERK1 / 2 (800 nm canale verde) e. Il secondo e terzo pannelli sono le immagini in bianco e nero delle immagini fluorescenti singoli canali di fosfo e totale ERK1 / 2. Le ultime due pannelli sono le immagini fluorescenti e in bianco e nero di fosfo-BIM. Queste immagini rappresentano un esempio di un Western blot scadente che può portare con questo metodo a causa della qualità scadente dell'anticorpo primario.

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Figura 3. Esempi di proteine ​​quantificazione degli infrarossi Western blot fluorescenti. A) Quantificazione totale di ERK1 / 2, β-actina, e delle proteine ​​totali BIM stato determinato calcolando l'intensità integrata di ciascuna banda di proteina. L'intensità integrata è proporzionale alla quantità di anticorpi secondari fluorescenti marcati sulla membrana. Valori R-squared stati usati anche per valutare la regressione lineare per ciascun anticorpi analizzato in Figura 1. B) Quantificazione di fosfo-ERK1 / 2 normalizzato al totale ERK1 / 2 livelli proteici della Figura 2 è stato calcolato usando l'intensità integrata del segnale fluorescente e dati sono presentati come percentuale del DMSO-controllo.

Discussion

I passaggi critici nella generazione di alta qualità, macchie occidentali quantitativi in ​​base a questo protocollo sono i seguenti: 1) misurare le concentrazioni di proteine, 2) la preparazione del campione; 3) bloccando la membrana e, 4) qualità e calibro dell'anticorpo primario.

La precisione della misurazione delle concentrazioni di proteine ​​totali può avere un impatto importante sulla quantificazione bande proteiche in quanto la eccezionale sensibilità di rilevazione a fluorescenza a raggi infrarossi amplificare eventuali lievi differenze presenti nella concentrazione di proteine ​​dei campioni. Per evitare discrepanze nel determinare la concentrazione di proteina, generando una curva standard con una linea di regressione lineare o valore R al quadrato più vicino a 1 possibile (R ² ≥ 0,99 o superiore) è importante nel calcolo preciso della concentrazione proteica di ciascun campione . Per esempio, se il valore R ² scende sotto 0,99, preparazione riferimenti freschi BSA con acqua ultrapura e accuratamente ripetendo l'proteina test quantificazione può contribuire ad aumentare il valore di R ^2. E 'anche meglio evitare di utilizzare una pipetta multicanale come questo genererà incongruenze nel pipettaggio che possono contribuire alla riduzione R ² valori e imprecisioni nelle concentrazioni di proteine ​​dei campioni.

Preparazione del campione gioca un ruolo significativo nel determinare la qualità delle bande proteiche, che può anche avere un effetto diretto sulla quantificazione di queste bande. Quando si utilizza il sistema gel Bis-Tris, si raccomanda che i campioni sono preparati con LDS Sample Buffer perché il pH leggermente alcalino (8.5) di questo buffer fornisce le condizioni ottimali per la riduzione dei legami disolfuro e denaturazione ^4. Questo tampone campione contiene anche un colorante Coomassie inseguimento G250 che produce un fronte del colorante tagliente che migra con il fronte ione movimento, che aiuta a garantire che piccoli peptidi non corrono il gel ^4. Ancora più importante, il Campione LDSBuffer minimizza la scissione di legami peptidici aspartil-prolina quando i campioni vengono riscaldati a 70 ° C a causa del pH del tampone cambiare 8,5-8,0 ^4. Ciò si traduce in un ambiente ideale per la riduzione ed alchilazione di proteine ​​pur preservando l'integrità della proteina. Tuttavia, se una soluzione tampone Tris-glicina SDS viene usata al posto della LDS Sample Buffer, questo porterà alla scissione dei legami aspartil-prolina, una diminuzione della nitidezza delle bande proteiche, e un aumento frammentazione proteina ^4. E 'anche pertinente per aggiungere l'antiossidante alla Buffer Camera dell'unità di elettroforesi Mini-Cell Superiore. Poiché l'antiossidante è in grado di comigrate con i campioni a pH neutro nel sistema gel Bis-Tris, questo può aiutare a mantenere proteine ​​in uno stato ridotto e proteggere legami disolfuro e amminoacidi sensibili contro l'ossidazione, mentre l'assenza del Antiossidante può portare a bande proteiche diffuse ^4. Infine, è altamenteraccomanda di usare uno MES o MOPS tampone di corsa con i gel Bis-Tris anziché utilizzare Tris-Glycine SDS tampone di corsa con questi tipi di gel. La combinazione di Tris-Glycine SDS tampone di corsa e Bis-Tris gel risultati nella lenta migrazione di ioni glicina provocando un drammatico aumento del tempo elettroforesi correre con bande appaiono più compresso e ⁴ a tazza.

Il passo di blocco è fondamentale anche per la produzione di immagini di alta qualità Western Blot utilizzando il rilevamento fluorescente come molti dei vari agenti di blocco in grado di generare un elevato background membrana. Per il rilevamento a fluorescenza a raggi infrarossi, è meglio usare l'Odissea Blocking Buffer perché questo agente bloccante specifico aumenta la sensibilità di rilevazione della proteina, pur mantenendo basso fondo. Anche se il latte scremato secco, caseina, o BSA potrebbero anche essere utilizzati come agenti bloccanti alternativi, questi tipi di soluzioni possono causare alto sfondo membrana e in alcuni casi una diminuzione della binding affinità dell'anticorpo primario ^10. Inoltre, il sistema di blocco a base di latte possono contenere IgG che può cross-reagire con fosfo-epitopi e anticorpi anti-capra, che potrebbero interferire con la precisione di rilevamento proteine ​​e anticorpi corretta vincolante ^9,11. Tuttavia, se un'immagine Western blot è afflitto da fondo elevato, bande aspecifiche, o debole / nessun segnale, poi utilizzando uno di questi agenti bloccanti alternativi può contribuire a migliorare la qualità dell'immagine. Inoltre, si raccomanda inoltre di evitare di aggiungere il detersivo alla fase di blocco e incubazione di blocco lungo in quanto ciò potrebbe portare ad un aumento in background e / o perdita della proteina bersaglio dalla membrana ^9,12.

Rilevare simultaneamente due antigeni differenti sullo stesso blot utilizzando anticorpi marcati con infrarossi da 700 nm e 800 nm canale colorante richiede la selezione prudente di entrambi gli anticorpi primari e secondari. I due anticorpi primari devono essere ottenuti da diverse host specie. Per esempio, se un anticorpo primario è derivato da coniglio, poi il secondo anticorpo primario deve essere derivato da una specie diversa diversi dal coniglio, come mouse. Allo stesso modo, gli anticorpi secondari infrarossi devono anche essere ottenuto dalla stessa specie ospite come ciascuno degli anticorpi primari ed etichettato con differenti fluorofori. Ad esempio, una capra anti-coniglio nel canale 800 nm può essere combinato con una capra anti-topo nel canale 700nm per osservare con precisione il segnale proteina da due differenti anticorpi primari che sono derivati ​​da coniglio e mouse.

Anticorpi primari variano notevolmente nella loro qualità, l'affinità e la sensibilità per il loro antigene. Questo può portare ad una riduzione significativa del segnale o un aumento del legame non specifico di proteine ​​di membrana creando così difficoltà nella visualizzazione accuratamente la proteina bersaglio. Così, utilizzando una soluzione di saturazione alternativa, come latte in polvere senza grassi ocaseina disciolto in PBS, può contribuire a migliorare l'individuazione di proteine ​​con anticorpi primari di scarsa qualità ^10. Inoltre, la concentrazione di detersivo può anche influenzare il legame dell'anticorpo primario per l'antigene bersaglio e precauzione dovrebbe essere considerato nel determinare la concentrazione di detersivo per evitare lavare via l'anticorpo. Una bassa concentrazione di SDS (0,01-0,02%) può ridurre sfondo e il legame non specifico quando aggiunto l'anticorpo secondario diluito, soprattutto quando si utilizzano membrane PVDF ^10. Tuttavia, SDS può anche interrompere antigene-anticorpo legame, causando una grave riduzione della potenza del segnale.

Inoltre, le nuove modifiche descritte in questo protocollo esemplifica un approccio moderno al tradizionale tecnica di Western blotting. Questi progressi all'avanguardia migliorano drasticamente l'efficacia, la coerenza e la sensibilità dei dati occidentali e consente per la quantificazione precisa di molteplici proteine ​​bersagliosulla stessa membrana indipendentemente dalla potenza del segnale. Ancora più importante, questi preziosi alterazioni anche ridurre significativamente il tempo sperimentale di eseguire un Western blot producendo elevati dati qualitativi e quantitativi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A