Самый быстрый Западная в городе: современный поворот на анализ Классический вестерн-блоттинга

Summary

Этот протокол исследует новейшие достижения в выполнении Вестерн-блот анализа. Эти новые модификации используют систему гель Bis-Tris с 35 мин электрофореза время выполнения 7 мин системы передачи сухой блоттинг и инфракрасного обнаружения флуоресцентного белка и обработки изображений, который создает высокое разрешение, качество, чувствительность и повышенную точность западных данных.

Abstract

Западные методы блот, которые изначально были созданы в конце 1970-х по-прежнему активно используются сегодня. Впрочем, это традиционный метод вестерн-блоттинга имеет несколько недостатков, которые включают низкое разрешение качества, паразитные полосы, снижение чувствительности, а также плохую целостность белка. Последние достижения резко улучшилось многочисленные аспекты стандартной западной протокола блот производить более качественные и количественные данные. Система гель Bis-Tris, альтернативой традиционной системе Лэммли, генерирует лучшее разделение и разрешение белка, поддерживает целостность белка, а также снижает электрофореза в то время, 35 мин выполнения. Кроме того, iBlot сухой блоттинг система, значительно повышает эффективность и скорость передачи белка на мембрану в 7 мин, что в отличие от традиционных методов переноса белка, которые часто более неэффективными с длительному времени передачи. В сочетании с этими инновационных модификаций, белка Detection помощью инфракрасных результаты визуализации люминесцентных высшего качества, более точным и согласованные данные по сравнению с стандартной западной промокательной техники хемилюминесценции. Эта технология может одновременно обнаруживать двух различных антигенов на той же мембране с использованием двухцветной ближней инфракрасной красители, которые визуализируются в различных флуоресцентных каналов. Кроме того, линейность и широкий динамический диапазон флуоресцентных изображений позволяет точно количественной оценки как сильных и слабых белковых полос. Таким образом, этот протокол описывает ключевые усовершенствования в классической западной блоттинга, в которых эти достижения значительно повысить качество данных в то время как значительно снижает сроки выполнения этого эксперимента.

Introduction

Методика вестерн-блоттинга была впервые разработана между 1977 и 1979, чтобы создать лучший метод для обнаружения белков с использованием антител ^1-3. Эта процедура используется электрофоретического переноса белков с мембранами ПААГ с ДСН с белков-мишеней визуализированных с помощью вторичных антител и обнаруженных с помощью авторадиографии, УФ-света, или пероксидазной реакции продукта ^3. Таким образом, эти же самые основные принципы все еще широко используются в современных западных протоколов клякс. Тем не менее, это классический вестерн-блоттинга техника действительно представляет много недостатков, таких как медленной электрофорез временем работы, с низким разрешением и искусственных белковых полос, восприимчивости к деградации белков и ограниченной чувствительности, а также низкое качество данных ^4. Таким образом, этот протокол описывает значительные успехи и улучшения в стандартной западной процедуры пятно, которое генерирует более точные количественные и качественные данные.

"> Система Laemmli для разделения широкий спектр белков с использованием SDS-PAGE является наиболее широко используемой системой гель для вестерн-блоттинга ^5. Несмотря на популярность этого вестерн-блоттинга системы, этот метод может привести к искажению группы, потери разрешения, и паразитные полосы ^4. Это может быть следствием дезаминирования и алкилирования белков в связи с высоким рН (9,5) разделительного геля, повторного окисления восстановленных дисульфидных связей из-за различной редокс-состояния геля и расщепления аспартил-пролил пептидные связи при нагревании белка в Laemmli буфера (рН 5,2) ^4,6. Система гель Bis-Tris, который работает при нейтральном рН (7,0), обеспечивает значительные преимущества над системой Lamemmli. Эта система улучшает стабильность протеина минимизирует модификации белка, поддерживает белки в их уменьшенными государств, предотвращает аспартил-пролил-расщепление во время электрофореза, и что более важно, электрофорез запустить время 35 мин ^4,6,7. Кроме того, тСистема гель он Бис-Трис также производит более четкие полосы, более высокое разрешение и разделение, и повышенную чувствительность в результате чего более надежных данных ^4.

В сочетании с системой гель Bis-Tris, iBlot сухая система блоттинга использует высокую напряженность поля и токи значительно сократить время передачи белков из гелей на мембранах в течение 7 мин ^8. Эта система передачи основан на сухой метод блоттинга, который генерирует более эффективную и надежную передачу белков ^8. Для детального сравнения эффективности системы передачи iBlot к обычным систем передачи пожалуйста, обратитесь к веб-сайте: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Он использует стек анод и катод, которые состоят из гелевой матрице, содержащей соответствующие буферы передачи, которые действуют как резервуары ионных ^8. Во время передачи, электролиз воды помогает предотвратить образование кислорода из медного анода, что приводит к более последовательного переноса белков без ущерба полосы ^8. Кроме того, эта система передачи также увеличивает скорость передачи за счет уменьшения расстояния между электродами ^8.

Хотя ХЛ является наиболее распространенным и традиционным методом для обнаружения белка Западной блоттинга, двухцветный обнаружения инфракрасного флуоресцентного значительно улучшает чувствительность, качество и точность западным данным блот. Этот метод обнаружения использует возбуждение инфракрасного лазерного в двух оптимальных длин волн, 700 нми 800 нм, для создания четкого изображения данных с наибольшей отношения сигнал-шум и высокой чувствительностью ^9. Таким образом, две целевые белки могут быть визуализированы одновременно на той же мембране с использованием 700 нм и 800 нм флуоресцентных каналов обнаружения. Что еще более важно, линейность и динамический диапазон инфракрасного флуоресценции позволяет точно количественного анализа и сильных и слабых белковых полос ^9. Кроме того, этот протокол предоставляет огромные преимущества и улучшений по сравнению с классической западной промокательной техники путем уменьшения электрофорез и время передачи этого эксперимента не ставя под угрозу эффективность этих процессов и использования обнаружения инфракрасного флуоресцентный белок для производства более качественных и количественных данных вестерн-блот.

Protocol

1. Подготовка Клеточные лизаты из клеточной культуры

1. Поместите посуду культуре клеток на льду и добавить холодную PBS с 5 мМ ЭДТА (например 5 мл PBS с 5 мМ EDTA/10 см ² пластины). Удалить прилипшие клетки из чашки с использованием клеточного скребка, а затем передать клеточной суспензии в холодный 15 мл коническую пробирку.
2. Гранул клеточные суспензии от низкоскоростного центрифугирования при 1000 оборотов в минуту (230 мкг) в течение 5 мин при 4 ° С. Наведите конические пробирки на лед и тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
3. Промыть гранулу с 1 мл PBS с 5 мМ ЭДТА и передачи клеточной суспензии к холодному 1,5 мл центрифужную пробирку. Быстрый спин подвеска при 13000 оборотов в минуту (13 226 мкг) в течение 10 сек для осаждения клеток. Осторожно снимите супернатант, не нарушая гранул и место трубки на льду.
4. Ресуспендируют гранул в 25-200 мкл (в зависимости от размера гранул, т.е. в течение 3 х 10 ⁶ клеток добавить ~ 150 мкл RIPA буфера) вRIPA буфере (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaF, 0,1% SDS, 0,5% дезоксихолат натрия, 1% NP-40), содержащий недавно добавленный протеазы и ингибиторы фосфатазы в 2 раза до конечной концентрации. Кратко вихрь каждую пробирку и инкубировать подвески в течение 20-30 мин на льду. Примечание: Есть несколько буферов лизиса которые могут быть использованы для извлечения белков, которые отличаются по их способности к солюбилизации белков и силу их денатурации моющего средства (например, SDS, Triton X-100, или NP-40). RIPA буфер пригодны для получения Клеточные лизаты и разрушая белок-белковых взаимодействий.
5. Для создания пост-ядерной фракции, центрифуг лизатов при 14000 оборотов в минуту (15 339 мкг) в течение 5 мин при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку, не нарушая осадок и место трубки ядерного обогащенный на льду. Примечание: ядерная обогащенный осадок может также отсоединить от трубы при извлечении супернатант. Чтобы избежать сбора осадка ядерной обогащенный, разместить пипетки непосредственно яНТО вязкой ядерной обогащенный гранул и рисовать его с пипетки, чтобы избавиться от него.
6. Определение концентрации протеина каждого образца в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием таких белков количественного анализа как BCA или Брэдфорда.

2. Подготовка проб и электрофорез

1. Подготовка каждого образца в соответствии со следующей таблицей, описанной ниже. В качестве альтернативы, β-меркаптоэтанол также может быть использован в конечной концентрации 2,5%. Тем не менее, восстановитель должен быть добавлен к каждому образцу до одного часа перед загрузкой в ​​гель. Общая сумма счетов громкости для вариаций пипеток только с 20 мкл каждого подготовленного образца загружалась на лунку.

   РЕАГЕНТОВ	Повышена ОБРАЗЕЦ
   Белок Образец	X мкл
   4x LDS Образец Буфер	6 мкл
   500 нМ DTT Красныйucing Агент	2.4 мкл
   Деионизированная вода	До 15,6 мкл
   Общий объем	24 мкл

2. Образцы Тепловые при 70 ° С в течение 10 мин. В то время как образцы нагрева, подготовить 1000 мл 1x МЧС или MOPS рабочем буфере (50 мл 20x МЧС или МОПС Running Buffer плюс 950 мл деионизированной воды). MOPS Running буфер решает среднего размера белки между 14-200 кДа, в то время как МЧС Running Buffer решает мелкие белки молекулярной массой от 2-200 кДа с более низким рКа, что позволяет МЧС Запуск буфер работать быстрее, чем MOPS ^4. Таким образом, эти два буфера имеют контрастные эффекты на миграции ионов внутри концентрирующий гель, что приводит к различиям в разделении белковых полос ^4. Отложите и объединить 200 мл 1x МЧС или MOPS Бег буфера с 500 мкл антиоксидант, которые будут использоваться для заполнения буферной камеры верхний из Миня-Cell электрофорез блок.
3. Как только образцы закончены отопления, быстрые образцы спин до размещения их на льду.
4. Для сборки сборных бис-трис гелей в блок Мини-Cell для электрофореза следовать инструкциям производителя. Примечание: убедитесь, что каждый гель ориентированы таким образом, что чем короче (меньше) кассета каждого геля сталкивается внутрь к буфера ядра и гели уровень и плотно прижимают к буфера Ядра, чтобы избежать утечки из буферной камеры Верхний.
5. Заполните буферной камеры Верхний с 200 мл 1x МЧС или MOPS Запуск буфер, содержащий антиоксидант и буферной камеры Нижняя блока Мини-Cell с примерно 600 мл 1x МЧС или MOPS рабочем буфере. Лишние 200-300 мл рабочего буфера могут быть сохранены для последующего использования. Тем не менее, это не рекомендуется, чтобы переработать буфера, используемого в процессе электрофореза перспективе как рН и качество буфера могут быть изменены.
6. Загрузите 20 мкл каждого белка SAMPле в каждую лунку. Если секционирования мембрану в различных полос для того, чтобы исследовать для нескольких антител (т.е. более чем в 2), то настоятельно рекомендуется загрузить 2-5 мкл в предварительно окрашенный стандарт белка в первой и последней лунки каждого геля, поскольку это будет служить резки направляющие для разделения различных секций мембраны, не влияя на съемку белковых полос.
7. Запуск гели при 200 V постоянной в течение 35 мин с ожидаемым током 110-125 мА / гель в начале и 70-80 мА на гель в конце. Электрофорез завершается, когда отслеживания краситель мигрирует к платиновой проволоки вдоль буфера Core.

3. Белок перевод по системе iBlot Dry блоттинга

1. Полностью отделить мини-гели, ломая облигационных стороны кассеты (это может привести к треск). Откажитесь от более короткий (меньше) тарелку и аккуратно поместите гель от длительного (щелевой) пластины в контейнер с деионизированной водой иудалить толстую ногой часть геля, расположенной в нижней части. Примечание: в редких случаях, гель может приложить к короткой пластины вместо более длинного, щелевые плиты. В этом случае отбросить дольше, щелевой пластины и удалить толстую ногой часть геля, расположенной в нижней части. Затем осторожно переносить гель с более короткой пластины в деионизированной воде.
2. Соберите анода и катода стеки передачи в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: как нитроцеллюлозные или PVDF мембраны обеспечивают высокое качество и эффективную передачу белков и совместимы с флуоресцентной детекции ^8. Тем не менее, PVDF мембраны имеет более высокую связывающую способность (240 мкг / см ^3), чем нитроцеллюлозы ⁸ (200 мкг / см ^3).
3. Осторожно удалите пузырьки или воздух, находящийся между гелем и мембраны, так как это предотвратит искажение белковых полос во время передачи. Примечание: не обрезать мембрану или Transfэ стек для приспособления вашего размера гель так как это вызовет прямой контакт между анодной и катодной стеков.
4. После правильного сборки передачи стеки на сухом промокательной устройства, выберите соответствующую программу напряжения (т.е. Программа 3: 20 В течение 7 минут) и начать передачу. Примечание: белки больше, чем 150 кДа, как правило, мигрируют медленнее, и может потребоваться более длительное время передачи данных 8-10 мин. Кроме того, до инкубации гель в 20% этаноле в течение 5-10 мин будет также способствовать повышению эффективности передачи этих крупных белков. После того как программа передача завершена, устройство автоматически выключается ток. Лучше всего сразу же удалить мембрану и продолжить процедуру блокировки для обеспечения лучшей обнаружение белка и избежать высыхания мембраны.

4. Инфракрасный Обнаружение флуоресцентный белок

1. Блок мембраны (ы) в минимальном количестве 0,8 мл / см ² Одиссея блокирующего буфера (не добавляйте Твин-20) в течение 1 часа илив течение ночи при 4 ° C. Мембрана (ы) также может быть заблокирован с обезжиренного сухого молока, однако это может привести к более высокий фон и мешают обнаружению белка.
2. Инкубируйте мембраны (ы) в первичных антител в желаемой концентрации в блокирующем буфере Одиссее с 0,1% Твин-20 в течение ночи при 4 ° С. Для обнаружения двухцветной, в которой два различных антигенов отображаются на тот же блот, две первичные антитела должны быть получены из различных видов хозяев и добавлены одновременно к мембране (ов). Примечание: перед инкубацией мембраны (ы) в первичных антител, мембрана (ы) можно разделить на различные части, чтобы зонд для множественных антител (т.е. более чем 2) на той же самой мембраны.
3. Промыть мембрана (ы) 3 раза в течение 10 мин в TBS плюс 0,1% Tween-20 при осторожном встряхивании.
4. Инкубируйте мембраны (ы) с флуоресцентно-меченого вторичного антитела при разведении 1:20000 для канала 700 нм и 1:6,000-1:10,000 для канала 800 нм в Odysséу блокирующего буфера с 0,1% Твин-20 в течение 30-60 мин (инкубации мембрану (ы) в течение более 1 часа может увеличить фона). Защитите мембрану (ы) от света. Примечание: вторичные антитела должны быть получены из одних и тех же видов хозяев как каждый из первичных антител и помечены с различными флуорофоров.
5. Промыть мембрана (ы) 3 раза в течение 10 мин в TBS плюс 0,1% Tween-20 при осторожном встряхивании. Защитите мембрану (ы) от света.
6. Мембрана (ы) может быть высушен или храниться в любом TBS или PBS без Tween-20 при 4 ° С, пока не отсканированы и отображаемого с Imaging System Инфракрасный. Флуоресцентного сигнала будет оставаться стабильной в течение нескольких месяцев, если надлежащим образом защищены от света.

Representative Results

Двухцветный инфракрасный флуоресцентный обнаруживает как сильные и слабые полосы на той же мембране с повышенной чувствительностью и высоким отношением сигнал-шум для получения четких вестерн-блот изображения. Типичные результаты, полученные с помощью двухцветного обнаружения вестерн-блот визуализируется как в 700 нм и 800 нм флуоресцентных каналов проиллюстрированы на фигурах 1 и 2. Самый верхний Вестерн-блот на рисунке 1 показывает одновременное (наложения) обнаружение общего ERK1 / 2 в 800 нм канала (зеленый) и β-актина в 700 нм канала (красный) двукратных серийных разведений лизатов от человека полученных клеточной линии меланомы, WM793. Кроме того, эта мембрана также разрезают на секции на основе молекулярных масс желаемой цели белка, с тем чтобы в течение более двух антител, которые будут рассмотрены на той же блот. Например, мембрана анализировали на рисунке 1, разрезали пополам для того, чтобы исследовать нижний портион мембраны с третьим антителом, общая BIM (700 нм канала красный) без выведения с обнаружением как общего ERK1 / 2 и β-актина. Первая панель на фиг.2 далее демонстрирует двухцветную вестерн-блот флуоресцентного обнаружения фосфо-ERK1 / 2 (800 нм канал-зеленый) и общий ERK1 / 2 (700 нм канала красного цвета) с перекрывающимися фосфо-ERK и общей ERK сигналы отображаются желтым цветом из WM793 меланомы клеток, обработанных в присутствии и в отсутствие MEK1 / 2 ингибитора, PD0325901 (Meki), который подавляет ERK1 / 2 МАР-киназы сигнальный путь. Кроме того, 700 нм и 800 нм флуоресцентные изображения также могут быть преобразованы в стандартных черных и белых Вестерн-блот изображений для каждого антитела (фиг. 1 и 2). В общем, большинство Вестерн-блот изображений, полученных с помощью этого протокола приведет высококачественных изображений как выставлены на фигурах 1 и 2. Однако, в зависимости от селективности, специфичностьи качество первичного антитела, менее оптимальных изображений может привести к небольшой части пятнами, проанализированных этой методологии. Например, как отмечено в двух нижних панелей фиг.2, нерегулярности качество антитела фосфо-BIM в клетках меланомы WM793, обработанных и необработанных МЕК ингибирование привело к Вестерн-блот изображения с слабых протеиновых полос и чрезвычайно высокого фона мембраны.

Одновременное инфракрасный флуоресцентный изображений из двух целей может также предоставить возможность для количественного анализа западных помарки в широком, линейного динамического диапазона за счет эффективного и точного обнаружения и сильные и слабые полосы на той же мембране. Количественное определение белковых полос рассчитаны как интегральной интенсивности, которая пропорциональна количеству флуоресцентных меченных антител на мембране и не зависит ни от размера формы, изображенной вокруг группы и разрешения. Это основано на следующих критериев: 1)формы; 2) количество пикселей, заключенных в форме; 3) средняя интенсивность пикселей выбранных в качестве фона и;. 4) суммарная интенсивность пикселей, заключенных в данной форме ¹⁰ 3А показывает белка количественную оценку Вестерн-блоты показано на рисунке 1. Количественное определение общего ERK1 / 2, β-актина, и общей BIM демонстрируют линейную зависимость между увеличением интегральной интенсивности флуоресцентного сигнала и увеличением концентрации белка (фиг. 3А). Кроме того, 3В является еще одним примером того, как в количественном уровни белка от люминесцентных западных помарки, которая показывает белка количественное фосфо-ERK1 / 2 нормированная к общему уровнях ERK1 / 2 белковых WM793 клеток меланомы, обработанных и необработанных MEK торможения от Рисунке 2 . С этой количественной, что фосфорилированные ERK1 / 2 уровня может быть рассчитана как процент от контрольных уровней. В этом оксебе, уровни фосфо-ERK клеток меланомы, обработанных MEK ингибитора были 0,6% от контроля.

Рисунок 1. Вестерн-блот-анализ с использованием двухцветной инфракрасного обнаружения флуоресцентного белка. Лизатов двукратные серийные разведения WM793 человеческого происхождения белка меланомы были разделены с помощью гель Novex NuPAGE Bis-Tris с белком, переданного на PVDF мембрану с использованием устройства передачи iBlot . Мембраны блокировали в Odyssey блокирующего буфера и зондировали с помощью следующих первичных антител: анти-кролик общий ERK1 / 2, анти-кролик общий BIM, и мышиного анти-β-актина. Комплексы антиген-антитело детектировали с использованием флуоресцентного козьих антител против кроличьего IRDye 800 (зеленый) или 680 (красный) и козьего антитела против мышиного IRDye 680 (красный) вторичные антитела, соответственно,и визуализированы с LI-COR Odyssey Классический Инфракрасный Imaging System. Первый вестерн-блоттинга панель накладка одновременного обнаружения общего ERK1 / 2 (800 нм канал-зеленый) и β-актина (700 нм канал-красный) флуоресцентных сигналов. Вторая панель является обнаружение флуоресцентный одноканальный от общего BIM на той же мембраны, который был отделен с помощью лезвия бритвы на основе молекулярных масс этих белков-мишеней. Нижние три вестерн-блот панели являются черно-белые образы, разделенных флуоресцентных изображений одноканальных.

Рисунок 2. Пример оба высокого и низкого качества Вестерн-блот изображение с помощью инфракрасного флуоресценции. WM793 клетки меланомы, обработанные либо ДМСО (CTL) или 2 мкМ ингибитора МЕК, PD0325 901 (Meki), в течение 18 часов анализировали, как описано на фигуре 1. Мембрана зондировали кроличьего анти-фосфо-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), анти-мышь общий ERK1 / 2, и мышиное анти-фосфо-BIM (Ser69) с комплексами антиген-антитело, обнаруженных с козьим анти-кроличьего IRDye 800 (зеленый) и козьего антитела против мышиного IRDye 680 (красный). Первый вестерн-блоттинга панель накладка одновременного обнаружения общего ERK1 / 2 (700 нм канал-красный) флуоресцентных сигналов как фосфо-ERK1 / 2 (800 нм канал-зеленый) и. Второе и третье панели являются черно-белые образы одноканальных флуоресцентных изображений фосфо и общей ERK1 / 2. Два нижних панелей являются люминесцентные и черно-белые изображения фосфо-BIM. Эти изображения представляют пример нерегулярности Вестерн-блоттинга, что может привести при таком способе из-за некачественной первичного антитела.

p_upload/51149/51149fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Примеры белков количественного инфракрасных флуоресцентных вестерн-блоттинга.) Количественное определение общего ERK1 / 2, β-актина, и общий уровень BIM белка была определена путем расчета интегральной интенсивности каждой полосы белка. Интегральная интенсивность пропорциональна количеству меченных флуоресцентными вторичными антителами на мембране. R-квадрат значения также были использованы для оценки линейной регрессии для каждого из антител анализировали на рисунке 1. Б) Количественная оценка фосфо-ERK1 / 2 нормированная к общему ERK1 / 2 уровня белка из рисунке 2 была рассчитана с использованием интегральной интенсивности флуоресцентный сигнал и данные представлены в виде процента от ДМСО-контролем.

Discussion

Критические шаги в создании высокого качества, количественные вестерн-блот в соответствии с этим протоколом, являются следующие: 1) измерение концентрации белка; 2) подготовка образца; 3) блокирующий мембрану и, 4) качество и калибр первичного антитела.

Точность измерения концентрации общего белка может иметь большое влияние на количественной белковых полос, так как исключительная чувствительность инфракрасного обнаружения флуоресцентного усилится любые незначительные различия, найденные в концентрации белка в образцах. Чтобы избежать неточности в определении концентрации белка, генерируя стандартную кривую с линейной регрессии или R-квадрат значение как можно ближе к 1 в качестве возможного (R ² ≥ 0,99 или выше) играет важную роль в точного расчета концентрации белка каждого образца . Например, если значение R ² падает ниже 0,99, подготовка свежих стандартов BSA сверхчистой водой и тщательно повторяябелок количественное анализ может помочь увеличить значение R ^2. Кроме того, лучше избегать использования многоканальной пипетки, так как это будет генерировать несоответствия в пипетки, которые могут способствовать снижению R ² значения и неточности в белковых концентраций образцов.

Подготовка образца играет значительную роль в определении качества белковых полос, которые также могут иметь прямое влияние на количественной оценке этих полос. При использовании системы гель Bis-Tris, настоятельно рекомендуется, чтобы образцы готовятся с LDS буфера для образца, потому что слегка щелочной рН (8,5) этого буфера обеспечивает оптимальные условия для сокращения дисульфидных связей и денатурации ^4. Этот буфер образец также содержит Coomassie G250 отслеживания краситель, который производит резкое краситель фронт, который мигрирует с движущимся ионов фронт, который помогает гарантировать, что короткие пептиды не бежать гель ^4. Что еще более важно, проба LDSБуфер минимизирует расщепление аспартил-пролил пептидных связей, когда образцы нагревали при 70 ° С в связи с рН буфера изменяющейся от 8.5-8.0 ^4. Это приводит в идеальной среде для снижения и алкилирования белков в то же время сохраняя целостность белка. Однако, если образец буфера Трис-Глицин SDS используется вместо LDS буфера выборок, это приведет к расщеплению в аспартил-пролил связей, снижение остроты белковых полос, а также увеличение фрагментации белка ^4. Уместно также добавить антиоксидант в буфер палаты Верхней части мини-Cell электрофореза устройства. Поскольку Антиоксидант может comigrate с образцами при нейтральном рН в системе гель Bis-Tris, это может помочь сохранить белки в восстановленном состоянии и защитить дисульфидные связи, а также аминокислоты, чувствительные к окислению, в то время как отсутствие антиоксидант может привести к рассеянным белковых полос ^4. Наконец, весьмарекомендуется использовать либо MES или MOPS рабочем буфере с бис-трис гелей в отличие от использования Трис-глицин SDS Запуск буфера с этими типами гелей. Сочетание Трис-глицин SDS Запуск буфера и Bis-Tris гели результаты в медленной миграции ионов глицина вызывая резкое увеличение электрофореза запустить времени с полосы появляются все более сжатой и чашеобразным ^4.

Блокирующий шаг также имеет решающее значение для получения качественного вестерн-блот изображения с помощью флуоресцентной детекции как многие из различных блокаторов может генерировать высокий фон мембраны. Для инфракрасного обнаружения флуоресцентного, то лучше использовать Одиссея блокирующего буфера, потому что этот конкретный блокирующий агент повышает чувствительность обнаружения белка при сохранении низкого фона. Хотя обезжиренное сухое молоко, казеин, или BSA также может быть использован в качестве альтернативного блокирующих агентов, эти типы решений может привести к более высокий фон мембраны и в некоторых случаях уменьшение биндинг сродство первичным антителом ^10. Кроме того, на основе молока блокаторы могут содержать IgG, которые могут перекрестно реагируют с фосфо-эпитопов и анти-козьих антител, которые могли бы повлиять на точность обнаружения белка и надлежащего связывания антитела ^9,11. Однако, если Вестерн-блот изображение страдает от высокого фона, неспецифических полос, или слабой / нет сигнала, то используя один из этих альтернативных блокирующих агентов может помочь улучшить качество изображения. Кроме того, он также рекомендовал, чтобы избежать добавления моющего средства в шаге блокирующего и длинных блокирующих инкубации, так как это может привести к увеличению фона и / или потери белка-мишени от мембраны ^9,12.

Одновременно обнаружения двух различных антигенов на одном блот с использованием инфракрасных антител, меченных с 700 нм и 800 нм канала красителя требуется осторожный выбор и первичных и вторичных антител. Две первичные антитела должны быть получены из различных HOSт видов. Например, если один первичное антитело получают из кролика, то второе первичное антитело должно быть получено из различных видов, отличных от кролика, таких как мыши. Аналогичным образом, инфракрасные вторичные антитела также должны быть получены из того же самого вида, как принимающих каждой из первичных антител и помечены с различными флуорофоров. Например, козы против кролика в 800 нм канала могут быть объединены с козьим анти-мыши в 700 нм канала, чтобы точно обнаружить сигнал белка из двух различных первичных антител, которые получены из кролика и мыши.

Первичные антитела значительно различаются по качеству, близость, и чувствительности для их антигена. Это может привести к значительному снижению сигнала или увеличение неспецифического связывания белков на мембрану, тем самым создавая трудности в точно визуализации белка-мишени. Таким образом, используя альтернативное решение блокирование, например, обезжиренного сухого молока иликазеин растворяют в PBS, может помочь улучшить обнаружение белка с некачественных первичных антител ^10. Кроме того, концентрация моющего средства также может влиять на связывание первого антитела с антигеном-мишенью и предосторожности следует учитывать при определении концентрации моющего средства, чтобы избежать вымывание антитело. Низкая концентрация SDS (0,01-0,02%) может уменьшить фон и неспецифического связывания при добавлении к разбавленной вторичного антитела, особенно при использовании PVDF мембрану ^10. Однако SDS может также нарушить антиген-антитело связывания что привело к серьезному снижению уровня сигнала.

Кроме того, новые модификации, описанные в данном протоколе примером современного подхода к традиционной западной промокательной техники. Эти передовые достижения резко повысить эффективность, последовательность и чувствительность западных данных и позволяет для точного количественного определения нескольких белков-мишенейна той же мембране, независимо от их уровня сигнала. Что еще более важно, эти ценные изменения также значительно уменьшить экспериментальную время выполнения Вестерн-блот при производстве высоких качественных и количественных данных.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A