इस प्रोटोकॉल आत्मीय GFP संवाददाताओं और फ्लो के माध्यम से GFP अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए ATFs क्षमता की मात्रा का ठहराव के साथ कृत्रिम प्रतिलेखन कारक (ATFs) का तेजी से निर्माण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है.
सिंथेटिक जीव विज्ञान के तर्क से डिजाइन और वांछित मात्रात्मक गुणों के साथ सिंथेटिक सर्किट का निर्माण, साथ ही देशी नियंत्रण सर्किट की संरचना से पूछताछ करने के लिए उपकरण प्रदान करना है. दोनों ही मामलों में, कोई बंद लक्ष्य प्रभाव के साथ, एक तेजी से और tunable फैशन में जीन की अभिव्यक्ति कार्यक्रम करने की क्षमता उपयोगी हो सकता है. हम मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर और VP16 के ligand बाध्यकारी डोमेन के बाद URA3 कैसेट की ACT1 प्रमोटर अपस्ट्रीम युक्त खमीर उपभेदों का निर्माण किया है. URA3 की उपस्थिति के खिलाफ एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन और चयन युक्त एक रेखीय पीसीआर उत्पाद के साथ इस तनाव को बदलने के द्वारा, एक रचनात्मक रूप में व्यक्त कृत्रिम प्रतिलेखन कारक (एटीएफ) मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. इस फैशन में इंजीनियर ATFs जिससे बंद लक्ष्य सक्रियण और आमतौर पर इस्तेमाल किया conditi के साथ पाया nonphysiological विकास की स्थिति दोनों को नष्ट करने, inducer की उपस्थिति में एक अनूठा लक्ष्य जीन को सक्रिय कर सकते हैंonal जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों. ब्याज की एक देशी या कृत्रिम प्रतिलेखन कारक के लिए विशेष रूप से जवाब है कि GFP संवाददाता plasmids के तेजी से निर्माण के लिए एक सरल तरीका भी प्रदान की जाती है.
खमीर में आनुवंशिक स्विच का विकास शैक्षणिक और औद्योगिक दोनों अनुसंधान के क्षेत्र में बहुत रुचि है. आदर्श मामले में, आनुवंशिक स्विच प्रयोगकर्ता द्वारा वांछित केवल जब एक विशेष जीन (या जीन का समूह) को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नीचे की ओर एक सिंथेटिक प्रमोटर के रखा एक जीन अनुक्रम कोडन एक उत्प्रेरण अणु के अभाव में व्यक्त नहीं कर रहा है: inducer के अलावा पर जीन तेजी से व्यक्त किया जाना चाहिए. यह केवल हाल ही में इस तरह के एक स्विच inducer के अभाव में, तनाव एक विलोपन phenotype प्रदर्शित करता है, लेकिन inducer की उपस्थिति में, अभिव्यक्ति सभी कक्षों में inducer के स्तर के अनुपात में सक्रिय है जहां खमीर में इंजीनियर हो सकता है कि प्रदर्शन किया गया है 1,2. ऐतिहासिक, खमीर में सशर्त अभिव्यक्ति प्रणालियों मिले, फोटो, और लड़की प्रमोटरों (जिनकी गतिविधियों methionine, फॉस्फेट की बाह्य स्तर के प्रति संवेदनशील हैं, और सहित पोषक तत्व उत्तरदायी डीएनए दृश्यों, पर भारी भरोसागैलेक्टोज, क्रमशः). सशर्त अभिव्यक्ति प्राप्त किया जा सकता है, यह महत्वपूर्ण pleiotropic प्रभाव की कीमत पर आता है.
ऐसे मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के रूप में हार्मोन रिसेप्टर्स यूकैर्योसाइटों 3,4 में प्रभावी स्विच साबित किया है. हार्मोन के अभाव में, एक हार्मोन रिसेप्टर के लिए जुड़े हुए एक प्रोटीन यह Hsp90 निगरानी जटिल के साथ सूचना का आदान प्रदान जहां कोशिका द्रव्य में तनहा किया जा सकता है. उचित ligand बंधन पर, रिसेप्टर यह Hsp90 निगरानी जटिल से जारी होने के कारण और एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत खुलासा, एक गठनात्मक बदलाव आए. एक खास हार्मोन रिसेप्टर युक्त प्रोटीन का स्थानीयकरण गतिशीलता का पालन करने के लिए, हम Gal4dbd.ER.VP16 (GeV, Gal4p डीएनए बाध्यकारी डोमेन, मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर की ligand बाध्यकारी डोमेन युक्त सिंथेटिक प्रतिलेखन कारक की एक सी टर्मिनल संलयन बनाया , और VP16) GFP 2 के साथ. परमाणु स्थानीयकरण के अलावा निम्नलिखित 8 मिनट के भीतर मनाया गयाजो जंगली प्रकार खमीर पूरी तरह निष्क्रिय है, inducer, एसएस estradiol की मात्रा saturating. इस समय तक, कोशिकाओं के बहुमत (सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के माध्यम से assayed) GeV लक्ष्य जीन के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई सक्रिय प्रतिलेखन साइटों के साथ ही पूरी तरह से परिपक्व mRNAs 2,5 है. GeV लक्ष्य जीन यह नाभिक को सरकाना डीएनए बाँध, और प्रतिलेखन सक्रिय करने के लिए <कैमेरिक उत्प्रेरक के लिए 2.5 मिनट लगते हैं कि प्रदर्शन, 2.5 मिनट 2,6 (प्रोटीन का उपयोग करके मापा) के भीतर अभिव्यक्ति> 2 गुना में वृद्धि हुई है.
कई पर स्विच अन्य, कोई भी गति प्राप्त कर ली है (कोलाई Escherichia से क्लासिक डॉक्सीसाइक्लिन आधारित स्विच 7,8 और Arabidopsis thaliana से एक इंडिगो आधारित स्विच 9 सहित) विभिन्न छोटे अणुओं या ड्रग्स का उपयोग कि खमीर में लागू किया गया है, विशिष्टता, या हार्मोन आधारित स्विच द्वारा प्रदर्शित विनियमन की तंगी. यह टी उल्लेख के लायक हैटोपी तेजी से स्विच बंद भी खमीर में विकसित किया गया है, और आमतौर पर अनुक्रम 2,10,11,12 को लक्षित एक प्रोटीज या ubiquitin ligase के लिए एक जीन fusing द्वारा काम करते हैं. तेजी से सेल से एक लक्ष्य प्रोटीन को दूर करने की क्षमता आवश्यक जीन का अध्ययन करने के साथ ही 10 नष्ट कर दिया जब आनुवंशिक दमन से ग्रस्त हैं कि जीन की सुविधा.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों के निर्माण और पर स्विच खमीर में सिंथेटिक निस्र्पक के लिए कर रहे हैं. सबसे पहले, हम तेजी से ब्याज की एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन से मिलकर genomically एकीकृत संलयन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए कैसे दिखा, ligand मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर के डोमेन बंधन, और VP16 (DBD-EV है). हमारे प्रोटोकॉल के बाद, संलयन प्रोटीन एक ACT1 प्रमोटर से व्यक्त किया है. हम तो एटीएफ के लिए एक आत्मीय संवाददाता प्लाज्मिड बनाने और फ्लो का उपयोग कर अपनी कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए दिखा. हम इन रिपोर्टर प्लास्मिड नई ATFs (चित्रा 1) के साथ इस्तेमाल किया जा रहा कल्पना है, वे कर सकते हैं खई के रूप में अच्छी तरह से एक देशी transcriptional उत्प्रेरक के लिए संवाददाताओं के रूप में इस्तेमाल किया. अंत में, 96 अच्छी तरह प्लेटें में सेल के विकास पर एटीएफ सक्रियण के प्रभाव के परीक्षण के लिए और inducible जीनोमिक alleles इंजीनियरिंग के लिए जानकारी प्रदान की जाती है.
यहाँ वर्णित हार्मोन आधारित स्विच विवो में एक डीएनए अनुक्रम को लक्षित करने के लिए ब्याज की एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन की क्षमता का परीक्षण करने के लिए मूल कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने से, असंख्य आवेदन किया है. प्रणाली inducer, तेजी से कार्रवाई की, और तंग विनियमन के लिए एक वर्गीकृत प्रतिक्रिया सहित कई वांछित सुविधाओं, है (यानी. कोई औसत दर्जे का leakiness, 7 चित्र देखें). हालांकि, सुधार और विस्तार के लिए कमरे में अभी भी वहाँ है.
सिंथेटिक जीव विज्ञान में हाल ही में काम बहुसंकेतन सिंथेटिक सिस्टम पर जोर दिया और अच्छी तरह से विशेषता, प्रोग्राम डीएनए भागों 16 के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार किया है. विशिष्ट लक्ष्य जीन की स्वतंत्र, सशर्त अभिव्यक्ति कई inducers और अतिव्यापी विशिष्टता की कमी है कि डीएनए बाध्यकारी डोमेन दोनों की आवश्यकता है. इंजीनियर और स्वाभाविक रूप से होती रिसेप्टर्स की उपलब्धता नया कृत्रिम प्रतिलेखन कारक विकसित करने के साथ जो भागों का एक बड़ा सेट प्रदान करता है. विस्तार करनापरस्पर orthogonal स्विच के प्रदर्शनों की सूची बहुत 17,18 दृष्टिकोण का निर्देशन विकास द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है. हमारे कृत्रिम प्रतिलेखन कारक के ligand बाध्यकारी विशिष्टता reprogram करने के लिए वर्तमान प्रयासों भविष्य में प्रस्तुत किया जाएगा.
इससे पहले, जीन विलोपन / overexpression की प्ररूपी परिणाम बड़े पैमाने पर खमीर 19,20 में अध्ययन किया गया है. हालांकि, यह अभिव्यक्ति के स्तर की एक सीमा से अधिक अलग phenotypes पर अभिव्यक्ति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सरल नहीं किया गया है. इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रणाली के एक प्राथमिक सुविधा अपने वर्गीकृत प्रकृति (8 चित्रा) है. अक्सर ग्रहण करते हैं, जीन अभिव्यक्ति और ब्याज की phenotypes के बीच संबंध जरूरी monotonic नहीं हो सकता है. ऐसे z 3 EV और जेड 4 EV के रूप में कृत्रिम प्रतिलेखन कारक सीधा जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए प्ररूपी प्रतिक्रियाओं परख करने की क्रिया का कार्य करना होगा.
अंत में, प्रोटोकॉल पर चर्चाइस पांडुलिपि के एड इंजीनियरिंग और estradiol β का जवाब है कि कृत्रिम प्रतिलेखन कारक निस्र्पक के लिए हैं, लेकिन, एक महत्वपूर्ण विकल्प रासायनिक उत्तरदायी डोमेन (जैसे PhyB/Pif3, LOV, और BLUF के रूप में) प्रकाश उत्तरदायी डोमेन का इस्तेमाल होता है, जिनकी गतिविधियों संस्कृति मध्यम विकास 21-23 उपद्रव करने के लिए बिना प्रतिवर्ती हैं. प्रकाश आधारित प्रणालियों spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रण, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, आयन परिवहन, और पहले से ही 21-26 शक्तिशाली सिद्ध कर दिया है जो enzymatic गतिविधि, सुविधा.
अंत में, हम खमीर में inducible, कृत्रिम प्रतिलेखन कारक का तेजी से निर्माण के लिए तरीके प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल उनके आत्मीय GFP पत्रकारों के साथ संयोजन के रूप में निर्माण, साथ ही प्रवाह cytometry का उपयोग संवाददाता डेटा का विश्लेषण करने और विकास पर एटीएफ सक्रियण के प्रभाव को परख करने की क्रिया के लिए तरीकों के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
RSM NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप से धन स्वीकार करता है. एमबीएन एक लुईस-Sigler फैलोशिप से धन और पीटर लुईस के संपन्न उपहार स्वीकार करता है. डीबी एनआईएच (GM046406) मात्रात्मक जीवविज्ञान (GM071508) के लिए जनरल मेडिकल साइंसेज सेंटर के राष्ट्रीय संस्थान से धन स्वीकार करता है. हम फ्लो प्रयोगों के साथ सहायता के लिए क्रिस्टीना Decoste को स्वीकार करते हैं.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |