Summary
Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.
Abstract
Aslında 1970'lerin sonlarında kurulan Western Blot teknikleri hala aktif olarak bugün kullanılmaktadır. Ancak, Batılı beneklenmesinin bu geleneksel yöntem, düşük kaliteli çözünürlük, sahte bantları, duyarlılık azalması ve zayıf protein bütünlüğü dahil birçok sakıncaları vardır. Yeni gelişmeler büyük ölçüde yüksek nitel ve nicel veri üretmek için standart Batı benek protokolü birçok yönlerini düzeldi. Bis-Tris jel sistemi, geleneksel Laemli sistemine alternatif, daha iyi protein ayırma ve çözünürlük üretir protein bütünlüğünü korur ve bir 35 dk çalışma süresi elektroforezini azaltır. Ayrıca, iBlot kuru blot sistemi, büyük ölçüde sık sık uzun transfer süreleri daha verimsiz olan geleneksel protein transfer yöntemleri aksine, 7 dakika içinde zara transfer protein etkinliğini ve hızını artırır. Bu çok yenilikçi değişiklikler, protein D ile birlikteetection, yüksek kalitede kızıl ötesi floresan görüntüleme sonuçları kullanılarak daha hassas ve kemiluminesans standart Western blot tekniği ile karşılaştırıldığında veriler tutarlı. Bu teknoloji, aynı anda farklı flüoresan kanallar olarak görüntülenen iki renkli yakın kızıl ötesi boyalar kullanarak, aynı zar üzerinde iki farklı antijenlerini tespit edebilir. Ayrıca, flüoresan görüntüleme doğrusallık ve geniş dinamik aralık güçlü ve zayıf hem de protein bantlarının hassas ölçümü sağlar. Böylece, bu protokol, büyük ölçüde bu denemenin performans zaman azaltırken, bu gelişmelerin önemli verilerin kalitesini arttıran klasik Western lekeleme yöntemi için anahtar geliştirmeleri açıklar.
Introduction
Western blot tekniği kullanılarak ilk antikorlar 1-3 proteinlerinin bulgulanması için daha iyi bir yöntem yaratmak için 1977 ve 1979 yılları arasında geliştirilmiştir. Bu prosedür, ikincil antikorlar kullanılarak görselleştirildi ve otoradyografi, UV ışığı veya bir peroksidaz reaksiyon ürünü 3 tarafından tespit hedef proteinler SDS-PAGE jelleri zarlara proteinlerinin elektroforetik transferi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu aynı temel prensipler hala yaygın olarak bugünün Batı benek protokolleri kullanılır. Ancak, bu klasik Western lekeleme tekniği böyle yavaş elektroforez çalışma süreleri, düşük çözünürlükte ve yapay protein bantları, protein yıkımı yatkınlık, ve sınırlı duyarlılık yanı sıra zayıf veri kalitesi 4 olarak mevcut birçok dezavantajları yapar. Bu nedenle bu protokol daha doğru nitel ve nicel veriler üretir standart Batı benek prosedüre önemli ilerlemeler ve geliştirmeleri açıklar.
"> SDS-PAGE kullanılarak proteinlerin geniş bir ayrılması için Laemmli sistemi bu Western blotting sistemin popülerlik rağmen. Western blot 5 için en çok kullanılan jel sistemi olup, bu yöntem, bant bozulma, çözünürlük kaybı ve neden olabilir sahte bantları 4. bu ayırma jel, indirgenmiş disülfid jelin farklı redoks durumuna bağlı bağlar, ve aspartil-prolil bölgesinin parçalanmasının reoksidasyon yüksek pH (9.5) nedeniyle proteinlerin deaminasyon ve alkilasyon bir sonucu olabilir, Laemmli tampon maddesi (pH 5.2) 4,6 proteini ısıtılması nedeniyle peptid bağlar., nötr pH değerinde (7.0) ile çalışır Lamemmli sistemi üzerinde önemli avantajlar sağlar Bis-Tris jel sistemi. Bu sistem, protein stabilitesi, en aza artırır protein modifikasyonları, bunların düşük eyalette proteinleri muhafaza elektroforez sırasında aspartil-prolil bölünmesini önler ve daha da önemlisi, elektroforez çalışma süresi t, ek olarak. 35 dk 4,6,7 olduğuO Bis-Tris jel sistemi de daha güvenilir veri 4 sonuçlanan keskin bantlar, yüksek çözünürlük ve ayırma, ve artan duyarlılığı üretir.Bis-Tris jel sistemi ile bağlantılı olarak, iBlot kuru blot sistemi önemli ölçüde, 7 dakika içinde 8 zarının üzerine jellerinden proteinlerin devir süresini azaltmak için yüksek bir alan kuvveti ve akımlarını kullanır. Bu transfer sistemi proteinleri, 8, daha verimli ve güvenilir transferi oluşturur kuru lekeleme yöntem dayanmaktadır. : Konvansiyonel aktarım sistemlerine iBlot transfer sisteminin etkinliği ayrıntılı bir karşılaştırma için aşağıdaki web sitesine bakın http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Bu iyon rezervuar 8 olarak hareket uygun aktarma tamponlar içeren bir jel matrisinin oluşmaktadır bir anot ve katot yığını kullanmaktadır. Transferi sırasında, su elektroliz bant bozulma 8 neden olmadan daha tutarlı bir protein transferi ile sonuçlanan bakır anot oksijen üretilmesini engellemeye yardımcı olur. Ayrıca, bu transfer sistemi, aynı zamanda, elektrotlar 8 arasındaki mesafeyi azaltarak aktarım hızını artırır.
Kemiluminesan Western Blot protein tespiti analizleri için en yaygın ve geleneksel bir teknik olmasına rağmen, iki renkli kızılötesi floresan tespiti büyük ölçüde Western Blot veri duyarlılık, kalite, ve doğruluğunu artırır. Bu saptama metodu, iki uygun dalga boyunda, 700 nm olarak kızıl ötesi lazer kullanır uyarmave 800 nm, büyük sinyal-gürültü oranı ve yüksek duyarlılık 9 ile net bir veri görüntü oluşturmak için. Bu nedenle, iki hedef proteinler, 700 nm ve 800 nm floresan saptama kanalları kullanılarak, aynı zar üzerinde eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Daha da önemlisi, kızıl ötesi floresan doğrusallık ve dinamik aralık güçlü ve zayıf hem de protein bantları 9 hassas kantitatif analiz için izin verir. Ayrıca, bu protokol bu işlemlerin etkinliğini tehlikeye ve daha nitel ve nicel Western blot verileri üretilmesi için, kızılötesi floresan protein algılama kullanmadan bu denemenin elektroforez ve transfer kez azaltarak klasik, Western lekeleme tekniği üzerinde büyük bir avantaj ve geliştirmeleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücre Kültürü alınan bütün hücre lizatları hazırlanması
- Buz üzerinde hücre kültür kaplarına koyun ve 5 mM EDTA (PBS örneğin 5 ml 5 mM EDTA/10 cm 2 tabanı ile), soğuk PBS ilave edin. Bir hücre kazıyıcı kullanılarak tabaktan yapışmayan hücreler giderilmiş ve sonra soğuk bir 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 rpm'de (230 x g) düşük hızlı santrifüjleme ile hücre süspansiyonları Pelet Buz üzerinde konik tüpler yerleştirin ve dikkatli pelet bozmadan süpernatant aspire.
- 5 mM EDTA içeren PBS içinde 1 ml pelet yıkayın ve soğuk 1.5 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Hücreler pelet 10 saniye boyunca 13,000 rpm (13,226 xg) Quick Spin süspansiyonu. Dikkatle buz üzerinde pelet ve yer tüpleri aksatmadan süpernatant kaldırmak.
- In, (örneğin 3 x 10 6 hücre için RIPA tampon ~ 150 ul ekle topak boyutuna bağlı olarak) 25-200 ul pelletiniRIPA tamponu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM NaF,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 NP-40), 2x nihai konsantrasyonda taze ilave proteaz ve fosfataz inhibitörleri ihtiva etmektedir. Kısaca her tüp vorteks ve buz üzerinde 20-30 dakika süreyle askıya inkübe. Not: proteinleri ve denatüre edici deterjan (örneğin SDS, Triton X-100 ya da NP-40) gücünü çözündürülmesi için kabiliyetleri farklı proteinleri çıkarmak için kullanılabilecek çeşitli liziz tampon vardır. RIPA tamponu bütün hücre lizatları hazırlanması ve protein-protein etkileşimlerini bozan için yararlıdır.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 14,000 rpm (15,339 xg), bir post-nükleer fraksiyonu santrifüj lizatları oluşturmak için Buz üzerinde nükleer zenginleştirilmiş pelet ve yer tüpleri bozmadan yeni bir tüp süpernatant aktarın. Not: süpernatantı genişletilirken nükleer pelet bakımından zenginleştirilmiş, aynı zamanda, borunun ayırmak olabilir. Nükleer zenginleştirilmiş pelet toplama önlemek için, ben doğrudan pipet yerleştirmekviskoz nükleer zenginleştirilmiş pelet nto ve onu imha etmek için pipet ile o kadar çizin.
- BCA ya da Bradford gibi protein miktar tahliller kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, her numunenin protein konsantrasyonunu belirleyin.
2. Numune Hazırlama ve Elektroforez
- Aşağıda özetlenen aşağıdaki tabloya göre her bir örnek hazırlayın. Bir alternatif olarak, β-mersaptoetanol da% 2.5 'lik bir son konsantrasyonda kullanılabilir. Bununla birlikte, söz konusu indirgeme ajanı, jel yüklemeden önce bir saat için, her numune kadar eklenmelidir. Hazırlanan her numunenin sadece 20 ul pipet varyasyonlar için toplam hacim hesaplar iyi başına yüklendi.
REAKTİF DÜŞÜK NUMUNE Protein Numune X ul 4x LDS Sample Buffer 6 ul 500 nM DTT Reducing Ajan 2.4 ul Deiyonize Su Kadar 15.6 ul Toplam Hacim 24 ul - 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısı örnekleri. Örnekler ısıtma olsa da, (50 mi 20x veya MES çalışma buffer MOPS artı 950 ml deiyonize edilmiş su) akan tampon 1x MES veya MOPS 1000 ml hazırlar. Tampon Koşu MES MES hızlı MOPS 4 daha çalıştırmak için Buffer Koşu sağlayan bir düşük pKa ile 2-200 kDa arasında daha küçük molekül ağırlıklı proteinler giderir ise tampon Koşu MOPS, 14-200 kDa arasında orta boy proteinleri giderir. Bu nedenle, bu iki tampon protein bantlarının 4'ün ayrılmasından farklılıklara neden olan istifleme jel içinde iyonlarının göçü üzerindeki etkileri zıt var. Kenara ve Min Üst Tampon Odası'nı doldurmak için kullanılacak 200 1x MES ml veya Antioksidan 500 ul ile Buffer Koşu MOPS, birleştirmeki-Cell elektroforez birimi.
- Numuneler buz üzerinde yerleştirmeden önce ısıtma, hızlı sıkma örnekleri bitirdikten sonra.
- Elektroforez için Mini-Cell ünitesine prekast Bis-Tris jellerin montajı için üreticinin yönergelerini izleyin. Not: Her bir jel, her jel kısa (küçük) kaset Tampon Çekirdek içeriye doğru dönük ve jeller düzey ve sıkı Üst Tampon Odası sızmasını önlemek için tampon Çekirdek bastırılan böyle bir moda odaklı olduğundan emin olun.
- 1x MES veya Antioksidan ve 1x MES veya Buffer Koşu MOPS yaklaşık 600 ml Mini-Hücre biriminin Alt Tampon Odası'nı içeren Buffer Koşu MOPS 200 ml Üst Tampon Odası'nı doldurun. Tampon çalışan ekstra 200-300 ml daha sonra kullanmak üzere kaydedilebilir. Bununla birlikte, tamponun pH değeri ve kalite değiştirilmiş edilebilir elektroforez çalışması sırasında kullanılan tampon geri dönüşüm için tavsiye edilmez.
- Her bir protein samp 20 ul yükle her bir kuyunun içine. Birden antikorlar (yani en fazla 2) problanması için çeşitli şeritler halinde membran kesit halinde, oldukça bu olarak görev yapacak her jel ilk ve son kuyularda Önceden Boyanmış protein standart 2-5 ul yük önerilir protein bantlarının görüntüleme etkilemeden, zarın farklı bölümleri ayırmak için, kesme alanlar.
- Sonunda başlangıç ve jel başına 70-80 mA'da 110-125 mA / jel beklenen bir akımı ile 35 dakika boyunca 200 V sabit çalıştır jeller. Izleme boya Buffer Çekirdek boyunca platin tel göç Elektroforez tamamlanır.
3. IBlot Kuru Blot Sisteminin Kullanılması Protein Transferi
- Tamamen (bu çatırdatacak üretebilir) kasetin bağlanmış tarafı kırarak Mini-jeller ayırın. Daha kısa (küçük) plaka atın ve dikkatli bir şekilde deiyonize su ile bir kabın içine daha fazla (yarıklı) plakadan jel aktarmakalt kısmında yer alan, jel kalın ayaklı kısmını çıkarmak. Not: Nadir durumlarda üzerine, jel uzun kısa plaka yerine eklemek olabilir, plaka yaptı. Bu durumda, daha uzun, oluklu levha atmak ve alt kısmında yer alan, jel kalın ayaklı kısmını çıkarmak. Daha sonra, dikkatli bir şekilde iyondan arındırılmış su ile kısa plakadan jel aktarın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak anot ve katot aktarma yığınları birleştirin. Not: nitroselüloz veya PVDF membranları iki protein arasında yüksek kaliteli ve verimli transferi sağlar ve floresan algılaması 8 ile uyumludur. Bununla birlikte, PVDF membran nitroselüloz daha yüksek bir bağlama kapasitesine (240 ug / cm 3) (200 ug / cm 3) 8 var.
- Dikkatlice kabarcıklar veya bu gibi jel ve membran arasına sıkışmış hava transferi sırasında protein bantlarının herhangi bozulmasını engeller çıkarın. Not: membran veya transf Döşeme yoker bu anot ve katot yığınlar arasında doğrudan temasın neden olacak gibi jel boyutuna sığacak şekilde yığını.
- Sonra düzgün kuru emme cihazda aktarma yığınları montaj, uygun voltaj programı (yani Program 3: 7 dakika 20 V) seçin ve transferi başlar. Not: 150 kDa'dan büyük bir proteinler daha yavaş göç eğilimi ve 8-10 dakika daha uzun bir aktarım zaman gerektirebilir. Buna ek olarak, 5-10 dakika boyunca% 20 etanol içinde jelin önceden kuluçka da bu büyük proteinlerin aktarım etkinliğini artırmak için yardımcı olacaktır. Transfer programı tamamlandığında, cihaz otomatik olarak akımı kapanacaktır. Hemen membran kaldırmak ve daha iyi protein algılama sağlamak ve membran kurumasını önlemek için engelleme prosedürü ile devam etmek en iyisidir.
4. Kızılötesi Floresan Protein Algılama
- Odyssey 1 saat ya da için Buffer (Tween-20 ekleyin Etmeyin) Engelleme 0.8 ml / cm 2 minimum blok membran (ler)gece boyunca at 4 ° C. Membran (ler), aynı zamanda, ancak bu daha yüksek bir arka plan neden olabilir ve protein algılama engelleyebilir, yağsız kuru süt ile bloke edilebilir.
- 4 ° C de bir gece boyunca,% 0.1 Tween-20 ile Bloklama Tamponu Odyssey'de istenen konsantrasyonda primer antikor olarak membran (lar) inkübe Iki farklı antijenler, aynı blot üzerinde görselleştirildiği edildiği iki renkli algılama için, iki primer antikorlar, farklı ev sahibi türünden türemiş olması ve membran (lar) aynı anda ilave edildi. Not: önce, birincil antikor olarak membran (lar) kuluçka için, zar (lar), aynı zar üzerinde birden fazla antikor (yani en fazla 2) için araştırmak amacıyla çeşitli parçalar halinde bölümlere edilebilir.
- TBS içinde 10 dakika artı% 0.1 Tween-20 hafifçe çalkalanarak için membran (lar) 3 kez yıkayın.
- Odysse olarak 800 nm kanal için 700 nm kanal ve 1:6,000-1:10,000 için bir 1:20,000 seyreltide floresan etiketli sekonder antikor ile membran (lar) inkübey (daha uzun süre, 1 saat boyunca membran (lar) enkübe arka arttırabilir), 30-60 dakika boyunca,% 0.1 Tween-20 ile Bloklama Tamponu. Işıktan membran (ler) koruyun. Not: ikincil antikorlar birincil antikor her biri aynı ev sahibi türünden türemiş farklı fluorophores işaretlenmelidir gerekmektedir.
- TBS içinde 10 dakika artı% 0.1 Tween-20 hafifçe çalkalanarak için membran (lar) 3 kez yıkayın. Işıktan membran (ler) koruyun.
- Taranır ve Kızılötesi Görüntüleme Sistemi ile görüntülenmiş kadar membran (lar) Tween-20, 4 ° C 'de kurutulur ve TBS veya PBS ile ya da depolanabilir. Düzgün ışıktan koruyarak floresan sinyal birkaç ay boyunca stabil olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki renkli kızılötesi floresan gelişmiş hassasiyet ve net Western Blot görüntüler üretmek için en yüksek sinyal-gürültü oranı ile aynı zar üzerindeki güçlü ve zayıf hem bantları algılar. 700 nm ve 800 nm flüoresan kanallar hem de görsel iki renkli Western blot algılama tarafından oluşturulan tipik sonuçlar, Şekil 1 ve 2'de örneklenmiştir. Şekil 1 'de üst Western blot insandan lizatlarının, iki kat seri dilüsyonları 700 nm kanalı (kırmızı)' de 800 nm kanalı (yeşil) ve β-aktin, toplam ERK1 / 2 ve aynı zamanda da (overlay) tespitini göstermektedir melanom hücre hattı, WM793 türevi. Buna ek olarak, bu zar da aynı leke üzerinde incelenmelidir, ikiden fazla antikorlar için izin vermek için arzu edilen protein hedeflerin molekül ağırlıklarına göre bölümler halinde kesilmiştir. Örneğin, Şekil 1 'de analiz edilen zar alt noktası araştırmak için yarıya kesilmiştirToplam ERK1 / 2 ve β-Aktin hem de algılama ile çıkarım olmayan bir üçüncü antikor, tüm BIM (700 nm kanal-kırmızı) ile membran iyon. Şekil 2'nin birinci panel ayrıca, fosfo-ERK1 / 2, iki renkli Western blot algılama floresan gösterir (800 nm kanal-yeşil) ve toplam olarak ERK1 / 2 (700 nm kanal-kırmızı) fosfo-ERK ve ERK toplam sinyalleri taşmalı ERK1 / 2 MAP kinaz sinyal yolunu bastırır MEK1 / 2 inhibitörü PD0325901 (Meki) varlığında ve yokluğunda muamele WM793, melanom hücrelerinin sarı göstermiştir. Ayrıca, 700 nm ve 800 nm fluoresan görüntüleri de her bir antikor için standart siyah ve beyaz Western blot görüntülere dönüştürülür (Şekil 1 ve 2) olabilir. Şekiller 1 ve 2'de de görüldüğü gibi, genel olarak, bu protokol ile üretilen Western blot görüntülerinin çoğunluğu yüksek kaliteli görüntüler ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, seçicilik bağlı olarak, özgüllük,ve uygun görüntülerin daha az birincil antikor kalitesi, bu yöntem vasıtasıyla analiz blotların küçük bir kısmı neden olabilir. Örneğin, Şekil 2'nin alt iki panel de görüldüğü gibi, ve MEK inhibisyonu olmadan tedavi WM793 melanoma hücrelerinde fosfo-BIM antikorun subpar kalite hafif protein bantları ve son derece yüksek bir membran arka planı olan bir Western blot görüntü ile sonuçlanmıştır.
İki hedeflerin aynı anda kızılötesi floresan görüntüleme de verimli ve doğru bir şekilde, aynı zar üzerinde güçlü ve zayıf hem de bantlar tespit ederek, geniş, doğrusal bir dinamik alan üzerinde Western blot kantitatif analiz için fırsat sağlayabilir. Protein bantlarının miktarının zar üzerinde floresan-etiketli antikor miktarı ile orantılıdır ve bant ve çözünürlük etrafında çizilen şeklin iki boyutu bağımsız olan entegre bir yoğunluk olarak hesaplanır. Bu, aşağıdaki kriterlere dayanmaktadır: 1) vardırşekilli bir, şekil içine piksel 2) sayısı, arka plan olarak seçilen piksel 3) ortalama yoğunluğu ve,. verilen şekil 10 içine piksel 4), toplam yoğunluğu Şekil 3A protein miktarının gösterir Western blotlar, Şekil 1 'de gösterilen. Toplam ERK1 / 2, β-aktin, toplam BIM sergi floresan sinyalinin entegre yoğunluğunda bir artış ve protein konsantrasyonundaki artış (Şekil 3A) arasında doğrusal bir ilişki miktarının belirlenmesi. Ayrıca, Şekil 3B ve Şekil 2'nin MEK inhibisyonu olmadan tedavi WM793, melanom hücrelerinin toplam ERK1 / 2 protein seviyelerinin normalize fosfo-ERK1 / 2 protein miktarının gösteren floresan Western blotlar, protein seviyelerini ölçmek için nasıl bir başka örneğidir . Bu miktar itibaren, fosforlu ERK1 / 2 düzeylerinin kontrol düzeylerinin yüzdesi olarak hesaplanabilir. Bu case, MEK inhibitörü ile muamele edilmiş, melanom hücrelerinin fosfo-ERK seviyeleri kontrolün% 0.6 idi.
Şekil 1. Iki renkli algılama kızıl ötesi floresan protein WM793 insandan türetilmiş melanoma proteininin iki kat seri seyreltmelerinin. Lizatlar kullanılarak Western blot analizi, iBlot Transfer aparatı kullanılarak PVDF zarı üzerine transfer proteini ile bir NuPAGE Novex Bis-Tris jel kullanılarak ayrıldı . Zarlar Odyssey Engelleme Tampon bloke ve aşağıdaki birincil antikorlar ile problandı: tavşan anti-toplam ERK1 / 2, tavşan anti-toplam BIM ve fare anti-β-Aktin. Antijen-antikor komplekslerinin, anti-tavşan IRDye 800 (yeşil) ya da 680 (kırmızı) ve keçi anti-fare IRDye 680 (kırmızı) ikincil antikorlar sırasıyla keçi floresan kullanılarak tespit edildive LI-COR Odyssey Klasik Kızılötesi Görüntüleme Sistemi ile görüntülendi. İlk Western blot paneli toplam ERK1 / 2 (800 nm kanal-yeşil) ve β-aktin (700 nm kanal-kırmızı) floresan sinyalleri aynı anda algılama şablonudur. İkinci panel, bu hedef proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre bir tıraş makinesi bıçağı kullanılarak ayrıldı, aynı zar üzerinde toplam BIM tek kanallı floresan algılama. Alt üç Western blot panel ayrılmış tek kanallı bir floresan görüntülerin siyah beyaz görüntülerdir.
Şekil 2,. Bir örnek kızıl ötesi floresan ile her ikisi de, yüksek ve düşük kaliteli Western blot image. DMSO (CTL) ya da 2, MEK inhibitörü uM, PD0325 ile tedavi WM793 melanom hücreleri Şekil 1 'de tarif edildiği gibi 901 (Meki), 18 saat süre ile analiz edilmiştir. Membran tavşan anti-fosfo-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204) ile problanmıştır, fare anti-total ERK1 / 2, ve keçi anti-tavşan IRDye 800 ile tespit edilen antijen-antikor kompleksleri ile fare anti-fosfo-BIM (Ser69) (yeşil) ve keçi anti-fare IRDye 680 (kırmızı). İlk Western blot paneli, fosfo-ERK1 / 2 (800 nm kanal-yeşil) ve toplam olarak ERK1 / 2 (700 nm kanal-kırmızı) floresan sinyalleri hem de aynı anda algılama şablonudur. İkinci ve üçüncü panel fosfor ve total ERK1 / 2 tek kanallı fluoresan görüntüleri siyah ve beyaz görüntülerdir. Alttaki iki paneller fosfo-BIM floresan ve siyah beyaz görüntüler. Bu görüntüler nedeniyle birincil antikorun altı kalitesine bu yöntem ile sonuçlanabilir subpar bir Western lekesinin örneği temsil eder.
p_upload/51149/51149fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Kızıl ötesi floresan Western blotlar. A), toplam ERK1 / 2 miktarının, β-aktin ve total BIM protein seviyeleri protein miktarının örnekleri, her bir protein bandının yoğunluğu entegre hesaplanmasıyla belirlenmiştir. Entegre yoğunluğu zar üzerinde floresan işaretli sekonder antikor miktarı ile orantılıdır. Şekil 2'den toplam ERK1 / 2 protein seviyelerinin normalize edilmiş fosfo-ERK1 / 2 R-kare değerleri de Şekil 1 'de analiz edilen antikorların her biri için, lineer regresyon değerlendirmek için kullanıldı. B) Niceleme entegre yoğunluğu kullanılarak hesaplanmıştır flüoresan sinyal ve veri DMSO-kontrol bir yüzdesi olarak sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokole uygun olarak yüksek kaliteli, niceliksel Western blotları elde edilmesinde kritik adımlar aşağıdaki gibidir: 1) protein konsantrasyonlarının ölçülmesi, 2) örnek hazırlama, 3) bloke edilmesi ve, 4), birincil antikor kalite ve kalibre.
Toplam protein konsantrasyonları ölçüm doğruluğu kızılötesi floresan tespit olağanüstü duyarlılık örneklerin protein konsantrasyonu bulunan herhangi bir hafif farklılıkları büyütmektedir çünkü protein bantları miktarının üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. , Protein konsantrasyonunun saptanması, bir lineer regresyon hattı veya (2 ≥ 0.99 ya da daha iyisi R) Her numunenin protein konsantrasyonu kesin hesaplanmasında önemlidir 1 mümkün olabildiğince yakın R-kare bir değere sahip bir standart eğri oluşturmak tutarsızlıkları önlemek için . Örneğin, R 2 değeri, taze ultra-saf su ile BSA standart hazırlama ve dikkatli bir şekilde tekrar, 0,99 altına düşerseprotein ölçümü tahlil R2 değerini artırmak için yardımcı olabilir. Bu azaltılmış R örneklerin protein konsantrasyonlarındaki 2 değerlerini ve yanlışlıklar katkıda bulunabilir pipetle tutarsızlıkları üretecektir gibi bir çok kanallı pipet kullanarak engellemek için, aynı zamanda en iyisidir.
Örnek hazırlanması aynı zamanda, doğrudan bu bantların miktar etkiye sahip olabilir ki, protein bantların kalitesinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar. Bis-Tris jel sistemi kullanılarak, bu çok bu tamponun hafif alkalin pH (8.5) disülfid bağları ve denatürasyon 4 azaltılması için en uygun koşul sağlar, çünkü örnekleri LDS Sample Buffer ile hazırlanır önerilir. Bu örnek tampon ayrıca küçük peptitler jel 4 kaçıp etmemelerini sağlamak için yardımcı olur hareketli iyon önünde olan göç keskin bir boya ön üreten bir Coomassie G250 izleme boya içerir. Daha da önemlisi, LDS SampleNumuneler nedeniyle 8.5-8.0 4 değişen tampon pH, 70 ° C'de ısıtıldığında Buffer aspartil-prolil peptid bağlarının bölünmesini en aza indirir. Ayrıca, protein bütünlüğünü korurken bu proteinlerin indirgenmesi ve alkilasyon için ideal bir ortam ile sonuçlanır. Bir Tris-Glisin SDS örnek tampon yerine LDS Sample Buffer kullanıldığında, ancak bu aspartil-prolil bağlarının parçalanması, protein bantları netlik bir azalma ve protein artış parçalanma 4 yol açacaktır. Ayrıca Mini-Hücre elektroforez ünitesi Üst Tampon Odası'na Antioksidan eklemek için uygun olan. Antioksidan Bis-Tris jel sistemde, nötr pH'ta örnekleri ile birlikte göç eden mümkün olduğu için, bu azaltılmış halde proteinleri korumak ve oksidasyona karşı disülfid bağları hem de hassas amino asitleri korumak Antioksidan olmaması olabilir, oysa olabilir Dağınık protein bantları 4. yol. Son olarak, bunun son dereceMES veya jellerin bu tür akan tampon Tris-Glisin SDS kullanılarak karşıt olarak Bis-Tris jeller ile çalışan tampon MOPS ya da kullanmak tavsiye edilir. Bantları daha sıkıştırılmış ve fincan şeklindeki 4 görünen ile elektroforez çalışma süresi dramatik bir artışa neden glisin iyonların yavaş göç Buffer ve Bis-Tris jeller sonuçları Running Tris-Glisin SDS kombinasyonu.
Engelleme adım, aynı zamanda çeşitli bloke edici maddeler gibi birçok yüksek membran arka üretebilirsiniz floresan algılama kullanarak yüksek kalitede Western Blot görüntüler üretmek için önemlidir. Kızılötesi floresan tespiti için, düşük arka plan korurken bu özel bloke maddesiproteini algılama hassasiyetini artırır çünkü Odyssey Engelleme Tampon kullanmak en iyisidir. Yağsız kuru süt, kazein, ya da aynı zamanda alternatif BSA bloke edici maddeler olarak kullanılabilir, ancak bu tür çözeltilerin, daha yüksek membran arka neden bindinin bazı durumlarda bir azalma olabilirbirincil antikor 10 ng afinite. Ek olarak, süt bazlı bloker 9,11 bağlayıcı protein saptanması ve uygun bir antikorun doğruluğu müdahale olabilir ki, fosfo-epitoplar ve anti-keçi antikorları ile çapraz reaksiyona girebilen bu IgG içerebilir. Bir Western Blot görüntü yüksek arka, nonspesifik bantlar, veya zayıf / hiç sinyal rahatsızlanır Ancak, eğer, o zaman bu alternatif bloke edici ajanlarla birini kullanarak görüntü kalitesini artırmak için yardımcı olabilir. Ayrıca, aynı zamanda, bu arka plan ve / veya membran 9,12 olan hedef proteinin kaybı artışa neden olabileceğinden, bloke etme ve uzun engelleme inkübas-yonlarına deterjan ekleyerek önlemek için önerilir.
Aynı zamanda, 700 nm ve 800 nm kanal boyası ile etiketlenmiş antikorlar kullanılarak kızılötesi aynı blot üzerinde iki farklı antijen tespit hem birincil ve ikincil antikor ihtiyatlı seçimi gerektirir. İki birincil antikorun farklı ana! Elde edilmelidirt türler. Bir birincil antikor tavşan türetilmiş Örneğin, daha sonra ikinci bir birincil antikor, fare, tavşan gibi başka farklı bir türden türetilen edilmesi gerekmektedir. Aynı şekilde, enfraruj ikincil antikorlar birincil antikor, aynı zamanda her biri aynı ev sahibi türünden türemiş farklı fluorophores işaretlenmelidir gerekmektedir. Örneğin, 800 nm kanalda bir keçi anti-tavşan doğru tavşan ve fare türetilen iki farklı primer antikorlardan protein sinyali gözlemlemek için 700nm kanalda bir keçi anti-fare ile kombine edilebilir.
Birincil antikorlar antijen için kalite, afinite ve duyarlılık önemli ölçüde değişir. Bu sinyal de önemli bir azalma ya da bu şekilde doğru bir hedef proteini görselleştirme güçlükler çıkarmaktadır zara proteinlerin spesifik olmayan bağlanma bir artışa neden olabilir. Bu nedenle, alternatif bir bloke örneğin yağsız kuru süt solüsyonu veya kullanarakPBS içinde çözünmüş kazein, düşük kaliteli primer antikorlar 10 ile protein algılama geliştirmek için yardımcı olabilir. Buna ek olarak, deterjan konsantrasyonu, aynı zamanda, antikorun yıkama uzak önlemek amacıyla deterjan konsantrasyonunu belirlerken dikkate alınmalıdır, hedef antijene ve önlem için birincil antikorun bağlanma etkileyebilir. Seyreltilmiş sekonder antikor ilave edildiği zaman, PVDF membranı 10 kullanılarak, özellikle SDS (% 0,01-0,02) ihtiva eden bir düşük konsantrasyonda, arka plan ve özgül olmayan bağlanma azaltabilir. Bununla birlikte, SDS de sinyal gücü ciddi bir azalmaya yol açan antijen-antikor bağlanmasını bozabilir.
Ayrıca, bu protokolü açıklanan yeni değişiklikler geleneksel Batı lekeleme tekniği modern bir yaklaşım örneğidir. Bu teknoloji büyük ölçüde gelişmeler etkinliğini, tutarlılık ve Batı verilerin duyarlılığını artırmak ve birden fazla hedef proteinlerin doğru ölçümü sağlarne olursa olsun, sinyal gücü, aynı zar üzerinde. Daha da önemlisi, bu değerli düzenlemeler, aynı zamanda önemli ölçüde yüksek kalitatif ve kantitatif verilerinin üretilmesi sırasında bir Western blot gerçekleştirme deney süresini kısaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz onların yardım ve destek için McMahon laboratuvarın tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma bir NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM) ve Kurumsal Araştırma ve Akademik Kariyer Geliştirme Ödülü (JS IRACDA) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 | |
| 4x NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | |
| 10x NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 | |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 | |
| 20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX | |
| SeeBlue Plus2 Prestained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 | |
| iBlot Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 | |
| β-Actin | Sigma | A2228 | |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A | |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 | |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 | |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 | |
| Odyssey Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Odyssey Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- iBlot Dry Blotting System. Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).
- Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).
- Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L. Human Milk Composition. Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
