타운 웨스턴 가장 빠른 : 클래식 웨스턴 블롯 분석에 현대 트위스트

Summary

이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 수행의 최신 발전을 탐구한다. 이러한 신규 한 변형은 35 분간 전기 영동 실행 시간, 12 분 건조 블로 팅 전송 시스템, 및 고해상도, 고품질, 감도 및 서부 데이터의 개선 된 정확성을 생성하는 적외선 형광 단백질 감지 및 이미징 비스 - 트리스 겔 시스템을 이용한다.

Abstract

원래 1970 년대 후반에 설립 된 웨스턴 블롯 기술은 여전히​​ 적극적으로 오늘날 사용된다. 그러나, 웨스턴 블로 팅의 전통적인 방법은 낮은 품질의 해상도, 가짜 밴드, 감도를 감소, 불량 단백질의 무결성을 포함 몇 가지 단점이있다. 최근 비약적으로 진보는 더 높은 질적 및 양적 데이터를 생성하기 위하여 표준 웨스턴 블롯 프로토콜의 수많은 양상을 개선했다. 비스 - 트리스 젤 시스템, 종래 램리 시스템에 대한 대안은, 저렴한 단백질 분리 및 해상도가 발생하는 단백질의 무결성을 유지하고, 35 분의 실행 시간에 전기 영동을 감소시킨다. 또한, 건조 iBlot 블롯 시스템이 극적 종종 긴 전송 시간에 더 비효율적 전통적인 단백질 전송 방법 대조적이다 7 분에서 멤브레인 단백질 전달의 효율 및 속도를 개선한다. 이 매우 혁신적인 수정, 단백질 D와 함께금 속 탐, 고품질의 적외선 형광 이미징 결과를 사용하여보다 정확하고 화학 발광의 표준 웨스턴 블로 팅 기술에 비해 데이터의 일관성. 이 기술은 동시에 다른 형광 채널에서 시각화 두 색 근적외선 염료를 이용하여, 동일한 막에 두 가지 항원을 검출 할 수있다. 또한, 형광 촬상의 선형성과 넓은 다이내믹 레인지가 강하고 약한 모두 단백질 밴드의 정확한 정량을 허용한다. 따라서,이 프로토콜은 크게이 실험의 연주 시간을 줄이면서 이러한 진보는 현저 데이터의 품질을 높일 수있는 고전 웨스턴 블랏 방법을 개선 키를 설명한다.

Introduction

웨스턴 블롯의 기술은 제 ^{1-3 항체를} 사용하여 단백질을 검출하기위한 더 나은 방법을 만들기 위해 1977 년과 1979 년 사이에 개발되었다. 이 절차는 이차 항체를 사용하여 시각 및 오토 라디오 그래피, UV 광, 또는 퍼 옥시 다제 반응 생성물 ^(3)에 의해 검출 된 표적 단백질과 함께 SDS-PAGE 젤에서 세포막 단백질의 전기 영동 이동을 이용했다. 따라서, 이와 같은 기본 원칙은 여전히​​ 널리 오늘날의 서양 얼룩 프로토콜에 사용됩니다. 그러나이 고전적인 웨스턴 블로 팅 기술은 저속 전기 실행 시간, 낮은 해상도와 인공 단백질 밴드, 단백질 분해에 대한 감수성, 그리고 감도를 제한뿐만 아니라 가난한 데이터 품질 ^4로 존재 많은 단점을, 않습니다. 따라서,이 프로토콜은보다 정확한 정성 및 정량 데이터를 생성하는 표준 웨스턴 블롯 절차에 상당한 발전과 개선에 대해 설명합니다.

"> SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 광범위한 분리 램리 시스템이 웨스턴 블롯 시스템의 인기에도 불구. 웨스턴 블롯 ⁵ 가장 널리 사용되는 겔 시스템이며,이 방법은 대역 왜곡, 해상도의 손실 및 초래할 수 스퓨리어스 대역 ^4.이 분리 겔 감소 디설파이드 겔의 다른 레 독스 상태에 의한 결합 및 아스 파르 틸-프 롤릴 개열의 재산 화의 높은 pH (9.5)에 의한 단백질의 탈 아미 노화 및 알킬화의 결과 일 수있다 램리 완충액 (pH 5.2) ^4,6에서 단백질을 가열에 의한 펩티드 결합., 중성 pH (7.0)로 작동 Lamemmli 시스템에 비해 상당한 이점을 제공 비스 - 트리스 겔 시스템.이 시스템은 단백질 안정성, 최소화 향상 단백질 변형은 그들의 감소 된 상태로 유지하는 단백질을 전기 영동시 아스 파르 틸-프 롤릴 절단을 방지하고,보다 중요하게, 전기 영동 실행 시간은 t, 또. 35 분이다 ^4,6,7그는 비스 - 트리스 젤 시스템은 더 신뢰할 수있는 데이터 ^4의 결과로 선명 밴드, 더 높은 해상도와 분리, 증가 감도를 생산하고 있습니다.

비스 - 트리스 젤 시스템과 함께, iBlot 드라이 블롯 시스템은 크게 7 ^{분으로 13} 시간 이내 막 상 겔로부터 단백질의 전송 시간을 줄이기 위해 높은 전계 강도와 전류를 사용한다. 이 반송 시스템은 단백질 ^13의보다 효율적이고 신뢰성있는 전송을 생성 건조 블로 팅 방법에 근거한다. : 기존의 전송 시스템에 iBlot 전송 시스템의 효과에 대한 자세한 비교 내용은 다음 웹 사이트를 참조하십시오 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . 이는 이온 공기통 ⁸ 역할 적절한 전송 버퍼를 포함 겔 매트릭스로 구성되는 양극과 음극 스택을 이용한다. 전송 동안, 물 전기 분해 대역 왜곡 ^8시키지 않고보다 일관된 단백질 전사 초래 구리 양극으로부터 산소의 발생을 방지하는 것을 돕는다. 또한,이 반송 시스템은 또한 전극 ⁽⁸⁾ 사이의 거리를 줄임으로써 전송 속도를 증가시킨다.

화학 발광은 서양 얼룩의 단백질 검출 분석을위한 가장 일반적이고 전통적인 기법이지만, 두 컬러 적외선 형광 검출이 크게 웨스턴 블롯 데이터의 민감도, 품질과 정확도를 향상시켜줍니다. 이 검출 방법이 최적의 파장 700 nm의 적외선 레이저 여기를 사용800 nm의 최대 신호 대 잡음 비 및 높은 감도를 가진 ⁹ 클리어 데이터 이미지를 생성한다. 따라서,이 목적 단백질은 700 nm 내지 800 nm의 형광 검출 채널을 사용하는 동일한 멤브레인 동시에 가시화 될 수있다. 더 중요한 것은, 적외선 형광의 선형성 및 동적 범위는 강하고 약한 두 단백질 밴드 ^(9)의 정확한 정량 분석을 할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 이러한 공정의 효능을 손상하고 더 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 생성하기 위하여 적외선 형광 단백질 검출을 이용하지 않고 본 실험의 전기 및 전송 시간을 감소시킴으로써 고전 웨스턴 블로 팅 기법을 통해 엄청난 장점 및 개선을 제공한다.

Protocol

1. 세포 배양에서 전체 세포 용 해물의 준비

1. 얼음에 세포 배양 접시를 놓고 5 밀리미터 EDTA (PBS의 예를 들어, 5 ㎖ 5 mM의 EDTA/10 cm ² 플레이트)와 차가운 PBS를 추가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 요리에서 자기편 세포를 제거하고 차가운 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
2. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 rpm으로 (230 XG)에서 저속 원심 분리하여 세포 현탁액을 펠렛 얼음에 원뿔 튜브를 놓고 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
3. 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS 1 ㎖와 펠렛을 씻고 감기에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 펠렛 세포를 10 초 동안 13,000 RPM (13,226 XG)에서 빠른 스핀 정지. 조심스럽게 얼음에 펠릿과 장소 튜브를 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다.
4. 에서, (예 : 3 × 10 ⁶ 세포에 RIPA 버퍼 ~ 150 μl를 추가 펠릿의 크기에 따라) 25 ~ 200 μL에 펠렛을 재현 탁RIPA 완충액 (50 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.5 mM의 EDTA, 10 mM의 불화 나트륨, 0.1 % SDS, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % NP-40) 2X 최종 농도 갓 첨가 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 포함. 간단히 각 튜브 와동과 얼음에 20 ~ 30 분 동안 현탁액을 품어. 주 : 단백질 및 그들의 변성 세제 (즉 SDS, 트리톤 X-100, 또는 NP-40)의 강도를 용해하는 능력이 다른 단백질을 추출하는 데 사용할 수있는 몇개의 용해 버퍼가있다. RIPA 버퍼는 전체 세포 용 해물을 준비하고 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하는 데 유용합니다.
5. 4 ℃에서 5 분 동안 14,000 RPM (15,339 XG)에서 포스트 핵 분수, 원심 분리기 해물을 만들려면 얼음 핵 농축 펠릿과 장소 튜브를 중단하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 참고 : 상층 액을 추출하는 동안 핵 농축 펠릿은 또한 튜브에서 분리 할 수​​ 있습니다. 핵 농축 펠렛을 수집 방지하기 위해, 내가 직접 피펫 팁을 배치점성 핵 농​​축 펠릿 n을하고 처리하기 위해 피펫으로 그려.
6. BCA 또는 브래드 같은 단백질 정량 분석​​법을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 각 샘플의 단백질 농도를 결정한다.

2. 샘플 준비 및 전기

1. 아래에 설명 된 다음 표에 따라 각 샘플을 준비합니다. 대안으로, β-메르 캅토 에탄올로는 2.5 %의 최종 농도로 사용할 수있다. 그러나, 환원제 겔을 적재하기 전에 시간에 각각의 샘플까지 첨가한다. 각 제조 된 샘플의 20 μL와 피펫의 변화에​​ 대한 전체 볼륨의 계정이 아니라 당로드.

   시약	REDUCED SAMPLE
   단백질 샘플	X μL
   배 LDS 샘플 버퍼	6 μL
   500 nm의 DTT 레드ucing 에이전트	2.4 ㎕의
   탈 이온수	최대 15.6 μL
   총 양	24 μL

2. 10 분 동안 70 ° C에서 열 샘플. 샘플을 가열하는 동안 (50 ㎖의 20 배의 MES 또는 버퍼를 실행 MOPS 플러스 950 ㎖의 탈 이온수) 버퍼를 실행 1X MES 또는 MOPS 1000 ML을 준비합니다. 버퍼를 실행 MES는 MES 빠르게 MOPS ⁴ 이상 실행 버퍼를 실행 할 수있는 하부의 pKa와 2-200 kDa의 사이의 작은 분자량의 단백질을 해결하는 반면 버퍼를 실행 MOPS는 14-200 kDa의 사이에 중간 크기의 단백질을 해결합니다. 따라서,이 두 버퍼는 단백질 밴드 ^4의 분리의 차이로 연결 스태킹 겔 내에서 이온의 이동에 영향을 대조했다. 옆으로 설정하고 최소의 위 버퍼 챔버를 채우는 데 사용됩니다 (200) 1X MES의 ML 또는 산화 방지제의 500 μL로 버퍼를 실행 MOPS를 결합I-세포 전기 영동 장치.
3. 샘플은 얼음을하기 전에 난방, 빠른 스핀 샘플을 완료하면.
4. 전기의 소형 휴대 기기에 프리 캐스트 비스 - 트리스 젤의 어셈블리에 대한 제조 업체의 지침을 따르십시오. 주 : 각 젤이 각 겔의 짧은 (작은) 카세트 버퍼 핵심을 향해 안쪽으로 향하고 젤 레벨 강력히 어퍼 버퍼 상공 회의소에서 누출을 방지하기 위해 버퍼 코어에 대해 가압 그런 방식으로 지향되어 있는지 확인합니다.
5. 1X MES 또는 항산화 및 1X MES 또는 버퍼를 실행 MOPS 약 600 mL를 소형 휴대 기기의 낮은 버퍼 챔버를 포함하는 버퍼를 실행 MOPS의 200 ㎖로 위 버퍼 챔버를 입력합니다. 버퍼를 실행하는 별도의 200 ~ 300 ㎖를 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. 그러나, 버퍼의 pH와 품질이 변경 될 수 있으므로 전기를 실행하는 동안 사용되는 버퍼를 재활용하지 않는 것이 좋습니다.
6. 각 단백질 SAMP의 20 μl를로드르 각 웰에. 여러 항체 (즉, 2 개 이상)를 조사하기 위해 여러 지구로 막 절편 경우, 그것은 매우이 될 것입니다 각 젤의 첫 번째와 마지막 우물 prestained 단백질 표준의 2-5 μl를로드하는 것이 좋습니다 단백질 밴드의 화상에 영향을주지 않고 막 다른 섹션을 분리하기위한 가이드 등을 절단.
7. 끝의 시작과 젤 당 70~80mA에서 110-125mA / 젤의 예상 전류를 35 분 동안 200 V 불변의 실행 젤. 추적 염료 버퍼 코어 따라 백금 와이어로 마이그레이션 할 때 전기가 완료됩니다.

3. iBlot 드라이 블로 팅 시스템을 사용하여 단백질 전송

1. 완전히 (이 지직 거리는 소음이 발생할 수 있습니다) 카세트 테이프의 접착면을 끊어서 미니 젤을 분리합니다. 짧은 (작은) 판을 취소하고 조심스럽게 탈 물을 용기에 이상 (슬롯) 판에서 젤을 전송하고아래쪽에있는 젤의 두꺼운 발 부분을 제거합니다. 참고 : 드문 경우에, 젤이 더 짧은 플레이트 대신에 연결할 수 있으며, 플레이트 성공 시켰습니다. 이 경우, 더 이상, 홈판을 폐기하고 하단에 위치한 겔의 두께 왼발 부분을 제거한다. 그런 다음 조심스럽게 탈 이온수에 짧은 플레이트에서 젤을 전송합니다.
2. 제조업체의 지시에 따라 양극과 음극 전송 스택을 조립한다. 참고 : 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 모두 세포막 단백질의 높은 품질과 효율적인 전송을 제공하고 형광 검출 ^8과 호환됩니다. 그러나, PVDF 막은 니트로 셀룰로스보다 높은 결합능 (240 ㎍ / cm ³⁾ (200 ㎍ / cm ^{3) (8)를} 가지고있다.
3. 조심스럽게 기포 또는이 같은 젤과 막 사이에 갇힌 공기를 전송하는 동안 단백질 밴드의 왜곡을 방지 할 수 있습니다 제거합니다. 참고 : 막 또는 TRANSF 트림하지 않습니다어이 양극과 음극 스택 사이의 직접 접촉을하게됩니다로 젤 크기에 맞게 스택.
4. 후 제대로 건조 블로 팅 장치에 전송 스택을 조립, 적절한 전압 프로그램 (즉, 프로그램 3 : 7 분 20 V)을 선택하고 전송을 시작합니다. 주 : 150 kDa의 단백질보다 더 느리게 이주 경향 8-10 분의 긴 전송 시간을 필요로 할 수있다. 또, 50-10 분 동안 20 % 에탄올에서 겔의 사전 인큐베이션은 또한이 큰 단백질의 전사 효율을 향상시키는 것을 도울 것이다. 전송 프로그램이 완료되면, 장치는 자동으로 전류를 차단한다. 그것은 바로 막을 제거하고 더 나은 단백질 검출을 확인하고 막을 건조 방지하기 위해 차단 절차를 진행하는 것이 가장 좋습니다.

4. 적외선 형광 단백질 검출

1. 오디세이는 1 시간 또는 버퍼 (트윈 20을 추가하지 마십시오) 차단의 0.8 ㎖ / cm ^2의 최소의 블록 막 (들)하룻밤에 4 ° C. 막 (들)도 있지만이 높은 배경의 원인이 단백질 검출을 방해 할 수 있습니다, 탈지 분유와 차단 될 수 있습니다.
2. 4 ℃에서 하룻밤 동안 0.1 % 트윈 (20)와 버퍼를 차단 오디세이에서 원하는 농도 차 항체에 막 (들)을 품다 두 개의 다른 항원이 동일한 블롯에 시각화되는 두 색 검출을 위해,이 일차 항체는 다른 호스트 종으로부터 유도되어야하며 멤브레인 (들)에 동시에 첨가. 참고 : 이전에 일차 항체에 멤브레인 (들) 배양에, 막 (들) 같은 막에 여러 항체 (즉, 2 개 이상)를 조사하기 위해 여러 조각으로 절개 할 수있다.
3. TBS에서 10 분 플러스 0.1 % 트윈 - 20 부드러운 흔들림 함께 막 (들) 배를 씻으십시오.
4. Odysse에서 800 nm의 채널에 대한 700 nm의 채널과 1:6,000-1:10,000에 대한 1:20,000의 희석에 형광 표지 된 이차 항체와 막 (들)을 품다Y는 (이상 1 시간 동안 막 (들)을 배양하는 배경을 증가시킬 수있다) 30 ~ 60 분 동안 0.1 % 트윈 (20)와 버퍼를 차단. 빛으로부터 멤브레인 (들)을 보호합니다. 주 : 이차 항체는 일차 항체의 각각과 동일한 호스트 종 유래의 다른 형광체로 표지 할 필요가있다.
5. TBS에서 10 분 플러스 0.1 % 트윈 - 20 부드러운 흔들림 함께 막 (들) 배를 씻으십시오. 빛으로부터 멤브레인 (들)을 보호합니다.
6. 스캔 및 적외선 이미징 시스템 군데까지 막 (들) 트윈 20 4 ° C에서하지 않고 건조 또는 TBS 또는 PBS 중 하나에 저장 될 수있다. 제대로 빛으로부터 보호하는 경우 형광 신호가 몇 달 동안 안정적으로 유지됩니다.

Representative Results

두 컬러 적외선 형광 향상된 감도 및 클리어 웨스턴 블롯 이미지를 생성하기 위해 가장 높은 신호 - 대 - 잡음비와 같은 막에 강하고 약한 두 대역을 검출한다. 700 nm의 800 nm의 형광 채널 모두에서 시각화 두 가지 색상 웨스턴 블롯 검출에 의해 생성 된 전형적인 결과는 그림 1과 2에 예시되어있다. 그림 1의 최상위 웨스턴 블롯은 인간에서 해물의 두 가지 직렬 희석의 700 nm의 채널 (적색)의 800 nm의 채널 (녹색) 및 β-액틴 총 ERK1 / 2의 동시 (오버레이) 감지를 보여줍니다 흑색 종 세포주, WM793을 유도. 또,이 막도 동일 블롯에 피검 이상이 항체를 허용하기 위해 목적 단백질 표적 분자량에 근거 섹션으로 절단되었다. 예를 들어, 그림 1에서 분석 막 하부 포트를 조사하기 위해 반으로 잘라되었다총 ERK1 / 2와 β-액틴 모두의 검출을 추론하지 않고 세 번째 항체, 총 BIM (700 nm의 채널 빨간색)와 멤브레인의 이온. 그림 2의 첫 번째 패널은 더 포스 포-ERK1 / 2의 2 색 웨스턴 블롯 형광 검출 방법을 보여줍니다 (800 nm의 채널 녹색) 총 ERK1 / 2 (700 nm의 채널 빨간색) 포스 포-ERK 및 총 ERK 신호를 겹치는 ERK1 / 2 MAP 키나제 신호 전달 경로를 억제 MEK1 / 2 억제제, PD0325901 (메키)의 유무에 처리 WM793 흑색 종 세포의 노란색으로 표시됩니다. 또한, 700 ㎚, 800 nm의 형광 이미지는 각 항체에 대한 표준 흑백 웨스턴 블롯 이미지로 변환 (그림 1과 2) 할 수 있습니다. 도 1 및도 2에 나타내 같이 일반적으로,이 프로토콜에 의해 생성 웨스턴 블롯 이미지의 대부분은 고품질 이미지를 초래할 것이다. 그러나, 선택성에 따라, 특이성최적의 이미지보다 작은 차 항체의 품질은,이 방법에 의해 분석 말의 작은 부분이 발생할 수있다. 예를 들어, 그림 2의 하단에 두 개의 패널에 관찰로 및 MEK 억제하지 않고 처리 WM793 흑색 종 세포에서 인산화 BIM 항체의 평균 이하의 품질은 희미한 단백질 밴드와 매우 높은 막 배경으로 웨스턴 블롯 이미지로 만들었습니다.

두 가지 목표를 동시에 적외선 형광 이미징은 효율적이고 정확하게 같은 막에 강하고 약한 두 밴드를 감지하여 폭 넓은 선형 동적 범위에 걸쳐 서양 말의 정량 분석​​을위한 기회를 제공 할 수 있습니다. 단백질 밴드의 정량은 멤브레인에 형광 표지 된 항체의 양에 비례하고 밴드와 해상도 주위 그려진 모양의 양의 크기와 독립적이며 통합 강도로 산출된다. 이것은 이하의 기준에 따랐다 : 1) 아르형상, 모양에 동봉 된 픽셀의 2) 번호, 배경으로 선택된 픽셀의 3) 보통 강도와;. 주어진 모양 ^(10)에 둘러싸인 픽셀 4) 전체 강도 그림 3a는의 단백질 정량을 보여줍니다 서양 말은 그림 1. 총 ERK1 / 2, β-액틴 및 다운로드 BIM 전시 형광 신호의 적분 강도의 증가와 단백질 농도의 증가 (도 3a) 사이의 선형 관계를 정량화. 또한,도 3b와 그림 2에서 MEK 억제하지 않고 처리 WM793 흑색 종 세포의 총 ERK1 / 2 단백질 수준으로 정규화 포스-ERK1 / 2의 단백질 정량을 보여줍니다 형광 서양 말에서 단백질 수준을 정량화하는 방법의 또 다른 예입니다 . 이 정량화에서 인산화 된 ERK1 / 2 레벨 제어 레벨의 백분율로 계산 될 수있다. 이 캘리포니아에있는SE, MEK 억제제로 치료 흑색 종 세포의 포스 포-ERK 레벨 컨트롤의 0.6 %였다.

도 1. 두 색 적외선 형광 단백질 검출 WM793 인간 유래 흑색 단백질의 두 배 일련 희석액. 용 해물을 이용하여 웨스턴 블롯 분석 iBlot 반송 장치를 이용하여 PVDF 막에 전사 단백질 NuPAGE Novex은 비스 - 트리스 겔을 사용하여 분리 하였다 . 멤브레인은 오디세이 버퍼를 차단에서 차단 다음과 같은 기본 항체와 프로빙되었다 : 토끼 반대로 총 ERK1 / 2, 토끼 반 전체 BIM, 마우스 방지 β-액틴. 항원 - 항체 복합체는, 안티 - 토끼 IRDye 800 (녹색) 또는 680 (빨강) 및 염소 항 - 마우스 IRDye 680 (빨강) 2 차 항체, 각각 형광 염소를 사용하여 검출되었다와 LI-COR 오디세이 클래식 적외선 이미징 시스템과 시각. 첫 번째 웨스턴 블롯 패널은 총 ERK1 / 2 (800 nm의 채널 녹색) 및 β-액틴 (700 nm의 채널 빨간색) 형광 신호를 동시에 검출 오버레이입니다. 제 2 패널은 이러한 표적 단백질의 분자량에 근거 면도날을 사용하여 분리하고 동일한 막에 다운로드 BIM의 단일 채널 형광 검출이다. 마지막 세 웨스턴 블롯 패널은 분리 된 단일 채널 형광 이미지의 흑백 이미지입니다.

그림 2.의 예 적외선 형광을 사용하여 두 고 가난한 품질의 웨스턴 블롯 이미지. DMSO (CTL) 또는 2 MEK 억제제 μM, PD0325 중 하나를 처리 WM793 흑색 종 세포 도 1에 기재된 바와 같이 901 (메키)는, 18 시간 동안 분석 하였다. 멤브레인은 토끼 항 - 포스 포-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204)를 프로빙하고, 마우스 항 - 총 ERK1 / 2 및 염소 항 - 토끼 IRDye 800 검출 항원 - 항체 복합체와 마우스 항 - 포스 포-BIM (Se​​r69) (녹색), 염소 항 - 마우스 IRDye 680 (빨강). 첫 번째 웨스턴 블롯 패널은 포스 포-ERK1 / 2 (800 nm의 채널 녹색) 총 ERK1 / 2 (700 nm의 채널 빨간색) 형광 신호 모두를 동시에 검출 오버레이입니다. 두 번째와 세 번째 패널은 포스 총 ERK1 / 2의 단일 채널 형광 이미지의 흑백 이미지입니다. 바닥이 패널은 포스 - BIM의 형광 및 흑백 이미지입니다. 이러한 이미지로 인해 차 항체의 이하의 품질이 방법으로 발생할 수있는 평균 이하의 웨스턴 블롯의 예를 나타냅니다.

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도 3은. 적외 형광 웨스턴 말. A) 총 ERK1 / 2의 정량화, β-액틴 및 다운로드 BIM 단백질 수준의 단백질 정량의 예로는 각 단백질 밴드의 적분 강도를 계산함으로써 결정 하였다. 통합 강도는 막에서 형광 표지 된 이차 항체의 양에 비례한다. 도 2에서 총 ERK1 / 2 단백질 수준으로 정규화 포스 포-ERK1 / 2의 R-제곱 값도도 1에서 분석 항체의 각각에 대한 선형 회귀 분석을 평가하는 데 사용 하였다. B) 정량의 적분 강도를 이용하여 계산 하였다 형광 신호와 데이터는 DMSO 제어의 백분율로 표시됩니다.

Discussion

이 프로토콜에 따라 고품질, 정량적 웨스턴 말 생성에 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 단백질의 농도를 측정하는 단계 2) 샘플 준비, 3) 멤브레인을 차단하고, 4) 일차 항체의 품질과 그릇.

총 단백질 농도를 측정의 정확도는 적외선 형광 검출의 뛰어난 감도는 샘플의 단백질 농도에서 발견 된 약간의 차이를 증폭 때문에 단백질 밴드를 정량화에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. , 단백질 농도를 결정하는 선형 회귀 직선 또는 ⁽² ≥ 0.99 이상이 R) 각 시료의 단백질 농도의 정확한 계산에 중요 한 최대한에 가깝게 R-제곱 값과 표준 곡선을 생성하는 불일치를 방지하려면 . 예를 들어, ^R이 값은 초순수로 신선한 BSA 표준을 준비하고 신중 반복, 0.99 아래로 떨어지면단백질 정량 분석은 R ² 값을 증가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은이 감소 R 시료의 단백질 농도의 ² 값과 부정확성에 기여할 수있는 피펫에 불일치가 발생합니다 같은 멀티 채널 피펫을 사용하지 않도록하는 것이 좋습니다.

시료 준비는 또한 직접이 밴드의 정량에 영향을 미칠 수있는, 단백질 밴드의 품질을 결정하는데 중요한 역할을한다. 비스 - 트리스 겔 시스템을 사용하는 경우, 그것은 매우이 버퍼의 약 알칼리성의 pH (8.5)은 이황화 결합 및 변성 ^(4)의 감소에 대한 최적 조건을 제공하기 때문에 샘플 LDS 샘플 완충액으로 제조되는 것이 추천된다. 이 샘플 버퍼는 작은 펩티드 젤 ^4를 실행하지 않도록하는 데 도움이 이동하는 이온 전면으로 마이그레이션 날카로운 염료 앞을 생산하는 쿠마 G250 추적 염료가 포함되어 있습니다. 더 중요한 것은, LDS 샘플샘플 인해 8.5-8.0 ^4에서 변경 버퍼의 pH를 70 ° C로 가열 할 때 버퍼 아스파 틸 - 프 롤릴의 펩타이드 결합의 절단을 최소화한다. 또한 단백질의 무결성을 유지하면서이 단백질 환원과 알킬화를위한 이상적인 환경을 초래한다. 트리스 - 글리신 SDS 샘플 버퍼 대신 LDS 샘플 완충액을 사용하는 경우, 이것은 아스 파르 틸-프 롤릴 결합의 절단, 단백질 밴드의 예리함의 감소 및 증가한 단백질을 단편화 ^4로 이어질 것이다. 또한 소형 셀 전기 영동 장치의 어퍼 버퍼 챔버에 산화 방지제를 추가 타당한. 항산화 비스 - 트리스 겔계 중성 pH에서 샘플 comigrate 할 수 있기 때문에,이 감소 된 상태로 단백질을 유지하고 산화 대해 이황화 결합뿐만 아니라 민감한 아미노산을 보호, 산화 방지제의 부재는 수있는 반면 수 확산 단백질 밴드 ^4로 이어집니다. 마지막으로, 그것은 매우입니다MES 또는 젤 이러한 유형의 버퍼를 실행 트리스 - 글리신 SDS를 사용하는 것이 아니라 비스 - 트리스 젤로 버퍼를 실행 MOPS 중 하나를 사용하는 것이 좋습니다. 밴드 더 압축 된 컵 모양의 ^{4 나타나는와} 전기 실행 시간에 극적인 증가를 일으키는 원인이 글리신 이온의 느린 이동에 버퍼 및 비스 - 트리스 젤 결과를 실행 트리스 - 글리신 SDS의 조합.

차단 단계는 다양한 차단제의 많은 높은 막 배경을 생성 할 수있는 형광 검출을 사용하여 고품질의 웨스턴 블롯 이미지를 작성하기위한 매우 중요합니다. 적외선 형광 검출의 경우, 낮은 배경을 유지하면서이 특정 차단 에이전트가 단백질의 검출 감도를 증가하기 때문에 오디세이 버퍼를 차단 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다. 탈지 분유, 카세인, 또는 BSA는 또한 대안적인 블로킹 제로서 사용될 수 있지만, 이러한 유형의 솔루션은 높은 막 배경을 일으킬 빈디 일부 경우에 감소시킬 수있다차 항체 ^(10)의 NG 선호도. 또한, 우유 기반 차단제는 ^9,11를 결합 단백질의 발견과 적절한 항체의 정확성을 방해 할 수있는 포스 - 에피토프 및 안티 염소 항체와 교차 반응 할 수 IgG에 포함되어있을 수 있습니다. 웨스턴 블롯 이미지가 하이 백, 비특이적 밴드, 또는 약한 / 신호 없음으로 퍼진 경우, 다음 이러한 대안 차단제 중 하나를 이용하여 화상의 품질을 개선하는 데 도움이 될 수있다. 게다가, 그것은 또한 이러한 배경 및 / 또는 멤브레인 ^9,12에서 표적 단백질의 손실의 증가로 이어질 수 있으므로 차단 단계와 긴 협착 배양에 세제를 추가 피하기 위해 추천.

동시에 700 nm 내지 800 nm의 채널 염료로 표지 된 항체를 사용하여 적외선 동일 블롯에 두 가지 항원을 검출하는 두 일차 및 이차 항체의 신중한 선택을 필요로한다. 두 가지 기본 항체는 다른 HOS에서 파생되어야합니다T 종. 한 차 항체는 토끼로부터 유래되는 경우 예를 들어, 다음 제 차 항체는 마우스와 같은 토끼 이외의 다른 종으로부터 유도 될 필요가있다. 마찬가지로, 적외선 이차 항체는 또한 일차 항체의 각각과 동일한 호스트 종 유래의 다른 형광체로 표지 할 필요가있다. 예를 들어, 800 nm의 채널에서의 염소 항 - 토끼 정확하게 토끼 및 마우스로부터 유도되는 두 개의 다른 일차 항체로부터 단백질 신호를 관찰하기 위하여 700nm에서 채널의 염소 항 - 마우스와 결합 될 수있다.

차 항체는 항원에 대한 품질, 선호도, 감도 상당히 다릅니다. 이 신호에서의 상당한 감소 또는 그에 정확하게 표적 단백질을 시각화에 어려움을 만드는 막에 단백질의 비특이적 결합의 증가를 초래할 수있다. 따라서, 대안 차단 등의 탈지 분유 등의 솔루션, 또는을 사용하여PBS에 용해 된 카제인은 품질이 낮은 차 항체 ^(10)와 단백질 검출을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또, 세제 농도는 항체를 세척을 얻어 피하기 위해서 세제 농도를 결정할 때 고려되어야 표적 항원과 예방에 차 항체의 결합에 영향을 미칠 수있다. 희석 차 항체에 첨가 할 때 PVDF 막 ^(10)을 사용하여 특히 SDS (0.01-0.02 %)의 낮은 농도는 배경 및 비특이적 결합을 감소시킬 수있다. 그러나 SDS는 또한 신호 강도에 심각한 감소로 이어지는 항원 - 항체 결합을 방해 할 수있다.

또한,이 프로토콜에 설명 된 새로운 수정은 기존의 웨스턴 블로 팅 기술에 현대적인 접근 방법을 예시한다. 이러한 첨단 발전은 비약적 효능, 일관성 및 서부 데이터의 감도를 개선하고 여러 표적 단백질의 정확한 정량을 허용상관없이 신호 강도의 막에 동일. 더 중요한 것은, 이러한 가치 변화도 크게 높은 질적 및 양적 데이터를 생성하는 동안 웨스턴 블롯을 수행하는 실험 시간을 줄일 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A