Denne protokol beskriver en eksperimentel procedure for hurtig opbygning af kunstige transkriptionsfaktorer (ATFS) med beslægtede GFP journalister og kvantificering af ATFS evnen til at stimulere GFP udtryk via flowcytometri.
Syntetisk biologi har til formål at rationelt at designe og bygge syntetiske kredsløb med ønskede kvantitative egenskaber, samt give redskaber til at afhøre strukturen af indfødte styrekredsløb. I begge tilfælde kan evnen til at programmere genekspression i en hurtig og afstemmelige mode, uden off-target effekter, være nyttige. Vi har konstrueret gærstammer indeholdende AKT1 promotor opstrøms for en URA3 kassette efterfulgt af ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor og VP16. Ved at omdanne denne stamme med en lineær PCR produkt, der indeholder et DNA-bindende domæne og vælge imod tilstedeværelsen af URA3 kan en konstitutivt udtrykt kunstig transskriptionsfaktor (ATF) frembringes ved homolog rekombination. ATF-olie manipuleret på denne måde kan aktivere en unik målgen i nærvær af inducer for derved at eliminere både off-target aktivering og ikke-fysiologiske vækstbetingelser findes med almindeligt anvendte conditiOnal genekspressionssystemer. En simpel metode til hurtig konstruktion af GFP reporter plasmider, der reagerer specifikt med et nativt eller kunstig transkriptionsfaktor af interesse er også tilvejebragt.
Udvikling af genetiske switches i gær er af stor interesse i både akademisk og industriel forskning. I det ideelle tilfælde kan genetiske kontakter anvendes til at aktivere et bestemt gen (eller et sæt af gener), når det ønskes af eksperimentatoren. Et gen kodningssekvens anbragt nedstrøms for en syntetisk promotor ikke udtrykkes i fravær af et inducerende molekyle: efter inducer tilsætning genet bør hurtigt udtrykkes. Det er først for nylig blevet påvist, at en sådan kontakt kan manipuleres i gær, hvor der i fravær af inducer, viser stammen en deletion fænotype, men i nærvær af inducer ekspression aktiveret i forhold til niveauet af inducer i alle celler 1,2. Historisk set har betingede ekspressionssystemer i gær var stærkt på næringsstof-responsive DNA-sekvenser, herunder behandling, FO, og GAL initiativtagere (hvis aktiviteter er følsomme over for ekstracellulære niveauer af methionin, fosfat oggalactose, henholdsvis). Mens betinget udtryk kan opnås, det kommer på bekostning af væsentlige pleiotropiske effekter.
Hormon receptorer, såsom de humane østrogen-receptorer har vist sig at være effektive kontakter i eukaryoter 3,4. I fravær af hormon kan et protein fusioneret til en hormonreceptor være afsondret i cytoplasmaet, hvor det interagerer med Hsp90 chaperone kompleks. Efter binding passende ligand receptoren undergår en konformationel ændring, får det til at blive frigivet fra Hsp90 chaperone komplekse og afslørende kernelokaliseringssignalet. At observere localization dynamikken af en bestemt hormon-receptor-indeholdende protein, vi skabt en C-terminal fusion af Gal4dbd.ER.VP16 (GEV et syntetisk transskriptionsfaktor indeholdende Gal4p DNA-bindende domæne, det ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor og VP16) med GFP 2. Kernelokalisering blev observeret inden for 8 minutter efter tilsætning afmættende mængder af inducer, ß-østradiol, som vildtype gær er fuldstændig inaktiv. På dette tidspunkt har de fleste celler har klart synlige aktive transskription sites for GEV target gener (analyseret via fluorescens in situ hybridisering) samt fuldt modne mRNAer 2,5. GEV målgener forøget ekspression> 2-fold mindre end 2,5 min 2,6 (målt ved hjælp af microarrays), hvilket viser, at det tager <2,5 min for det kimære aktivator til at translokere til kernen, binde DNA og aktivere transskription.
Mens flere andre on-switche er blevet anvendt i gær, der udnytter forskellige små molekyler eller narkotika (herunder de klassiske doxycyclin-skifter fra Escherichia coli 7,8 og en indigo-baserede switch 9 fra Arabidopsis thaliana), har ingen opnået den hastighed, specificitet eller trykken for regulering udstillet af hormon-baserede switche. Det er værd at nævne that hurtig off-kontakter er også blevet udviklet i gær, og arbejder typisk ved at fusionere et gen til en protease eller ubiquitinligase targetingsekvens 2,10,11,12. Evnen til hurtigt at fjerne et målprotein fra cellen letter undersøgelse af essentielle gener såvel som gener, der er tilbøjelige til genetisk undertrykkelse når udgår 10.
De i denne protokol beskrevne metoder er til at bygge og karakterisering af syntetiske on-afbrydere i gær. Først viser vi, hvordan hurtigt generere genomically integrerede fusionsproteiner bestående af et DNA-bindende domæne af interesse, det ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor og VP16 (DBD-EV). Efter vores protokol, er fusionsproteinet udtrykt fra en AKT1 promotor. Vi viser derefter, hvordan du opretter en beslægtet reporter plasmid til ATF og teste dens funktionalitet ved hjælp af flowcytometri. Selvom vi forestiller disse reporter plasmider, der anvendes med nye ATF-olie (fig. 1), kan de be anvendes som reportere for en indfødt transkriptionsaktivator såvel. Endelig informationer til at teste effekten af ATF aktivering på cellevækst i 96-brønds plader og for Engineering inducerbare genomiske alleler forudsat.
Hormon-baserede switche beskrevet her har et væld af anvendelsesmuligheder, studere native cellebiologi til at teste evnen af en DNA-bindende domæne af interesse til at målrette en DNA-sekvens in vivo. Systemet har mange positive træk, herunder en gradueret reaktion på inducer, hurtig handling, og stram regulering (dvs.. Nogen målelig utætheder, se figur 7). Imidlertid er der stadig plads til forbedring og udvidelse.
Nyligt arbejde i syntetisk biologi har understreget multiplexing syntetiske systemer og udvide repertoiret af velkarakteriserede, programmerbare DNA dele 16. Independent, betinget udtryk særskilte target gener kræver både flere inducere og DNA-bindende domæner, der mangler overlappende specificitet. Tilgængeligheden af konstruerede og naturligt forekommende receptorer giver et stort sæt af dele, som at udvikle nye kunstige transkriptionsfaktorer. Udvidelse afrepertoire af indbyrdes ortogonale switche er blevet stærkt hjulpet på vej af instrueret evolution nærmer 17,18. Nuværende bestræbelser på at omprogrammere ligand-bindende specificitet af vore kunstige transkriptionsfaktorer vil blive præsenteret i fremtiden.
Tidligere har de fænotypiske konsekvenser af gendeletion / overekspression blevet grundigt undersøgt i gær 19,20. Det har imidlertid ikke været ligetil at undersøge virkningen af ekspression på forskellige fænotyper over et område af ekspressionsniveauer. En primær funktion i systemet, præsenteret heri er dens gradueret karakter (figur 8). Mens ofte antages, kan forholdet mellem genekspression og fænotyper af interesse ikke nødvendigvis være monoton. Kunstige transkriptionsfaktorer, såsom Z 3 EV og Z 4 EV vil gøre opgaven analyse fænotypiske responser på ændringer i genekspression ligetil.
Endelig protokollerne diskutereed i dette manuskript er for teknik og karakterisering af kunstige transkriptionsfaktorer, som reagerer på β-østradiol, men et vigtigt alternativ til kemisk reagerende domæner er brugen af lys-responderende domæner (såsom PhyB/Pif3, LOV, og BLUF) hvis aktiviteter er reversible uden at forstyrre den kultur vækstmediet 21-23. Light-baserede systemer lette Spatiotemporal kontrol af genekspression, protein-protein interaktioner, iontransport, og enzymatisk aktivitet, som allerede har vist kraftig 21-26.
Afslutningsvis har vi præsenteret metoder til hurtig opbygning af inducerbare, kunstige transkriptionsfaktorer i gær. Denne protokol giver en skabelon for deres byggeri i forbindelse med beslægtede GFP journalister, samt metoder til analyse reporter data ved hjælp af flowcytometri og analysere effekten af ATF aktivering på væksten.
The authors have nothing to disclose.
RSM anerkender støtte fra NSF Graduate Research Fellowship. MBN anerkender finansiering fra en Lewis-Sigler Fellowship og begavet gave Peter Lewis. DB anerkender midler fra NIH (GM046406) National Institute of General Medical Sciences Center for Kvantitativ Biologi (GM071508). Vi anerkender Christina DeCoste for assistance med flowcytometri eksperimenter.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |