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टाउन में पश्चिमी सबसे तेज: क्लासिक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण पर एक समकालीन मोड़

Published: February 5, 2014 doi: 10.3791/51149
Automatic Translation
1, 1
1Diller Cancer Research Building, University of California, San Francisco

Summary

इस प्रोटोकॉल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन में नवीनतम प्रगति की पड़ताल. ये उपन्यास संशोधनों एक 35 मिनट वैद्युतकणसंचलन चलाते समय, एक 7 मिनट ड्राई सोख्ता हस्तांतरण प्रणाली, और उच्च संकल्प, गुणवत्ता, संवेदनशीलता, और पश्चिमी डेटा के बेहतर सटीकता उत्पन्न करता है कि अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने और इमेजिंग के साथ एक बीआईएस-tris जेल प्रणाली को रोजगार.

Abstract

मूल रूप से 1970 के दशक में स्थापित किया गया है कि पश्चिमी धब्बा तकनीक अभी भी सक्रिय रूप से आज का उपयोग किया जाता है. हालांकि, पश्चिमी सोख्ता के इस पारंपरिक विधि कम गुणवत्ता संकल्प, नकली बैंड, संवेदनशीलता की कमी हुई है, और गरीब प्रोटीन अखंडता शामिल है कि कई कमियां हैं. हाल के अग्रिमों काफी उच्च गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा का उत्पादन करने के लिए मानक पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल के कई पहलुओं में सुधार हुआ है. बीआईएस-tris जेल प्रणाली, पारंपरिक Laemmli प्रणाली के लिए एक विकल्प, बेहतर प्रोटीन जुदाई और संकल्प उत्पन्न प्रोटीन अखंडता बनाए रखता है, और एक 35 मिनट चलाने के समय को वैद्युतकणसंचलन कम कर देता है. इसके अलावा, iBlot ड्राई सोख्ता प्रणाली में नाटकीय रूप से अक्सर लंबा हस्तांतरण के समय के साथ अधिक अक्षम हैं कि परंपरागत प्रोटीन हस्तांतरण के तरीकों के विपरीत है जो 7 मिनट में झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण की प्रभावकारिता और गति में सुधार. इन उच्च अभिनव संशोधनों, प्रोटीन डी के साथ संयोजन मेंetection, उच्च गुणवत्ता वाले अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग परिणामों का उपयोग अधिक सटीक और chemiluminescence के मानक पश्चिमी सोख्ता तकनीक की तुलना में लगातार डेटा. यह तकनीक एक साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों में दिखाए जा रहे हैं कि दो रंग लगभग अवरक्त रंगों के उपयोग के द्वारा एक ही झिल्ली पर दो अलग एंटीजन पता लगा सकते हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट इमेजिंग के linearity और व्यापक गतिशील रेंज मजबूत और कमजोर दोनों प्रोटीन बैंड की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल बहुत इस प्रयोग का प्रदर्शन समय को कम करते हुए इन प्रगति काफी डेटा की गुणवत्ता को बढ़ाने में जो क्लासिक पश्चिमी सोख्ता विधि, के लिए महत्वपूर्ण सुधार का वर्णन करता है.

Introduction

पश्चिमी सोख्ता की तकनीक पहले एंटीबॉडी 1-3 का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक बेहतर तरीका बनाने के लिए 1977 और 1979 के बीच विकसित किया गया था. यह प्रक्रिया माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना और autoradiography, यूवी प्रकाश, या एक peroxidase प्रतिक्रिया उत्पाद 3 से पता लगाया लक्ष्य प्रोटीन के साथ एसडीएस पृष्ठ जैल से झिल्ली प्रोटीन के electrophoretic स्थानांतरण का उपयोग किया. इस प्रकार, एक ही इन बुनियादी सिद्धांतों अभी भी व्यापक रूप से आज के पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है. हालांकि, इस क्लासिक पश्चिमी सोख्ता तकनीक जैसे धीमी गति से वैद्युतकणसंचलन चलाते समय, कम संकल्प और कृत्रिम प्रोटीन का बैंड, प्रोटीन गिरावट के लिए संवेदनशीलता, और सीमित संवेदनशीलता के साथ ही गरीब डेटा गुणवत्ता 4 के रूप में उपस्थित कई नुकसान करता है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल और अधिक सटीक गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करता है कि मानक पश्चिमी धब्बा प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण प्रगति और सुधार का वर्णन करता है.

"> एसडीएस पृष्ठ का उपयोग प्रोटीन की एक विस्तृत रेंज को अलग करने के लिए Laemmli प्रणाली इस पश्चिमी सोख्ता प्रणाली की लोकप्रियता के बावजूद. पश्चिमी सोख्ता 5 के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल जेल प्रणाली है, इस पद्धति बैंड विरूपण, संकल्प की कमी है, और कर सकते हैं परिणाम नकली बैंड 4. यह अलग करने जेल, कम डाइसल्फ़ाइड जेल के अलग redox राज्य की वजह से बांड, और aspartyl-prolyl की दरार की reoxidation की उच्च पीएच (9.5) की वजह से प्रोटीन की deamination और alkylation का परिणाम हो सकता है Laemmli बफर (5.2 पीएच) 4,6 में प्रोटीन हीटिंग की वजह से पेप्टाइड बांड., एक तटस्थ पीएच (7.0) पर चल रही है Lamemmli प्रणाली से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है जो बीआईएस-tris जेल प्रणाली,. इस प्रणाली प्रोटीन स्थिरता, minimizes को बेहतर बनाता है प्रोटीन संशोधनों, उनके कम राज्यों में प्रोटीन का कहना है वैद्युतकणसंचलन दौरान aspartyl-prolyl दरार से बचाता है, और अधिक महत्वपूर्ण बात, वैद्युतकणसंचलन चलाते समय टी, इसके अलावा. 35 मिनट 4,6,7 हैवह बीआईएस-tris जेल प्रणाली भी अधिक विश्वसनीय डेटा 4 में जिसके परिणामस्वरूप तेज बैंड, उच्च संकल्प और जुदाई, और वृद्धि की संवेदनशीलता पैदा करता है.

बीआईएस-tris जेल प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में, iBlot ड्राई सोख्ता प्रणाली काफी 7 मिनट 8 भीतर झिल्ली पर जैल से प्रोटीन के हस्तांतरण के समय को कम करने के लिए उच्च शक्ति क्षेत्र और धाराओं का उपयोग करता है. इस हस्तांतरण प्रणाली प्रोटीन 8 के एक अधिक कुशल और विश्वसनीय हस्तांतरण उत्पन्न करता है कि शुष्क सोख्ता पद्धति पर आधारित है. : पारंपरिक हस्तांतरण प्रणाली के लिए iBlot हस्तांतरण प्रणाली की प्रभावोत्पादकता की एक विस्तृत तुलना के लिए निम्नलिखित वेबसाइट को देखें http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . यह आयन जलाशयों 8 के रूप में कार्य है कि उपयुक्त स्थानांतरण बफ़र्स, जिसमें वह एक जेल मैट्रिक्स के शामिल हैं जो एक anode और कैथोड पर ढेर, का इस्तेमाल करता. स्थानांतरण के दौरान, पानी इलेक्ट्रोलिसिस बैंड विरूपण 8 कारण के बिना एक और अधिक सुसंगत प्रोटीन हस्तांतरण में जिसके परिणामस्वरूप तांबा एनोड से ऑक्सीजन की पीढ़ी को रोकने में मदद करता है. इसके अलावा, इस हस्तांतरण प्रणाली भी इलेक्ट्रोड 8 के बीच की दूरी को कम करने से स्थानांतरण गति बढ़ जाती है.

Chemiluminescence वेस्टर्न ब्लॉट के प्रोटीन का पता लगाने के विश्लेषण के लिए सबसे आम और पारंपरिक तकनीक है, दो रंग अवरक्त फ्लोरोसेंट का पता लगाने में काफी पश्चिमी धब्बा डेटा की संवेदनशीलता, गुणवत्ता, और सटीकता में सुधार. यह पता लगाने की विधि दो इष्टतम तरंग दैर्ध्य 700 एनएम में अवरक्त लेजर उत्तेजना का उपयोग करता हैऔर 800 एनएम, सबसे बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात और उच्चतम संवेदनशीलता 9 के साथ एक स्पष्ट डेटा छवि उत्पन्न करने के लिए. इस प्रकार, दो लक्ष्य प्रोटीन 700 एनएम और 800 एनएम फ्लोरोसेंट का पता लगाने चैनलों का उपयोग कर एक ही झिल्ली पर एक साथ देखे जा सकते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, अवरक्त प्रतिदीप्ति के linearity और गतिशील रेंज मजबूत और कमजोर दोनों प्रोटीन बैंड 9 की सटीक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल इन प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता समझौता किए और अधिक गुणात्मक और मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा डेटा का उत्पादन करने के लिए अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के उपयोग के बिना इस प्रयोग की वैद्युतकणसंचलन और हस्तांतरण के समय कम से क्लासिक पश्चिमी सोख्ता तकनीक पर जबरदस्त फायदे और सुधार प्रदान करता है.

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Protocol

1. सेल संस्कृति से पूरे सेल lysates की तैयारी

  1. बर्फ पर सेल संस्कृति बर्तन प्लेस और 5 मिमी EDTA (पीबीएस के उदाहरण के लिए 5 मिलीलीटर 5 मिमी EDTA/10 2 सेमी की थाली के साथ) के साथ ठंड पीबीएस जोड़ने. एक सेल खुरचनी का उपयोग पकवान से पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने और फिर एक ठंड 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 rpm (230 XG) में कम गति centrifugation द्वारा सेल निलंबन गोली बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूबों रखें और ध्यान से गोली में खलल न डालें बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate.
  3. 5 मिमी EDTA के साथ पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धोने और एक ठंडा 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण. गोली कोशिकाओं के लिए 10 सेकंड के लिए 13,000 आरपीएम (13,226 XG) में त्वरित स्पिन निलंबन. ध्यान से बर्फ पर गोली और जगह ट्यूब में खलल न डालें बिना सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  4. में, (यानी 3 x 10 6 कोशिकाओं के लिए RIPA बफर के ~ 150 μl जोड़ने गोली आकार पर निर्भर करता है) 25-200 μl में गोली ResuspendRIPA बफर (50 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, 0.5 मिमी EDTA, 10 मिमी NAF, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate, 1% एनपी 40) एक 2x अंतिम एकाग्रता में हौसले गयी प्रोटीज और फॉस्फेट inhibitors युक्त. संक्षेप में प्रत्येक ट्यूब भंवर और बर्फ पर 20-30 मिनट के लिए निलंबन सेते हैं. नोट: प्रोटीन और उनके denaturing डिटर्जेंट (यानी एसडीएस, ट्राइटन X-100, या एनपी 40) की ताकत solubilize करने की क्षमता में मतभेद है जो प्रोटीन निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कई सेल बफ़र्स, वहाँ रहे हैं. RIPA बफर पूरे सेल lysates की तैयारी और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में खलल न डालें के लिए उपयोगी है.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 14,000 आरपीएम (15,339 XG) में एक के बाद परमाणु अंश, अपकेंद्रित्र lysates बनाने के लिए बर्फ पर परमाणु समृद्ध गोली और जगह ट्यूब में बाधा पहुँचा के बिना एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. नोट: सतह पर तैरनेवाला निकालते समय परमाणु समृद्ध गोली भी ट्यूब से अलग हो सकता है. परमाणु समृद्ध गोली संग्रह से बचने के लिए, मैं सीधे पिपेट टिप जगहचिपचिपा परमाणु समृद्ध गोली Nto और यह निपटाने के क्रम में पिपेट साथ यह खींचना.
  6. बीसीए या ब्रैडफोर्ड जैसे प्रोटीन मात्रा का ठहराव assays का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक नमूने के प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं.

2. नमूना तैयार करने और वैद्युतकणसंचलन

  1. नीचे दिये निम्नलिखित चार्ट के अनुसार प्रत्येक नमूना तैयार करें. एक विकल्प के रूप में, β-mercaptoethanol भी 2.5% की एक अंतिम एकाग्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कम एजेंट जेल लोड करने से पहले एक घंटे के लिए प्रत्येक नमूने अप करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. प्रत्येक तैयार नमूना का केवल 20 μl के साथ pipetting विविधताओं के लिए कुल मात्रा खातों प्रति अच्छी तरह से भरा हुआ है.
    अभिकर्मक कम नमूना
    प्रोटीन के नमूने एक्स μl
    4x एलडीएस नमूना बफर 6 μl
    500 एनएम डीटीटी लालucing एजेंट 2.4 μl
    विआयनीकृत पानी अप करने के लिए 15.6 μl
    कुल मात्रा 24 μl
  2. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर हीट नमूनों. नमूने ताप रहे हैं, वहीं (50 मिलीलीटर 20x एमईएस या चल बफर MOPS प्लस 950 एमएल विआयनीकृत पानी) चल बफर 1x एमईएस या mops के 1000 मिलीलीटर तैयार करते हैं. चल बफर एमईएस एमईएस तेजी MOPS 4 से चलाने के लिए चल बफर अनुमति देता है एक कम pKa, साथ 2-200 केडीए के बीच छोटे आणविक वजन प्रोटीन का निराकरण जबकि बफर रनिंग mops, 14-200 केडीए के बीच मध्य आकार प्रोटीन का निराकरण. इस प्रकार, इन दो बफ़र्स प्रोटीन बैंड 4 की जुदाई में मतभेद की ओर जाता है कि स्टैकिंग जेल के भीतर आयनों के प्रवास पर प्रभाव विषम है. अलग निर्धारित करें और मिन के ऊपरी बफर चैंबर भरने के लिए उपयोग किया जाएगा जो 200 1x एमईएस की मिलीलीटर या एंटीऑक्सीडेंट के 500 μl के साथ चल बफर mops, गठबंधनमैं सेल वैद्युतकणसंचलन इकाई.
  3. नमूने बर्फ पर उन्हें रखने से पहले हीटिंग, त्वरित स्पिन नमूने समाप्त हो जाने के बाद.
  4. वैद्युतकणसंचलन के लिए मिनी सेल इकाई में मिल में बना हुआ बीआईएस-tris जैल की विधानसभा के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें. नोट: प्रत्येक जेल प्रत्येक जेल के छोटे (छोटे) कैसेट बफर कोर की ओर आवक चेहरे और जैल स्तर हैं और कसकर अपर बफर चैंबर से रिसाव से बचने के लिए बफर कोर के खिलाफ लगाए कि इस तरह के एक फैशन में उन्मुख है सुनिश्चित करें.
  5. 1x एमईएस या एंटीऑक्सीडेंट और 1x एमईएस या चल बफर mops के लगभग 600 मिलीलीटर के साथ मिनी सेल इकाई के निचले बफर चैंबर युक्त चल बफर mops के 200 मिलीलीटर के साथ अपर बफर चैम्बर भरें. बफर चलाने का अतिरिक्त 200-300 मिलीलीटर बाद में उपयोग के लिए बचाया जा सकता है. हालांकि, यह बफर का पीएच और गुणवत्ता बदला जा सकता है के रूप में वैद्युतकणसंचलन चलाने के दौरान प्रयोग किया जाता बफर पुनरावृत्ति करने की सिफारिश नहीं है.
  6. प्रत्येक प्रोटीन samp के 20 μl लोडLe प्रत्येक कुएं में. कई एंटीबॉडी (यानी अधिक से अधिक 2) के लिए जांच के क्रम में विभिन्न स्ट्रिप्स में झिल्ली सेक्शनिंग हैं, तो यह बहुत ही इस रूप में काम करेगा के रूप में प्रत्येक जेल की पहली और आखिरी कुओं में prestained प्रोटीन मानक के 2-5 μl लोड करने के लिए सिफारिश की है प्रोटीन बैंड की इमेजिंग को प्रभावित किए बिना झिल्ली के विभिन्न वर्गों को अलग करने के लिए गाइड काटने.
  7. अंत में शुरू और जेल प्रति 70-80 मा 110-125 मा / जेल की एक उम्मीद की वर्तमान के साथ 35 मिनट के लिए 200 वी निरंतर पर चलाने के लिए जैल. ट्रैकिंग डाई बफर कोर साथ प्लैटिनम तार करने के लिए migrates जब वैद्युतकणसंचलन पूरा हो गया है.

3. IBlot सूखी सोख्ता प्रणाली का प्रयोग प्रोटीन हस्तांतरण

  1. पूरी तरह से (यह एक तीखी आवाज शोर उत्पादन हो सकता है) कैसेट के बंधुआ पक्षों को तोड़कर मिनी जैल अलग. कम (छोटे) थाली त्यागें और ध्यान से विआयनीकृत पानी के साथ एक कंटेनर में लंबे समय तक (slotted) थाली से जेल स्थानांतरण औरतल पर स्थित जेल की मोटी टांगों हिस्से को हटा दें. नोट: दुर्लभ मामलों पर, जेल अब छोटी प्लेट के बजाय करने के लिए संलग्न कर सकते हैं, थाली रखा. इस मामले में, लंबे समय तक, slotted थाली त्यागें और तल पर स्थित जेल की मोटी टांगों हिस्से को हटा दें. फिर, ध्यान से विआयनीकृत पानी के लिए छोटी प्लेट से जेल स्थानांतरण.
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एनोड और कैथोड हस्तांतरण के ढेर इकट्ठा. नोट: nitrocellulose या PVDF दोनों झिल्ली प्रोटीन की उच्च गुणवत्ता और कुशल स्थानांतरण उपलब्ध कराने और फ्लोरोसेंट का पता लगाने 8 के साथ संगत कर रहे हैं. हालांकि, PVDF झिल्ली nitrocellulose तुलना में एक उच्च बाध्यकारी क्षमता (240 ग्राम / 3 सेमी) (200 ग्राम / 3 सेमी) 8 है.
  3. ध्यान से किसी भी बुलबुले या इस रूप में जेल और झिल्ली के बीच फँस हवा स्थानांतरण के दौरान प्रोटीन बैंड के किसी भी विरूपण को रोकने जाएगा हटा दें. नोट: झिल्ली या transf ट्रिम नहीं हैएर इस एनोड और कैथोड के ढेर के बीच सीधे संपर्क के कारण होगा के रूप में अपने जेल आकार फिट करने के लिए हो चुकी है.
  4. बाद ठीक से सूखा सोख्ता डिवाइस पर स्थानांतरण ढेर संयोजन, उचित वोल्टेज कार्यक्रम (यानी कार्यक्रम 3: 7 मिनट के लिए 20 वी) का चयन करें और हस्तांतरण आरंभ करें. नोट: 150 केडीए से अधिक प्रोटीन और धीरे धीरे विस्थापित करते हैं और 8-10 मिनट की लंबी हस्तांतरण के समय की आवश्यकता हो सकती. इसके अलावा, 5-10 मिनट के लिए 20% इथेनॉल में जेल की पूर्व ऊष्मायन भी इन बड़े प्रोटीन का स्थानांतरण क्षमता में सुधार करने में मदद करेगा. स्थानांतरण कार्यक्रम के पूरा होने पर, डिवाइस स्वचालित रूप से वर्तमान बंद हो जाएगा. यह तुरंत झिल्ली को हटा दें और बेहतर प्रोटीन का पता लगाने सुनिश्चित करने और झिल्ली बाहर सुखाने से बचने के लिए अवरुद्ध प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने के लिए सबसे अच्छा है.

4. इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने

  1. ओडिसी 1 घंटा या के लिए बफर (बीच 20 जोड़ें मत) को अवरुद्ध करने में 0.8 मिलीग्राम / 2 सेमी की एक न्यूनतम में ब्लॉक झिल्ली (ओं)रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस झिल्ली (एस) ने भी हालांकि इस उच्च पृष्ठभूमि के कारण और प्रोटीन का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, नोनफेट शुष्क दूध के साथ अवरुद्ध किया जा सकता है.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 0.1% बीच 20 से अवरुद्ध बफर ओडिसी में वांछित एकाग्रता में प्राथमिक एंटीबॉडी में झिल्ली (ओं) को सेते दो अलग एंटीजन एक ही दाग ​​पर दिखाए जा रहे हैं, जिसमें दो रंग का पता लगाने के लिए, दो प्राथमिक एंटीबॉडी अलग मेजबान प्रजातियों से प्राप्त किया जाना चाहिए और झिल्ली (ओं) को एक साथ जोड़ा. नोट: पूर्व प्राथमिक एंटीबॉडी में झिल्ली (ओं) incubating के लिए, झिल्ली (एस) एक ही झिल्ली पर कई एंटीबॉडी (यानी अधिक से अधिक 2) के लिए जांच के क्रम में विभिन्न टुकड़ों में sectioned किया जा सकता है.
  3. टीबीएस में 10 मिनट से अधिक 0.1% बीच 20 कोमल झटकों के साथ के लिए झिल्ली (ओं) 3x धो लें.
  4. Odysse में 800 एनएम चैनल के लिए 700 एनएम चैनल और 1:6,000-1:10,000 के लिए 1:20,000 के कमजोर पड़ने पर fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली (ओं) को सेतेवाई (अब से 1 घंटे के लिए झिल्ली (ओं) incubating पृष्ठभूमि वृद्धि हो सकती है) 30-60 मिनट के लिए 0.1% बीच 20 से अवरुद्ध बफर. प्रकाश से झिल्ली (ओं) को सुरक्षित रखें. नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी से प्रत्येक के रूप में एक ही मेजबान प्रजातियों से ली गई है और विभिन्न fluorophores के साथ लेबल किया जाना चाहिए.
  5. टीबीएस में 10 मिनट से अधिक 0.1% बीच 20 कोमल झटकों के साथ के लिए झिल्ली (ओं) 3x धो लें. प्रकाश से झिल्ली (ओं) को सुरक्षित रखें.
  6. स्कैन और एक इन्फ्रारेड इमेजिंग सिस्टम के साथ imaged जब तक झिल्ली (ओं) बीच 20 4 डिग्री सेल्सियस के बिना सूखे या टीबीएस या पीबीएस या तो में संग्रहित किया जा सकता है. ठीक से प्रकाश से सुरक्षित अगर फ्लोरोसेंट संकेत कई महीनों के लिए स्थिर रहेगा.

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Representative Results

दो रंग अवरक्त प्रतिदीप्ति बढ़ाया संवेदनशीलता और स्पष्ट पश्चिमी धब्बा छवियों का उत्पादन करने के लिए उच्चतम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ एक ही झिल्ली पर मजबूत और कमजोर दोनों बैंड का पता लगाता है. 700 एनएम और 800 एनएम फ्लोरोसेंट चैनल दोनों में कल्पना की दो रंग पश्चिमी धब्बा पता लगाने के द्वारा उत्पन्न विशिष्ट परिणाम आंकड़े 1 और 2 में उदाहरण हैं. चित्रा 1 में ऊपरवाला पश्चिमी धब्बा मानव से lysates के दो गुना धारावाहिक dilutions के 700 एनएम चैनल (लाल) में 800 एनएम चैनल (हरा) और β-actin में कुल ERK1 / 2 की समवर्ती (ओवरले) जांच से पता चलता है मेलेनोमा सेल लाइन, WM793 व्युत्पन्न. इसके अलावा, इस झिल्ली भी वही धब्बा पर जांच की जानी दो से अधिक एंटीबॉडी के लिए अनुमति देने के क्रम में वांछित प्रोटीन लक्ष्य की आणविक भार के आधार पर वर्गों में कटौती की गई है. उदाहरण के लिए, चित्रा 1 में विश्लेषण झिल्ली कम बंदरगाह की जांच के क्रम में आधे में कटौती की गई थीकुल ERK1 / 2 और β-actin दोनों का पता लगाने के साथ inferring के बिना एक तिहाई एंटीबॉडी, कुल बीआईएम (700 एनएम चैनल लाल) के साथ झिल्ली के आयन. चित्रा 2 के पहले पैनल आगे phospho-ERK1 / 2 के दो रंग वेस्टर्न ब्लॉट फ्लोरोसेंट का पता लगाने को दर्शाता है (800 एनएम चैनल हरी) और कुल ERK1 / 2 (700 एनएम चैनल लाल) phospho-ERK और कुल ERK संकेतों अतिव्यापी के साथ ERK1 / 2 नक्शा kinase संकेतन मार्ग को दबा जो MEK1 / 2 अवरोध करनेवाला, PD0325901 (MEKi), की उपस्थिति और अनुपस्थिति में इलाज WM793 मेलेनोमा कोशिकाओं के पीले रंग में प्रदर्शन किया. इसके अलावा, 700 एनएम और 800 एनएम फ्लोरोसेंट छवियों को भी प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए मानक काले और सफेद पश्चिमी धब्बा छवियों को परिवर्तित (आंकड़े 1 और 2) किया जा सकता है. आंकड़े 1 और 2 में प्रदर्शित के रूप में सामान्य में, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित पश्चिमी धब्बा छवियों के बहुमत के उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों में परिणाम होगा. हालांकि, चयनात्मकता के आधार पर, विशिष्टता,और इष्टतम छवियों से कम प्राथमिक एंटीबॉडी की गुणवत्ता, इस पद्धति से विश्लेषण blots के एक छोटे से हिस्से में परिणाम कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, चित्रा 2 के नीचे दो पैनलों में मनाया के रूप में, के साथ और खल्क अवरोध के बिना इलाज WM793 मेलेनोमा कोशिकाओं में phospho-बीआईएम एंटीबॉडी की subpar गुणवत्ता बेहोश प्रोटीन बैंड और अत्यंत उच्च झिल्ली पृष्ठभूमि के साथ एक पश्चिमी धब्बा छवि में हुई.

दो लक्ष्यों के एक साथ अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग भी कुशलता से और सही वही झिल्ली पर मजबूत और कमजोर दोनों बैंड पता लगाने के द्वारा एक व्यापक रेखीय गतिशील रेंज पर पश्चिमी blots की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अवसर प्रदान कर सकते हैं. प्रोटीन बैंड की मात्रा झिल्ली पर फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी की राशि के लिए आनुपातिक है और बैंड और संकल्प के चारों ओर खींचा आकार के दोनों आकार से स्वतंत्र है जो एक एकीकृत तीव्रता, के रूप में गणना कर रहे हैं. यह निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर किया जाता है: 1) हैंआकार के एक, आकार में संलग्न पिक्सल के 2) संख्या, पृष्ठभूमि के रूप में चयनित पिक्सल के 3) औसत तीव्रता और;. दिया आकार 10 में संलग्न पिक्सल के 4) कुल तीव्रता चित्रा 3 ए के प्रोटीन मात्रा का ठहराव से पता चलता है पश्चिमी blots चित्र 1 में सचित्र. कुल ERK1 / 2, β-actin, और कुल बीआईएम प्रदर्शनी फ्लोरोसेंट संकेत की एकीकृत तीव्रता में वृद्धि हुई है और प्रोटीन एकाग्रता में वृद्धि (चित्रा 3) के बीच एक रैखिक संबंध की मात्रा. इसके अलावा, चित्रा 3 बी के साथ और चित्रा 2 से खल्क अवरोध के बिना इलाज WM793 मेलेनोमा कोशिकाओं की कुल ERK1 / 2 प्रोटीन का स्तर सामान्यीकृत phospho-ERK1 / 2 की प्रोटीन मात्रा का ठहराव से पता चलता है जो फ्लोरोसेंट पश्चिमी blots, से प्रोटीन के स्तर यों तो कैसे का एक और उदाहरण है . इस मात्रा का ठहराव से, phosphorylated ERK1 / 2 स्तरों पर नियंत्रण के स्तर का एक प्रतिशत के रूप में गणना की जा सकती. इस CA मेंएसई, MEK अवरोध करनेवाला के साथ इलाज मेलेनोमा कोशिकाओं की phospho-ERK के स्तर पर नियंत्रण के 0.6% थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. दो रंग अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने WM793 मानव व्युत्पन्न मेलेनोमा प्रोटीन का दो गुना धारावाहिक dilutions की. Lysates का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण iBlot स्थानांतरण उपकरण का उपयोग कर PVDF झिल्ली पर स्थानांतरित प्रोटीन के साथ एक NuPAGE NOVEX बीआईएस Tris जेल का उपयोग कर अलग हो गए थे . झिल्ली ओडिसी अवरुद्ध बफर में अवरुद्ध है और निम्न प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे: खरगोश विरोधी कुल ERK1 / 2, खरगोश विरोधी कुल बीआईएम, और माउस विरोधी β-actin. एंटीजन एंटीबॉडी परिसरों, विरोधी खरगोश IRDye 800 (हरा) या 680 (लाल) और बकरी विरोधी माउस IRDye 680 (लाल) माध्यमिक एंटीबॉडी, क्रमशः फ्लोरोसेंट बकरी का उपयोग कर पाया गयाऔर ली भ्रष्टाचार ओडिसी क्लासिक इन्फ्रारेड इमेजिंग सिस्टम के साथ कल्पना. पहले पश्चिमी धब्बा पैनल कुल ERK1 / 2 (800 एनएम चैनल हरी) और β-actin (700 एनएम चैनल लाल) फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ पता लगाने का आच्छादन है. दूसरे पैनल इन लक्ष्य प्रोटीन की आणविक भार के आधार पर एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर अलग हो गया था कि एक ही झिल्ली पर कुल बीआईएम की एकल चैनल फ्लोरोसेंट पता लगाने है. कम तीन पश्चिमी धब्बा पैनलों अलग कर एक चैनल फ्लोरोसेंट छवियों के काले और सफेद छवियाँ हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. का एक उदाहरण अवरक्त प्रतिदीप्ति का उपयोग दोनों एक उच्च और खराब गुणवत्ता वाले पश्चिमी धब्बा छवि. DMSO (सीटीएल) या 2 खल्क अवरोध करनेवाला के माइक्रोन, PD0325 के साथ या तो इलाज WM793 मेलेनोमा कोशिकाओं चित्रा 1 में वर्णित के रूप में 901 (MEKi), 18 घंटा के लिए विश्लेषण किया गया. झिल्ली खरगोश विरोधी phospho-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204) के साथ जांच की गई थी, माउस विरोधी कुल ERK1 / 2, और बकरी विरोधी खरगोश IRDye 800 के साथ पाया प्रतिजन प्रतिरक्षी परिसरों के साथ माउस विरोधी phospho-बीआईएम (Ser69) (हरा) और बकरी विरोधी माउस IRDye 680 (लाल). पहले पश्चिमी धब्बा पैनल phospho-ERK1 / 2 (800 एनएम चैनल हरी) और कुल ERK1 / 2 (700 एनएम चैनल लाल) फ्लोरोसेंट संकेतों दोनों के एक साथ पता लगाने का आच्छादन है. दूसरे और तीसरे पैनल phospho और कुल ERK1 / 2 के एक चैनल फ्लोरोसेंट छवियों के काले और सफेद छवियाँ हैं. नीचे दो पैनलों phospho-बीआईएम का फ्लोरोसेंट और काले और सफेद छवियाँ हैं. इन छवियों के कारण प्राथमिक एंटीबॉडी की घटिया गुणवत्ता के लिए इस विधि के साथ परिणाम कर सकते हैं कि एक subpar वेस्टर्न ब्लॉट का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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चित्रा 3. अवरक्त फ्लोरोसेंट पश्चिमी blots. क) कुल ERK1 / 2 की मात्रा, β-actin, और कुल बीआईएम प्रोटीन के स्तर का प्रोटीन मात्रा का ठहराव के उदाहरण हर प्रोटीन बैंड की एकीकृत तीव्रता की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था. एकीकृत तीव्रता झिल्ली पर फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी की राशि के लिए आनुपातिक है. चित्रा 2 से कुल ERK1 / 2 प्रोटीन का स्तर सामान्यीकृत phospho-ERK1 / 2 के आर चुकता मान भी चित्र 1 में विश्लेषण किया एंटीबॉडी से प्रत्येक के लिए रेखीय प्रतिगमन का मूल्यांकन किया गया. बी) मात्रा का एकीकृत तीव्रता गणना कर रहा था फ्लोरोसेंट संकेत और डेटा DMSO के नियंत्रण का एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया है.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के अनुसार उच्च गुणवत्ता, मात्रात्मक पश्चिमी blots पैदा करने में महत्वपूर्ण कदम का अनुसरण कर रहे हैं: 1) प्रोटीन सांद्रता को मापने, 2) नमूना तैयार करने, 3) झिल्ली अवरुद्ध और, 4) प्राथमिक एंटीबॉडी की गुणवत्ता और क्षमता.

कुल प्रोटीन सांद्रता को मापने की सटीकता अवरक्त फ्लोरोसेंट का पता लगाने के असाधारण संवेदनशीलता के नमूने के प्रोटीन एकाग्रता में पाया किसी भी मामूली अंतर बढ़ाना होगा क्योंकि प्रोटीन बैंड बढ़ाता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है. , प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण एक रेखीय प्रतिगमन लाइन या (2 ≥ 0.99 या बेहतर नि.) प्रत्येक नमूने के प्रोटीन एकाग्रता की सटीक गणना में महत्वपूर्ण है 1 के रूप में संभव के रूप में बंद आर चुकता मूल्य के साथ एक मानक वक्र पैदा करने में विसंगतियों से बचने के लिए . उदाहरण के लिए, आर 2 मूल्य ultrapure पानी के साथ ताजा बीएसए मानकों की तैयारी और सावधानी से दोहरा, 0.99 नीचे गिर जाता हैप्रोटीन मात्रा का ठहराव परख आर 2 मूल्य बढ़ाने में मदद कर सकते हैं. यह इस कम आर नमूने के प्रोटीन सांद्रता में 2 मूल्यों और अशुद्धियों को योगदान कर सकते हैं pipetting में विसंगतियां उत्पन्न होगा के रूप में एक multichannel pipettor का उपयोग से बचने के लिए भी अच्छा है.

नमूना तैयार भी एक सीधा इन बैंड की मात्रा का ठहराव पर असर पड़ सकता है, जो प्रोटीन बैंड की गुणवत्ता निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. बीआईएस-tris जेल प्रणाली का उपयोग करते हैं, यह अत्यधिक इस बफर का थोड़ा alkaline पीएच (8.5) डाइसल्फ़ाइड बांड और विकृतीकरण 4 की कमी के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान करता है क्योंकि नमूने एलडीएस नमूना बफर के साथ तैयार कर रहे हैं की सिफारिश की है. यह नमूना बफर भी छोटे पेप्टाइड जेल 4 भागना नहीं है यह सुनिश्चित करने में मदद करता है, जो आगे बढ़ आयन सामने, साथ migrates कि एक तेज डाई सामने पैदा करता है कि एक Coomassie G250 ट्रैकिंग डाई होता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, एलडीएस नमूनानमूने के कारण 8.5-8.0 4 से बदल रहा है बफर का पीएच को 70 डिग्री सेल्सियस पर गरम कर रहे हैं जब बफर aspartyl-prolyl पेप्टाइड बांड की दरार को कम करता है. यह भी प्रोटीन की अखंडता बनाए रखने, जबकि इस प्रोटीन की कमी और alkylation के लिए एक आदर्श वातावरण में यह परिणाम है. एक Tris-Glycine एसडीएस नमूना बफर बजाय एलडीएस नमूना बफर का प्रयोग किया जाता है, तो हालांकि, इस aspartyl-prolyl बांड की दरार, प्रोटीन बैंड की तीव्रता में कमी, और वृद्धि प्रोटीन विखंडन 4 को बढ़ावा मिलेगा. यह भी मिनी सेल वैद्युतकणसंचलन इकाई के अपर बफर चैंबर में एंटीऑक्सीडेंट जोड़ने के लिए प्रासंगिक है. एंटीऑक्सीडेंट बीआईएस-tris जेल प्रणाली में तटस्थ पीएच पर नमूनों के साथ comigrate करने में सक्षम है, यह एक कम राज्य में प्रोटीन को बनाए रखने में मदद मिलेगी और ऑक्सीकरण के खिलाफ डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ ही संवेदनशील अमीनो एसिड की रक्षा, एंटीऑक्सीडेंट की अनुपस्थिति सकते हैं, जबकि सकते हैं विसरित प्रोटीन बैंड 4 के लिए नेतृत्व. अंत में, यह अत्यधिक हैएमईएस या जैल के इन प्रकार के साथ चल बफर Tris-Glycine एसडीएस का उपयोग करने के लिए विरोध के रूप में बीआईएस-tris जैल साथ चल बफर MOPS या तो उपयोग करने के लिए सिफारिश की. बैंड और अधिक संकुचित और कप के आकार 4 प्रदर्शित होने के साथ वैद्युतकणसंचलन चलाते समय में एक नाटकीय वृद्धि के कारण ग्लाइसिन आयनों की धीमी प्रवास में बफर और बीआईएस-tris जैल परिणाम रनिंग Tris-Glycine एसडीएस के संयोजन.

अवरुद्ध कदम भी विभिन्न अवरुद्ध एजेंट के रूप में कई उच्च झिल्ली पृष्ठभूमि उत्पन्न कर सकते हैं फ्लोरोसेंट का पता लगाने का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले पश्चिमी धब्बा छवियों के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है. अवरक्त फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए, यह कम पृष्ठभूमि को बनाए रखते हुए इस विशिष्ट अवरुद्ध एजेंट प्रोटीन का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है क्योंकि ओडिसी अवरुद्ध बफर का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. नोनफेट शुष्क दूध, छेना, या बीएसए भी वैकल्पिक अवरुद्ध एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, समाधान के इन प्रकार के उच्च झिल्ली पृष्ठभूमि के कारण और बिंदी में कुछ मामलों में कमी कर सकते हैंप्राथमिक एंटीबॉडी 10 की एनजी आत्मीयता. इसके अलावा, दूध आधारित ब्लॉकर्स 9,11 बाध्यकारी प्रोटीन का पता लगाने और उचित एंटीबॉडी की सटीकता के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो phospho-epitopes और विरोधी बकरी एंटीबॉडी के साथ पार प्रतिक्रिया कर सकते हैं कि आईजीजी हो सकती है. एक पश्चिमी धब्बा छवि उच्च पृष्ठभूमि, अविशिष्ट बैंड, या कमजोर / कोई संकेत से ग्रस्त है लेकिन, अगर, तो इन वैकल्पिक अवरुद्ध एजेंटों में से एक का उपयोग छवि की गुणवत्ता में सुधार के लिए मदद मिल सकती है. इसके अलावा, यह भी इस पृष्ठभूमि और / या झिल्ली 9,12 से लक्ष्य प्रोटीन की हानि में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में अवरुद्ध कदम और लंबे समय अवरुद्ध incubations के लिए डिटर्जेंट जोड़ने से बचने के लिए सिफारिश की है.

इसके साथ ही एक 700 एनएम और 800 एनएम चैनल डाई के साथ लेबल अवरक्त एंटीबॉडी का उपयोग कर एक ही दाग ​​पर दो अलग एंटीजन का पता लगाने के लिए दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विवेकपूर्ण चयन की आवश्यकता है. दो प्राथमिक एंटीबॉडी अलग अस्पताल से प्राप्त किया जाना चाहिएटी प्रजातियों. एक प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश से प्राप्त होता है, तो उदाहरण के लिए, तो दूसरा प्राथमिक एंटीबॉडी माउस के रूप में खरगोश अलावा किसी अन्य विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त करने की आवश्यकता है. इसी तरह, अवरक्त माध्यमिक एंटीबॉडी भी प्राथमिक एंटीबॉडी से प्रत्येक के रूप में एक ही मेजबान प्रजातियों से ली गई है और विभिन्न fluorophores के साथ लेबल किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, 800 एनएम चैनल में एक बकरी विरोधी खरगोश सही खरगोश और माउस से निकाली गई है कि दो अलग प्राथमिक एंटीबॉडी से प्रोटीन संकेत निरीक्षण करने के क्रम में 700nm चैनल में एक बकरी विरोधी माउस साथ जोड़ा जा सकता है.

प्राथमिक एंटीबॉडी उनके प्रतिजन के लिए उनकी गुणवत्ता, आत्मीयता, और संवेदनशीलता में काफी भिन्नता है. इस संकेत में एक महत्वपूर्ण कमी या जिससे सही लक्ष्य प्रोटीन दृश्यमान करने में कठिनाइयों बनाने झिल्ली के लिए प्रोटीन की अविशिष्ट बंधन में वृद्धि हो सकती है. इस प्रकार, एक वैकल्पिक अवरुद्ध ऐसे नोनफेट शुष्क दूध के रूप में समाधान, या का उपयोग करकेपीबीएस में भंग कैसिइन, खराब गुणवत्ता वाले प्राथमिक एंटीबॉडी 10 के साथ प्रोटीन का पता लगाने में सुधार करने में मदद कर सकते हैं. इसके अलावा, डिटर्जेंट एकाग्रता भी एंटीबॉडी धोने दूर से बचने के क्रम में डिटर्जेंट की एकाग्रता का निर्धारण करते समय विचार किया जाना चाहिए लक्ष्य प्रतिजन और एहतियात के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन को प्रभावित कर सकते हैं. पतला एंटीबॉडी के लिए जोड़ा जब PVDF झिल्ली 10 का उपयोग विशेष रूप से जब एसडीएस (0.01-0.02%) की एक कम एकाग्रता, पृष्ठभूमि और nonspecific बंधन को कम कर सकते हैं. हालांकि, एसडीएस भी सिग्नल की शक्ति में एक गंभीर कमी को प्रमुख रूप से बाध्यकारी प्रतिजन प्रतिरक्षी को बाधित कर सकते हैं.

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित उपन्यास संशोधनों पारंपरिक पश्चिमी सोख्ता तकनीक के लिए एक आधुनिक दृष्टिकोण मिसाल है. इन अत्याधुनिक प्रगति काफी प्रभावकारिता, स्थिरता, और पश्चिमी डेटा की संवेदनशीलता को बेहतर बनाने और कई लक्ष्य प्रोटीन की सही मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता हैभले ही उनके सिग्नल की शक्ति का एक ही झिल्ली पर. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन बहुमूल्य परिवर्तन भी काफी उच्च गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा का निर्माण करते हुए एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन की प्रयोगात्मक समय कम.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उनकी सहायता और समर्थन के लिए मैकमोहन प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध में एक NIH / NCI R01 CA176839-01 (एम एम) और एक संस्थागत अनुसंधान और अकादमिक कैरियर विकास पुरस्कार (जे एस के लिए IRACDA) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific/Pierce 23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer  Invitrogen/Life Technologies NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent  Invitrogen/Life Technologies NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer Invitrogen/Life Technologies NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer Invitrogen/Life Technologies NP0001
NuPAGE Antioxidant Invitrogen/Life Technologies NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well  Invitrogen/Life Technologies NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well Invitrogen/Life Technologies NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5925
XCell SureLock Mini-Cell  Invitrogen/Life Technologies EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular Invitrogen/Life Technologies IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini Invitrogen/Life Technologies IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular Invitrogen/Life Technologies IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini Invitrogen/Life Technologies IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device  Invitrogen/Life Technologies IB1001
β-Actin Sigma A2228
Phospho-BIM (S69) BD Biosciences N/A
Total BIM Epitomics 1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) Cell Signaling Technology 4370
Total ERK1/2 Cell Signaling Technology 9107
Odyssey Blocking Buffer  LI-COR Biosciences 927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG  LI-COR Biosciences 926-68020
Western Incubation Box, Medium  LI-COR Biosciences 929-97205
Odyssey Classic Imaging System LI-COR Biosciences N/A
Odyssey Application Software V3.0.30 LI-COR Biosciences N/A

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References

  1. Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 84 पश्चिमी धब्बा बीआईएस-tris वैद्युतकणसंचलन शुष्क सोख्ता प्रोटीन स्थानांतरण अवरक्त प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव एंटीबॉडी प्रोटीन
टाउन में पश्चिमी सबसे तेज: क्लासिक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण पर एक समकालीन मोड़
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Silva, J. M., McMahon, M. The… More

Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. J. Vis. Exp. (84), e51149, doi:10.3791/51149 (2014).

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