町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

Summary

このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。

Abstract

もともと1970年代後半に設立されたウエスタンブロット法はまだ積極的に、今日利用されている。しかし、ウエスタンブロッティングのこの伝統的な方法は、低品質の解像度、スプリアスバンド、感度が低下し、貧困層のタンパク質の完全性を含むいくつかの欠点がある。最近の進歩は、劇的に高い定性的および定量的データを生成するために標準的なウェスタンブロットプロトコルの多くの側面を改善している。ビス - トリスゲルシステム、従来のLaemmliシステムに代わるものは、良好なタンパク質の分離及び解像度を生成し、タンパク質の完全性を維持し、35分の実行時間電気泳動を低減する。また、iBlotドライブロッティングシステムは、飛躍的に多くの場合、長い転送時間でより多くの非効率的であり、従来のタンパク質導入の方法とは対照的である7分、内膜へのタンパク質導入の有効性と速度を向上させます。これらの非常に革新的な改良、タンパク質Dと組み合わせて、化学発光の標準的なウェスタンブロッティング技術と比較して、より高品質、より正確で一貫性のあるデータにおける赤外蛍光イメージング結果を用いてetection。この技術は、同時に異なる蛍光チャネルで可視化された二色近赤外色素を利用して同じ膜上の2つの異なる抗原を検出することができる。さらに、蛍光イメージングの直線性と広いダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンドの正確な定量が可能になります。したがって、このプロトコルは、大きく、この実験の実行時間を低減しつつ、これらの進歩は著しく、データの質を向上する古典的なウェスタンブロッティング法、カギ改良を記載している。

Introduction

ウエスタンブロッティングの技術は最初の抗体^1-3を使用してタンパク質を検出するためのより良い方法を作成するために、1977年と1979年の間に開発されました。この手順では、二次抗体を用いて可視化し、オートラジオグラフィー、UV光、又はペルオキシダーゼ反応生成物³により検出された標的タンパク質とSDS-PAGEゲルからメンブレンへのタンパク質の電気泳動転写を利用した。したがって、これらの同じ基本原理が依然として広く、今日のウエスタンブロットプロトコルで使用される。しかし、この古典的なウェスタンブロッティング技術は、低速の電気泳動の実行時 ​​間、低い解像度と人工タンパク質バンド、タンパク質分解に対する感受性、および限定された感度だけでなく、データ品質⁴として存在する多くの欠点を行います。したがって、このプロトコルは、より正確な定性および定量的データを生成し、標準的なウェスタンブロット手順に大きな進歩と改善について説明します。

"> SDS-PAGEを用いてタンパク質の広い範囲を分離するためのLaemmliシステムがこのウェスタンブロッティングシステムの人気にもかかわらず。ウェスタンブロッティング⁵に最も広く使用されているゲルシステムであり、この方法は、バンド歪み、解像度の損失、およびもたらし得るこれは、分離ゲルの高pH（9.5）に起因するタンパク質の脱アミノ化およびアルキル化の結果、ゲルの様々な酸化還元状態による減少ジスルフィド結合の再酸化、およびアスパ-プロリルの切断であるスプリアスバンド^4。 Laemmli緩衝液（pH ^5.2）、4,6タンパク質を加熱することによるペプチド結合、中性pH（7.0）で動作Lamemmliシステムよりも有意な利点を提供するのBis-Trisゲルシステム、このシステムは、タンパク質安定性、最小限を改善するタンパク質修飾は、その縮小状態でタンパク質を維持する電気泳動中アスパルチル-プロリル切断を防止し、より重要なことに、電気泳動実行時 ​​間tは、さらに35分間^4,6,7ある彼のBis-Trisゲルシステムはまた、シャープなバンドは、高解像度化、分離、およびより信頼性の高いデータが得られる増大した感度を生成する^4。

ビス-Trisゲルシステムと共に、iBlotドライブロッティングシステムは、著しく7分^以内膜上にゲルからのタンパク質の転送時間を減らすために高い電界強度および電流を使用する。この搬送システムは、タンパク質⁸のより効率的で信頼性の高い転写を生成するドライブロッティング法に基づいている。従来の転写システムにiBlot転送システムの有効性の詳細な比較については、次のWebサイトを参照してください。 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .これは、イオンリザーバ⁸として作用する適切な転写緩衝液を含有するゲルマトリックスから構成され、アノードとカソードのスタックを利用する。転送中に、水の電気分解は、バンド⁸歪み^を引き起こすことなく、より一貫性のタンパク質転写を生じる銅アノードからの酸素の発生を防止するのに役立つ。また、この転写システムはまた、電極⁸間の距離を減少させることによって転送速度を増加させる。

化学発光ウェスタンブロットのタンパク質検出のための最も一般的かつ伝統的な技法であるが解析し、二色赤外蛍光検出感度が大きく、品質、およびウェスタンブロットデータの精度を向上させることができる。この検出方法は、2つの最適な波長700nmの赤外線レーザー励起を使用しておよび800 nmの最大の信号対雑音比及び最高感度⁹鮮明な画像データを生成する。従って、2つの標的タンパク質は700 nmおよび800 nmの蛍光検出チャネルを使用して、同じ膜上で同時に可視化することができる。より重要なことには、赤外蛍光の線形性およびダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンド⁹の正確な定量分析を可能にする。さらに、このプロトコルは、これらのプロセスの有効性を損なう、より大きな定性的および定量的ウェスタンブロットデータを生成するために赤外蛍光タンパク質検出を利用せずにこの実験の電気泳動および転写回数を減少させることによって、古典的なウェスタンブロッティング技術を超える多大な利点および改善を提供する。

Protocol

1。細胞培養からの全細胞溶解物の調製

1. 氷上で細胞培養皿を置き、5mMのEDTA（5 mMのEDTA/10 CM ²プレートとのPBS 例えば 5ml）で冷PBSを追加します。セルスクレーパーを用いて皿から接着細胞を除去した後、冷たい15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。
2. 4℃で5分間1,000 rpmで（230×g）で低速遠心分離により細胞懸濁液をペレット氷の上に円錐形のチューブをセットし、慎重にペレットを中断することなく、上清を吸引除去する。
3. 5mMのEDTAを含むPBS 1mlでペレットを洗浄し、冷たい1.5ミリリットル遠心チューブに細胞懸濁液を移す。細胞をペレットに10秒間、13,000 rpmで（13226×g）でクイックスピンサスペンション。慎重に氷上でペレットと場所のチューブを中断せずに上清を除去します。
4. で、（ つまり、3×10 ^6個の細胞のためのRIPA緩衝液の〜150μLを加えペレットサイズに応じて）25〜200μL中でペレットを再懸濁RIPA緩衝液（50mMトリス、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA、10mMのNaFを、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1％NP-40）2×最終濃度で新たに追加されたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む。簡単に言えば、各チューブをボルテックスし、氷上で20〜30分のために停止をインキュベートする。注：タンパク質およびそれらの変性界面活性剤（ すなわち、SDS、トリトンX-100、またはNP-40）の強度を可溶化する能力が異なるタンパク質を抽出するために使用できるいくつかの溶解緩衝液が存在する。 RIPA緩衝液は、全細胞溶解物を調製し、タンパク質 - タンパク質相互作用を破壊するために有用である。
5. 4℃で5分間14,000 rpmで（15339×g）で、ポスト核分画、遠心溶解物を作成するには氷の上で核濃縮ペレットと場所のチューブを中断することなく、新しいチューブに上清を移します。注：上清を抽出しながら、核濃縮ペレットを、チューブから切り離すことがあります。核に富んだペレットを集めないようにするには、私が直接ピペットチップを配置粘性の核に富んだペレットNTO、それを処分するために、ピペットでそれを描画します。
6. BCA又はブラッドフォードなどのタンパク質定量アッセイを使用して製造業者の指示に従って、各サンプルのタンパク質濃度を決定する。

2。サンプルの調製および電気泳動

1. 以下に概略次の表に従って各サンプルを準備します。代替として、β-メルカプトエタノールはまた、2.5％の最終濃度で使用することができる。しかし、還元剤は、ゲルをロードする前に、各サンプル時間までに添加されるべきである。ウェルあたりロードされた各調製した試料のわずか20μlのピペット操作のバリエーションの合計容量を占めています。

   試薬	減少したサンプル
   タンパク質試料	XμL
   4X LDSサンプルバッファー	6μL
   500 nMのDTTレッドucingエージェント	2.4μL
   脱イオン水	最大15.6μL
   全容積	24μL

2. 10分間、70°Cでの加熱試料。サンプルが加熱している間、（50ミリリットルの20倍のMESまたはMOPSランニングバッファーを加えた950ミリリットルの脱イオン水）をランニングバッファー1X MESまたはMOPSの千ミリリットルを用意。 MESがバッファを実行すると、ランニングバッファーMESが速くMOPS ⁴よりも実行することができます低いpKaを持つ2〜200 kDaの間のより小さな分子量のタンパク質を解決するのに対し、MOPSランニングバッファーは、14から200 kDaの間の中間サイズのタンパク質を解決します。従って、これら2つのバッファがタンパク質バンド⁴の分離の違いにつながるスタッキングゲル内のイオンの移動に影響を対比している。取っておくと酸化防止剤の500μlのランニングバッファー1X MESまたはMOPSの200ミリリットルを組み合わせ、最小の上部バッファー商工を埋めるために使用されるI細胞電気泳動装置。
3. サンプルは、氷の上にそれらを配置する前に加熱、クイックスピンサンプルを完了したら。
4. 電気泳動用ミニ電池ユニットへのプレキャストBis-Trisゲルの組み立てについては、製造元の指示に従ってください。注：各ゲルは各ゲルの短い（小さい）カセットをバッファコアに向かって内側に面しており、ゲルはレベルであり、しっかりと上部バッファーチャンバーからの漏れを回避するためのバッファコアに押し付けるようなやり方で配向されていることを確認してください。
5. 1X MESや抗酸化剤および1X MESまたはMOPSランニングバッファーを約600ミリリットルとミニセルユニットの下部バッファ商工を含むMOPSランニングバッファー200mlで上部バッファーチャンバーを埋める。ランニング緩衝液の余分200〜300ミリリットル、後で使用するために保存することができる。しかし、緩衝液のpHと品質が変更することができるように、電気泳動の実行中に使用されるバッファを再利用することは推奨されません。
6. ロード各タンパク質SAMP20μlのルの各ウェルに。複数の抗体（ すなわち 2つ以上）を探るために、種々のストリップに膜を区画した場合、それは非常にこれはとなるように各ゲルの最初と最後のウェル中予備染色タンパク質標準の2-5μLをロードすることをお勧めしますタンパク質バンドの画像化に影響を与えることなく、膜の異なる部分を分離するための切断ガイド。
7. 最後にスタートし、ゲルあたり70〜80ミリアンペアで110〜125ミリアンペア/ゲルの期待される電流で35分間200 V一定にゲルを実行します。追跡用色素がバッファコアに沿って白金線に移行するときに電気泳動が完了します。

3。 iBlotドライブロッティングシステムを用いたタンパク質導入

1. 完全に（これはパチパチノイズが発生する場合があります）、カセットの結合した側面を破ってミニゲルを分離する。短い（小さい）プレートを捨て、慎重に脱イオン水で容器に長い（マイナス）プレートからゲルを転送し、底部にあるゲルの厚い足の部分を削除します。注：まれに、ゲルは長い短いプレートの代わりに取り付けることができる、プレートスロット付き。この場合は、より長い、溝付きプレートを破棄し、一番下にあり、ゲルの厚い足の部分を削除します。その後、慎重に脱イオン水に短いプレートからゲルを移す。
2. 製造業者の指示に従って、アノードとカソード転写スタックを組み立てる。注：両方のニトロセルロースまたはPVDF膜は、タンパク質の高品質かつ効率的な転送を提供し、蛍光検出⁸と互換性があります。しかし、PVDF膜は、ニトロセルロースよりも高い結合容量（240μgの/ cm ^3）と （200μgの個/ cm ^3）8を持っています。
3. 慎重にこれを転送中にタンパク質バンドの歪みを防ぐことができますようにゲルと膜の間に閉じ込められた気泡や空気を除去。注：膜または変圧トリムしない小胞体これは、アノードとカソードのスタックとの間の直接的な接触を引き起こすとしてゲルサイズに合わせてスタック。
4. 正しく転送を組み立てた後、ドライブロッティング装置上にスタック、適切な電圧プログラムを選択します（ つまり、プログラム3：7分20 V）を、転送を開始します。注意：150 kDaのより大きいタンパク質は、よりゆっくりと移動する傾向があり、8月10日分の長い転送時間が必要な場合があります。また、5〜10分間、20％エタノール中のゲルのインキュベーション前は、これらの大きなタンパク質の転写効率を向上させることができます。転送プログラムが完了すると、デバイスは自動的に電流を遮断します。それはすぐに膜を除去し、より良いタンパク質の検出を確実にし、膜を乾燥を避けるためにブロック化手順を続行することをお勧めします。

4。赤外蛍光タンパク質検出

1. 1時間ブロッキングバッファーオデッセイ（トゥイーン20を追加しないでください）の0.8ミリリットル/ cm ²の最小のブロック膜（S）または4℃で一晩膜（単数または複数）はまた、しかし、これはより高いバックグラウンドを生じ、タンパク質の検出を妨害し得る、無脂肪乾燥ミルクでブロックすることができる。
2. 4℃で一晩、0.1％Tween-20をOdysseyブロッキング緩衝液中の所望の濃度で一次抗体にメンブレン（複数可）をインキュベート二つの異なる抗原が同じブロット上で可視化した二色検出のための二次抗体は、異なる宿主種に由来しなければならず、膜（単数または複数）に同時に添加した。注：前の一次抗体で膜（複数可）をインキュベートし、膜（s）は同じ膜上に複数の抗体（ すなわち 2つ以上）のためにプローブするために、種々の小片に区分され得る。
3. 穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。
4. Odysse 800 nmのチャネルのために700 nmのチャネルのために1:20,000の希釈で蛍光標識した二次抗体を用いた膜（複数可）をインキュベートし、1:6,000-1:10,000yが（より長い1時間膜（複数可）をインキュベートすると、バックグラウンドを増加させることができる）、30〜60分間、0.1％Tween-20でブロッキングバッファー。光から膜（複数可）を保護します。注：二次抗体が一次抗体のそれぞれと同じ宿主種に由来し、異なる蛍光体で標識される必要がある。
5. 穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。光から膜（複数可）を保護します。
6. スキャンされ、赤外線イメージングシステムで画像化されるまで、膜（単数または複数）Tween-20で4℃にてずに乾燥又はTBSまたはPBSのいずれかに格納されてもよい。適切に遮光している場合、蛍光シグナルは、数ヶ月間安定したままになります。

Representative Results

二色赤外蛍光感度が向上し、鮮明ウェスタンブロット画像を生成するために最高の信号対雑音比と同じ膜上に強弱両方のバンドを検出する。 700 nmおよび800 nmの蛍光チャンネルの両方において可視化二色ウェスタンブロット検出によって生成された典型的な結果を図1および図2に例示されている。 図1の最上段のウェスタンブロットは、ヒト由来の溶解物の二倍連続希釈液の700 nmのチャネル（赤）で800 nmのチャネル（緑）およびβ-アクチンの総ERK1 / 2の同時（オーバーレイ）検出を示すメラノーマ細胞株、WM793を由来。さらに、この膜は、同じブロット上で検査される二つ以上の抗体を可能にするために、所望のタンパク質標的の分子量に基づいて、セクションに切断されている。例えば、 図1で分析膜は、下部ポートをプローブするために、半分に切断した総ERK1 / 2およびβ-アクチンの両方の検出を推論することなく、第三の抗体は、総BIM（700 nmのチャネル赤）と膜のイオン。 図2の最初のパネルは、さらにリン酸化ERK1 / 2の2色ウェスタンブロット蛍光検出を示す（800 nmのチャネル緑）、総ERK1 / 2（700 nmのチャネル赤）リン酸-ERKおよび総ERKシグナルが重複するERK1 / 2 MAPキナーゼシグナル伝達経路を抑制するMEK1 / 2阻害剤、PD0325901（めき）の存在下および非存在下で処理されたWM793黒色腫細胞の黄色で表示。また、700 nmおよび800 nmの蛍光画像は、各抗体についての標準的な黒と白のウェスタンブロットの画像（ 図1および2）に変換することができる。 図1及び図2に示したように、一般的に、このプロトコルによって生成されるウェスタンブロットの画像の大部分は、高品質の画像をもたらすであろう。しかしながら、選択性、特異性に応じて、そして、最適な画像より少ない一次抗体の品質は、この方法論によって分析ブロットの小部分をもたらすことができる。たとえば、 図2の下部2のパネルで観察されたように、とし、MEK阻害することなく、治療WM793メラノーマ細胞におけるリン酸化のBIM抗体の基準以下の品質はかすかなタンパク質バンドと非常に高い膜の背景を用いたウエスタンブロット像をもたらした。

二つの標的の同時赤外蛍光イメージングは​​また、効率的かつ正確に同じ膜上に強弱両方のバンドを検出することにより、広い、リニアダイナミックレンジにわたってウェスタンブロットの定量分析のための機会を提供することができる。タンパク質バンドの定量化は、膜上の蛍光標識抗体の量に比例し、バンド、解像度の周囲に描かれた形状の両方の大きさとは無関係である積分強度として計算される。これは、以下の基準に基づいています：1）である形状、形状で囲まれた画素の2）数、背景として選択された画素の3）平均強度;。4）指定された形状¹⁰で囲まれた画素の全強度を図3（a）は、タンパク質の定量化を示すウェスタンブロットは、 図1に示された。総ERK1 / 2、β-アクチン、および総BIMを示す蛍光シグナルの積分強度の増加、タンパク質濃度の増加（ 図3A）との間の線形関係の定量化。また、 図3Bは、図2からMEK阻害にしなくても処理されたWM793メラノーマ細胞の全ERK1 / 2タンパク質レベルに対して正規化ホスホ-ERK1 / 2のタンパク質定量を示す、蛍光ウェスタンブロットからのタンパク質レベルを定量する方法の別の例で。この定量から、リン酸化ERK1 / 2のレベルは対照レベルの百分率として計算することができる。このカリフォルニア州それ自体、MEK阻害剤で処理したメラノーマ細胞のホスホ-ERKレベルは、対照の0.6％であった。

図1二色赤外蛍光タンパク質検出 WM793ヒト由来黒色腫タンパク質の2倍連続希釈物。溶解物を用いたウェスタンブロット分析を iBlot転写装置を用いてPVDF膜に転写タンパク質とのNuPAGE Novex社のBis-Trisゲルを用いて分離した。膜は、Odysseyブロッキング緩衝液でブロックし、以下の一次抗体でプローブした：ウサギ抗総ERK1 / 2、ウサギ抗合計BIM、およびマウス抗β-アクチン。抗原 - 抗体複合体を蛍光ヤギ抗ウサギのIRDye 800（緑）または680（赤）およびヤギ抗マウスのIRDye 680（それぞれ赤）二次抗体を用いて検出したおよびLI-CORオデッセイクラシック赤外線イメージングシステムを用いて可視化。最初のウエスタンブロットパネルは、総ERK1 / 2（800 nmのチャネル緑）およびβ-アクチン（700 nmのチャネル赤）の蛍光シグナルの同時検出のオーバーレイである。第二のパネルは、これらの標的タンパク質の分子量に基づいて、カミソリの刃を用いて分離された同じ膜上の総BIMの単一チャネル蛍光検出である。下位3ウェスタンブロットのパネルを分離し、単一チャネル蛍光画像の黒と白の画像である。

図2。赤外蛍光を用いた高および低品質ウエスタンブロット画像の両方の例をDMSO（CTL）またはMEK阻害剤の2μM、PD0325のいずれかで処理したWM793メラノーマ細胞 図1に記載したように901（めき）は、18時間で分析した。膜をウサギ抗ホスホ-ERK1 / 2 - ホスホ-p44/p42（Thr202/Tyr204）でプローブした、マウス抗総ERK1 / 2、およびヤギ抗ウサギのIRDye 800で検出された抗原 - 抗体複合体を有するマウス抗 - ホスホ-BIM（Ser69） （緑色）およびヤギ抗マウスのIRDye 680（赤）。最初のウエスタンブロットパネルはリン酸化ERK1 / 2（800 nmのチャネル緑）、総ERK1 / 2（700 nmのチャネル赤）の蛍光シグナルの両方の同時検出のオーバーレイである。第二及び第三のパネルは、ホスホおよび総ERK1 / 2のシングルチャンネル蛍光画像の黒と白の画像である。下の2つのパネルがリン酸化BIMの蛍光と黒と白のイメージです。これらの画像は、一次抗体の標準以下の品質のために、この方法で可能性が基準以下のウェスタンブロットの一例を表している。

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図3赤外蛍光ウェスタンブロットのタンパク質定量の例総 ERK1 / 2のA）の定量、β-アクチン、および総BIMタンパク質レベルは、それぞれのタンパク質バンドの積分強度を計算することによって決定した。積分強度は、膜上の蛍光標識二次抗体の量に比例する。 図2からの総ERK1 / 2タンパク質レベルに対して正規化ホスホ-ERK1 / 2のR二乗値は、 図1にも分析された抗体の各々についての線形回帰を評価した。B）定量化の積分強度を用いて計算した蛍光シグナル及びデータをDMSO対照のパーセントとして提示される。

Discussion

このプロトコルによれば、高品質の定量的なウエスタンブロットを生成する際の重要なステップは以下の通りである：1）タンパク質濃度を測定するステップと、2）試料調製、3）膜をブロッキングし、4）一次抗体の品質および口径。

総タンパク質濃度の測定精度は、赤外蛍光検出の感度は例外的なサンプルのタンパク質濃度で検出されたわずかな違いを増幅するので、タンパク質のバンドを定量化に大きな影響を有することができる。できるだけ1に近い線形回帰線又はR二乗値と標準曲線を生成し、タンパク質濃度を決定する不一致を回避するために（R ^2≥150以上）を各試料のタンパク質濃度の正確な計算に重要である。例えば、R ²値は、超純水で新鮮なBSA標準を調製し、慎重に繰り返し、150を下回った場合タンパク質定量アッセイは、R ^2の値を増加させるのに役立ち得る。これはサンプルのタンパク質濃度の減少^の R ²の値と不正確に寄与することができるペッティングに不整合が発生しますように、それはマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用しないようにも最適です。

サンプル調製は、直接、これらのバンドの定量化に影響を有することができる、タンパク質バンドの品質を決定する上で重要な役割を果たしている。ビス-トリスゲルシステムを使用している場合、それは非常にこのバッファの弱アルカリ性のpH（8.5）は、ジスルフィド結合および変性⁴の低減のための最適な条件を提供するため、サンプルがLDSサンプルバッファーを用いて調製されることをお勧めします。このサンプル·バッファも小さなペプチドがゲル^4をオフに実行しないことを保証するのに役立つ移動イオンフロント、で移動鋭い色素の先端を生成クマシーG250トラッキング色素が含まれています。さらに重要なことは、LDSサンプルバッファは、サンプルが原因8.5-8.0 ⁴から変更する緩衝液のpHを70℃に加熱されたアスパ-プロリルペプチド結合の切断を最小限に抑えることができます。また、タンパク質の完全性を維持しながら、タンパク質の還元およびアルキル化のための理想的な環境をもたらす。トリス-グリシンSDSサンプル緩衝液の代わりLDSサンプルバッファー使用される場合は、これはアスパルチル-プロリル結合の開裂、タンパク質バンドの鮮鋭度の低下、および増加タンパク質断片化⁴につながる。これは、ミニ細胞の電気泳動装置の上部バッファーチャンバーに酸化防止剤を添加することも適切である。酸化防止剤は、ビス-Trisゲルシステムにおいて、中性pHで試料と一緒に移動することができるので、これは還元状態でタンパク質を維持するのに役立つと酸化に対するジスルフィド結合、ならびに敏感なアミノ酸を保護し、酸化防止剤の不在ができ、一方ことができ拡散タンパク質バンド⁴につながる。最後に、高度にあるMESまたはゲルのこれらのタイプのランニングバッファー、トリス - グリシンSDSを使用するのではなく、Bis-TrisゲルでMOPSランニングバッファーのいずれかを使用することをお勧めします。トリス-グリシンSDSの組み合わせは、より圧縮され、カップ状に現れるバンドと⁴電気泳動の実行時 ​​間の劇的な増加を引き起こすグリシンイオンの遅い移動にバッファおよびBis-Trisゲルの結果を実行する。

ブロッキング工程はまた、種々のブロッキング剤の多くは、高い膜背景を生成することができる蛍光検出を用いた高品質なウェスタンブロット画像を生成するために重要である。赤外蛍光検出のためには、低いバックグラウンドを維持しながら、この具体的なブロッキング剤は、タンパク質検出の感度を高めるため、オデッセイブロッキング緩衝液を使用するのが最善である。脱脂粉乳、カゼイン、又はBSAは、代替ブロッキング剤として使用することができるが、この種のソリューションは、より高い膜の背景とビンディである場合には低下を引き起こす可能性が一次抗体¹⁰ ngの親和性。また、ミルクベース遮断薬は^9,11を結合タンパク質の検出および適切な抗体の精度に干渉する可能性がある、ホスホ-エピトープおよび抗ヤギ抗体と交差反応することができるのIgGを含有してもよい。ウェスタンブロット画像は、高いバックグラウンド、非特異的バンド、または弱い/無信号に悩まされている場合は、これらの代替的なブロッキング剤のいずれかを利用して画像の品質を改善するのに役立ち得る。また、それはまた、これは、バックグラウンドの増加および/ ​​または膜^9,12から標的タンパク質の損失につながる可能性があるブロッキング工程と長いブロッキングインキュベーションに洗剤を追加しないことをお勧めします。

同時に700 nmおよび800 nmのチャネル色素で標識された赤外線の抗体を用いて同じブロット上の二つの異なる抗原を検出する一次および二次抗体の慎重な選択が必要です。 2一次抗体は、さまざまなHOSから派生している必要がありT種。の一次抗体は、ウサギに由来する場合、例えば、第2の一次抗体は、マウスのようなウサギ以外の異なる種に由来する必要がある。同様に、赤外線二次抗体は、一次抗体のそれぞれと同じ宿主種に由来し、異なる蛍光体で標識される必要がある。例えば、800nm​​のチャネルにおけるヤギ抗ウサギを正確にウサギおよびマウスに由来する二つの異なる一次抗体のタンパク質シグナルを観察するために700nmのチャネルにおいてヤギ抗マウスと組み合わせることができる。

一次抗体は、その抗原に対するその品質、親和性、および感度がかなり異なる。これは、信号の有意な減少、またはそれによって正確に標的タンパク質を可視化が困難で作成膜へのタンパク質の非特異的結合の増加をもたらすことができる。したがって、このような脱脂粉乳として、ブロッキング溶液の代替を使用するか、PBSに溶解したカゼインは、低品質の一次抗体¹⁰とのタンパク質の検出を改善するのに役立ち得る。また、界面活性剤の濃度はまた、抗体を洗浄離れる回避するために界面活性剤の濃度を決定する際に考慮すべき標的抗原と予防に対する一次抗体の結合に影響を与えることができる。希釈した二次抗体に添加したときにSDS（0.01から0.02パーセント）の低濃度は、PVDFメンブレン^10を使用する場合は特に、バックグラウンドおよび非特異的結合を低減することができる。しかし、SDSは、信号強度の深刻な低下を招く抗原 - 抗体結合を妨害することができます。

さらに、このプロトコルに記載された新規の変更は、伝統的なウェスタンブロッティング技術と現代的​​なアプローチを例示している。これらの最先端の進歩は劇的に有効性、一貫性、およびウエスタンデータの機密性を向上させ、複数の標的タンパク質の正確な定量が可能に関係なく、信号強度の同じ膜上で。さらに重要なことは、これらの貴重な変化も大幅に高い定性的および定量的データを生成しながらウエスタンブロットを行う実験時間を減少させる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A