이 프로토콜은 동족 GFP 기자 및 유동 세포 계측법을 통해 GFP 발현을 자극하는 ATFs 능력의 정량화 인공 전사 인자 (ATFs)의 신속한 건설을위한 실험 절차를 설명합니다.
합성 생물학 이성적으로 디자인 및 소망 정량적 특성과 합성 회로를 구축 할뿐만 아니라, 기본 제어 회로의 구조를 심문하는 툴을 제공하는 것을 목적으로한다. 두 경우 모두, 제공된 표적 이탈 효과, 신속하고 가변 방식으로 유전자 발현을 프로그래밍하는 능력은 유용 할 수있다. 우리는 사람의 에스트로겐 수용체와 VP16의 리간드 결합 도메인 뒤에 URA3 카세트의 ACT1 프로모터 상류를 포함하는 효모 균주를 구축했다. URA3의 존재에 대한 DNA 결합 도메인 및 선택을 포함하는 선형 PCR 생성물로 균주를 변형시켜, 구성 적으로 발현 인공 전사 인자 (ATF)는 상동 재조합에 의해 생성 될 수있다. 이러한 방식으로 설계된 ATFs함으로써 오프 – 타겟 활성화와 일반적으로 사용되는 컨디셔닝 발견 nonphysiological 성장 조건을 모두 제거 유도제의 존재 하에서 고유 표적 유전자를 활성화 할ONAL 유전자 발현 시스템. 그 기본 또는 인공 전사 인자에 특이 적으로 반응 GFP 기자 플라스미드의 신속한 건설을위한 간단한 방법도 제공됩니다.
효모에서 유전자 스위치를 개발하는 것은 학문과 산업 모두 연구에 큰 관심입니다. 이상적인 경우, 유전자 스위치는 실험자가 원하는 경우에만 특정 유전자 (또는 유전자 세트)을 활성화하는 데 사용할 수있다. 하류 합성 프로모터의 배치 유전자의 코딩 서열을 유도 분자의 부재로 표현되지 않는다 : 유도 물질을 첨가 할 때 유전자 발현이 빠르게한다. 그것은 단지 최근 이러한 스위치는 유도제의 부재에 변형이 결실 표현형을 표시하지만 유도제의 존재하에 발현은 모든 세포에서 유도의 수준에 비례하여 활성화 효모에서 설계 될 수 있다는 것을 증명되었다 1,2. 역사적으로, 효모 조건식 시스템은 MET, PHO 및 GAL 프로모터 (활동 메티오닌, 인산의 세포 수준에 민감 등 영양소 응답 DNA 서열에 크게 의존갈락토스, 각각). 조건식이 달성 될 수 있지만, 그것은 상당한다면 발현 효과의 선정에 온다.
이러한 인간의 에스트로겐 수용체로 호르몬 수용체는 진핵 생물 3,4 효과 스위치적일 수있다. 호르몬의 부재에서, 호르몬 수용체 융합 단백질은 그것의 Hsp90 샤페론 복합체와 상호 작용하는 세포질에서 압수 될 수있다. 적절한 리간드를 결합하면, 수용체는의 Hsp90 보호자 단지에서 배출되는 원인과 핵 지방화 신호를 공개, 구조적인 변화를 겪는다. 특정 호르몬 수용체 함유 단백질의 현지화 역학을 관찰하기 위해, 우리는 Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, Gal4p DNA 결합 도메인, 인간 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 합성 전사 인자의 C-말단 융합을 생성 , 및 VP16) GFP 2. 핵 이행을 첨가 한 다음에 13 분 이내에 관찰되는 야생형 효모가 완전히 불활성, 유도, ß-에스트라 디올의 양을 포화. 이 시간까지, 세포의 대부분은 (형광 제자리 교잡을 통해 정량) GEV의 표적 유전자에 대한 명확하게 보이는 활성 전사 사이트뿐만 아니라 완전히 성숙의 mRNA 2,5있다. GEV의 표적 유전자는 핵으로 이동시키다 DNA에 결합하고, 전사를 활성화하기 위해 <키메라 활성화 2.5 분을 소요 보여, 2.5 분 2,6 (마이크로 어레이를 사용하여 측정) 내에서 표현> 2 배 증가.
여러 온 – 스위치, 다른 하나는, 아무도 속도를 달성 없습니다 (대장균 대장균에서 고전 독시사이클린 (doxycycline) 기반의 스위치 7,8와 애기 장대에서 인디고 기반 스위치 9 포함) 다양한 작은 분자 또는 약물을 사용 효모에 적용되었지만, 특이도, 또는 호르몬 기반의 스위치에 의해 전시 된 규제의 압박감. 그것은 t 언급 할 가치가있다모자 급속-스위치 오프 또한 효모에서 개발되었으며, 일반적으로 순서 2,10,11,12을 대상으로 단백질 분해 효소 또는 유비퀴틴 리가 아제에 유전자를 융합하여 작동합니다. 급속 셀로부터 목적 단백질을 분리하는 능력은 필수 유전자의 연구뿐만 아니라 열을 삭제할 때 유전 억제하는 경향이있는 유전자를 용이하게한다.
이 프로토콜에 설명 된 방법을 구축하고 온 스위치 효모 합성의 특성을위한 것입니다. 첫째, 우리는 신속하게 그 DNA 결합 도메인으로 구성된 유 전적으로 통합 된 융합 단백질을 생성하는 방법을 보여, 리간드는 인간 에스트로겐 수용체 결합 도메인 및 VP16 (DBD-EV의). 우리의 프로토콜에 따라, 융합 단백질 ACT1 프로모터로부터 발현된다. 우리는 그 다음 ATF의 동족 기자 플라스미드를 만들고 유동 세포 계측법을 사용하여 기능을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 우리는이 기자의 플라스미드는 새로운 ATFs (그림 1)에 사용되는 구상이지만, 그들은 B 수전자뿐만 아니라 네이티브 전사 활성에 대한 기자로 사용된다. 마지막으로, 96 – 웰 플레이트에서 세포 증식에 ATF 활성화의 효과를 테스트하고 유도 게놈 대립 유전자 공학 상세가 제공된다.
여기에 설명 된 호르몬 기반의 스위치는 생체 내에서 DNA 시퀀스를 대상으로 그 DNA 결합 도메인의 능력을 테스트에 기본 세포 생물학을 공부, 수많은 응용 프로그램이 있습니다. 이 시스템은 유도, 빠른 조치, 꽉 규제 등급 응답 등 많은 바람직한 기능이 없습니다 (즉. 측정 가능한 leakiness를, 그림 7 참조). 그러나, 개선 및 확장의 여지가 여전히있다.
합성 생물학의 최근 연구는 다중 합성 시스템을 강조하고 잘 특징으로, 프로그램 DNA 부분 (16)의 레퍼토리를 확장하고있다. 별개의 표적 유전자의 독립, 조건식 여러 유도 및 중복 특이성이 부족 DNA 결합 도메인이 모두 필요합니다. 엔지니어링 및 자연적으로 발생하는 수용체의 가용성은 새로운 인공 전사 인자를 개발되는 부품의 큰 세트를 제공합니다. 확장상호 직교 스위치의 레퍼토리는 크게 (17, 18)에 접근 감독 진화에 힘 입어있다. 우리 인공 전사 인자의 리간드 – 결합 특이성을 재 프로그래밍 전류 노력은 미래에 제시 될 것이다.
이전에는 유전자 삭제 / 과발현 형질 결과는 광범위하게 효모 (19, 20)에서 연구되고있다. 그러나, 발현 수준의 범위에서 서로 다른 표현형에 표현의 효과를 연구 간단한 것부터되지 않았습니다. 여기에 제시된 시스템의 주요 특징은 등급을 매긴 자연 (그림 8)입니다. 종종 가정 반면, 유전자 발현과 그 표현형 사이의 관계가 반드시 단조하지 않을 수 있습니다. 이러한 Z 3 EV 및 Z 4 EV 인공 전사 인자는 간단 유전자 발현의 변화에 표현형 응답을 시금의 작업을하게됩니다.
마지막으로, 프로토콜 토론이 원고의 에드 엔지니어링 및 에스트라 디올을 β에 반응 인공 전사 인자의 특성을위한 것입니다, 그러나, 중요한 다른 화학적 반응 도메인 (예 : PhyB/Pif3, LOV 및 BLUF 등) 등 응답 도메인을 사용하는 것입니다, 그의 활동은 문화의 성장 매체 21-23를 교란하지 않고 되돌릴 수 있습니다. 광 기반 시스템은 시공간 유전자 발현의 조절, 단백질 – 단백질 상호 작용, 이온 수송 및 이미 21-26 강력한 입증 효소 활성을 촉진한다.
결론적으로, 우리는 효모에서 유도, 인공 전사 인자의 신속한 건설을위한 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 자신의 동족 GFP 기자와 함께 건설뿐만 아니라, 유동 세포 계측법을 사용하여 기자의 데이터를 분석하고 성장에 ATF 활성화의 효과를 시금 방법에 대한 템플릿을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
RSM은 NSF 대학원 연구 활동에서 자금 조달을 인정합니다. MBN은 루이스 – Sigler 원정대 자금 피터 루이스의 부여 선물을 인정합니다. DB는 NIH (GM046406) 양이 생물학 (GM071508)에 대한 일반적인 의학 센터의 국립 연구소에서 자금 조달을 인정합니다. 우리는 유동 세포 계측법 실험에 대한 지원은 크리스티나 DeCoste을 인정합니다.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |