本协议描述了实验过程的人工转录因子(申请进度查询设施)与绿色荧光蛋白同源记者和通过流式细胞仪,刺激GFP表达的申请进度查询设施能力量化的快速建设。
合成生物学的目的是合理设计和期望的量化特性构建合成电路,并提供工具来查询本机控制电路的结构。在这两种情况下,对基因的表达进行编程以快速和可调谐的方式,没有脱靶效应的能力可能是有用的。我们已经构建了含有URA3盒其次是人雌激素受体 和VP16的配体结合域的ACT1启动子上游的酵母菌株。通过转化该菌株具有线性PCR产物含有对URA3的存在下DNA结合域和选择,组成型表达的人工转录因子(ATF),可以通过同源重组产生。申请进度查询设施工程改造以这种方式可以激活一个独特的靶基因在诱导剂的存在下,从而避免两者的脱靶活性,与常用conditi发现非生理生长条件ONAL基因表达系统。还提供了对绿色荧光蛋白报告质粒,为感兴趣的当地人或人工转录因子的响应特别是快速建设一个简单的方法。
在酵母中发展基因开关是在学术和工业研究的极大兴趣。在理想情况下,遗传开关可用于仅当由实验者期望激活特定基因(或一组基因的)。 A基因的编码序列的合成启动子的下游放置不表达在不存在诱导分子:在诱导剂除了该基因应迅速表达。它只是在最近已经证明,这样的开关可以在酵母中,在那里在没有诱导物,该菌株显示缺失的表型,但在诱导剂的存在下,表达被成比例地诱导物的水平在所有细胞中激活被改造1,2。从历史上看,在酵母中的条件表达式系统已在营养响应的DNA序列,包括MET,河粉 ,和GAL启动子(其活动的蛋氨酸,磷酸盐外水平敏感,严重依赖半乳糖,分别)。虽然条件表达式可以实现的,它是以牺牲显著多效的成本。
激素受体 ,如人雌激素受体 已被证明是在真核生物3,4有效开关。在无激素的,稠合到一个激素受体的蛋白可以被隔离在那里它与热休克蛋白90分子伴侣复合物相互作用的细胞质中。在结合适当的配体,受体发生构象变化,导致它从热休克蛋白90分子伴侣复合物释放并露出了核定位信号。观察到的特定激素含有受体蛋白的定位动力学,我们创建Gal4dbd.ER.VP16(GEV,含有Gal4p DNA结合结构域,人雌激素受体的配体结合结构域的合成转录因子的C-末端融合和VP16)与绿色荧光蛋白2。核定位跟随加在8分钟内观察饱和的诱导剂,β-雌二醇的量,到野生型酵母完全是惰性的。到了这个时候,大部分细胞具有极值分布的靶基因(通过荧光原位杂交检测)清晰可见活跃的转录位点,以及完全成熟的mRNA 2,5。 GEV靶基因表达> 2倍,2.5分2,6(使用微阵列测量)范围内增加,这表明它需要<2.5分钟的嵌合体活化剂转运到细胞核,与DNA结合,并激活转录。
而其他几个上开关已在酵母中,利用各种小分子或药物(包括大肠埃希氏经典的多西环素为基础的开关大肠杆菌 7,8和拟南芥靛蓝为主开关9),没有已经实现了应用的速度,特异性,或调节松紧度的激素为基础的开关展出。值得一提的吨帽子快速关断开关也已开发在酵母中,并且通常通过融合基因对蛋白酶或泛素连接酶靶向序列2,10,11,12工作。迅速从细胞中移除一个目标蛋白质的能力,有利于必需基因的研究和基因时,删除10是易受遗传抑制。
在此协议中描述的方法是建立和开关在酵母中合成表征。首先,我们将展示如何快速生成基因组整合的融合蛋白组成的利益的DNA结合结构域,配体结合人类雌激素受体的结构域,与VP16(DBD-EV的)。按照我们的协议,该融合蛋白是从ACT1启动子表达。然后,我们展示了如何创建一个同源报告质粒的ATF和使用流式细胞仪测试其功能。虽然我们设想这些报告质粒被用新的申请进度查询设施( 图1)使用时,它们可以bË作为记者的原生转录激活为好。最后,提供了详细的试验在96孔板ATF活化对细胞生长的影响以及工程可诱导基因的等位基因。
此处所描述的基于激素的开关具有无数应用,从研究天然细胞生物学测试感兴趣的DNA结合结构域的目标DNA序列在体内的能力。该系统具有许多理想的特性,包括分级响应诱导,快速的行动,并严格监管( 即 ,没有可测量的泄漏,参见图7)。然而,仍然有改进的空间和扩展。
最近在合成生物学的工作强调多路 合成系统和扩大良好的特点,可编程的DNA部分16的剧目。鲜明的靶基因的独立,条件表达式既需要多个诱导和缺乏特异性重叠的DNA结合结构域。工程和天然受体的可用性提供了大量部件,用以开发新的人工转录因子。扩大相互正交的开关剧目已被定向进化极大的帮助接近17,18。目前正在努力重新设定我们的人工转录因子的配体结合的特异性将呈现的未来。
先前,基因缺失/过表达的表型影响已经被广泛地研究了在酵母19,20。然而,它并没有被直接地研究表达对不同表型的范围内表达水平的影响。本文介绍的系统的一个主要特点是它的分级性质( 图8)。虽然通常认为,基因表达和利益表型之间的关系不一定是单调的。人工转录因子例如Z 3 EV和Z 4 EV会使测定的表型反应基因表达的变化简单的任务。
最后,讨论协议编辑在该原稿是用于工程和表征该响应β-雌二醇人工转录因子,然而,一个重要的替代化学反应域是使用可见光响应型结构域(如PhyB/Pif3,LOV,并BLUF)其活动是可逆的,而无需扰乱培养生长培养基21-23。光为基础的系统便于时空控制基因表达,蛋白-蛋白相互作用,离子运输,和酶活性,已证明这是有力21-26。
总之,我们已经提出了诱导,人工转录因子的快速建设在酵母的方法。这个协议提供了其与同源GFP记者结合结构,以及用于使用流式细胞仪分析该报道的内容并测定生长ATF活化的影响的方法的模板。
The authors have nothing to disclose.
RSM从美国国家科学基金会研究生研究奖学金承认资金。 MBN承认从路易斯 – 西格莱尔奖学金资助和彼得·刘易斯赋予的礼物。 DB确认来自美国国立卫生研究院(GM046406)普通医学科学中心的定量生物学(GM071508)国家研究所的资助。我们承认克里斯蒂娜DeCoste与流式细胞仪的实验援助。
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |