Detta protokoll beskriver en experimentell procedur för snabb konstruktion av artificiella transkriptionsfaktorer (atfs) med besläktade GFP reportrar och kvantifiering av atfs förmåga att stimulera GFP uttryck via flödescytometri.
Syntetisk biologi är att rationellt utforma och bygga syntetiska kretsar med önskade kvantitativa egenskaper, samt ge verktyg för att förhöra strukturen av inhemska styrkretsar. I båda dessa fall kan förmågan att programmera genuttryck på ett snabbt och avstämbar mode, utan ej åsyftade effekter, vara användbara. Vi har konstruerat jäststammar innehållande ACT1 promotor uppströms om en URA3 kassett följt av den ligandbindande domänen i den humana östrogenreceptorn och VP16. Genom att omvandla denna stam med en linjär PCR-produkt som innehåller en DNA-bindande domän och välja mot närvaron av URA3 kan en konstitutivt uttryckt artificiella transkriptionsfaktor (ATF) genereras genom homolog rekombination. Atfs konstruerade på detta sätt kan aktivera en unik målgen i närvaro av inducerare, vilket därigenom eliminerar både off-target aktivering och icke fysiologiska tillväxtförhållanden har hittats med vanligen använda conditional genexpressionssystem. En enkel metod för den snabba uppbyggnaden av GFP reporterplasmider som reagerar specifikt med en nativ eller artificiella transkriptionsfaktor av intresse är också anordnad.
Utveckling av genetiska switchar i jäst är av stort intresse för både akademisk och industriell forskning. I det ideala fallet kan genetiska switchar användas för att aktivera en särskild gen (eller serie av gener) endast när så önskas av försöksledaren. En gen kodande sekvens placerad nedströms en syntetisk promotor uttrycks inte i frånvaro av ett inducerande molekylen: upon inducerare tillsats genen bör snabbt uttryckas. Det har endast nyligen visats att en sådan omkopplare kan konstrueras i jäst, där i frånvaro av inducerare visar stammen en deletion fenotyp, men i närvaro av inducerare, är expression aktiveras i proportion till nivån av inducerare i alla celler 1,2. Historiskt sett har villkorade expressionssystem i jäst förlitade sig på närings lyhörd DNA-sekvenser, inklusive status, FO, och GAL tagare (vars verksamhet är känsliga för extracellulära nivåer av metionin, fosfat ochgalaktos, respektive). Samtidigt kan uppnås villkorligt uttryck, det kommer på bekostnad av betydande pleiotropa effekter.
Hormonreceptorer såsom de humana östrogenreceptorer har visat sig vara effektiva switchar i eukaryoter 3,4. I frånvaro av hormon, kan ett protein smält till en hormonreceptor sekvestreras i cytoplasman, där det interagerar med Hsp90 kaperon komplexet. Vid bindning lämplig ligand, genomgår receptorn en konformationsändring, vilket gör att frigöras från Hsp90 chaperonen komplexa och avslöjar en nukleär lokaliseringssignal. För att observera de lokaliserings dynamiken i ett särskilt hormon-receptor-innehållande protein, skapade vi en C-terminal fusion av Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, en syntetisk transkriptionsfaktor innehållande Gal4p DNA-bindande domän, den ligandbindande domänen av den humana östrogenreceptorn och VP16) med GFP 2. Nukleära lokaliseringsobserverades inom 8 min efter tillsats avmättande mängder av induceraren, beta-östradiol, till vilken vildtyp jäst är helt inerta. Vid denna tid, de flesta celler har klart synliga aktiva transkription platser för GEV mål gener (analyserade via fluorescens in situ hybridisering) samt fullt mogna mRNA 2,5. GEV mål gener ökat uttryck> 2 gånger inom 2,5 min 2,6 (mätt med microarrays), vilket visar att det tar <2,5 min för den chimära aktivator att translokera till kärnan, binder DNA och aktivera transkription.
Medan flera andra på-switchar har tillämpats i jäst som utnyttjar olika små molekyler eller droger (inklusive de klassiska doxycyklin-baserade växlar från Escherichia coli 7,8 och en indigo baserad switch 9 från Arabidopsis thaliana), har ingen uppnådda hastigheten, specificitet, eller täthet av reglering som uppvisas av hormonbaserade växlar. Det är värt att nämna thatt snabba off-switchar har också utvecklats i jäst, och oftast fungerar genom att smälta en gen till ett proteas eller ubiquitin ligas inriktning sekvens 2,10,11,12. Förmågan att snabbt avlägsna ett målprotein från cellen underlättar studiet av essentiella gener samt gener som är benägna till genetisk undertryckande när raderas 10.
De metoder som beskrivs i detta protokoll är för att bygga och karakterisera syntetiskt på-switchar i jäst. Först visar vi hur du snabbt skapar genomiskt integrerade fusionsproteiner som består av en DNA-bindande domän av intresse, ligandbindningsdomänen av mänsklig östrogenreceptorn, och VP16 (DBD-EV s). Efter våra protokoll, är fusionsproteinet uttrycks från en ÄRV1 promotor. Vi visar sedan hur man skapar ett besläktat reporter plasmid för ATF och testa dess funktionalitet med hjälp av flödescytometri. Även om vi ser framför oss de här reporterplasmider används med nya atfs (Figur 1), kan de be används som reportrar för en infödd transkriptionsaktivator också. Slutligen är information för att testa effekten av ATF aktivering på celltillväxt i 96-brunnar och för att iscensätta inducerbara iska alleler tillhandahålls.
De hormonbaserade omkopplare som beskrivs här har otaliga tillämpningar, från att studera nativ cellbiologi för att testa förmågan hos en DNA-bindande domän av intresse att rikta in en DNA-sekvens in vivo. Systemet har många önskvärda funktioner, bland annat en graderad respons på inducerare, snabba åtgärder, och stram reglering (dvs. Ingen mätbar leakiness, se Figur 7). Men det finns fortfarande utrymme för förbättringar och expansion.
Senaste arbete i syntetisk biologi har betonat multiplexering syntetiska system och utöka repertoaren av väl karakteriserade, programmerbara DNA delar 16. Oberoende, villkorsuttryck distinkta mål gener kräver både flera inducerare och DNA-bindande domäner som saknar överlappande specificitet. Tillgängligheten av Engineered och naturligt förekommande receptorer, tillhandahåller en stor uppsättning av delar med vilka för att utveckla nya artificiella transkriptionsfaktorer. Utökarepertoar av inbördes ortogonala switchar har stort stöd genom riktad evolution närmar 17,18. Det pågående arbetet för att programmera om ligand-bindande specificiteten hos våra artificiella transkriptionsfaktorer kommer att presenteras i framtiden.
Tidigare har de fenotypiska konsekvenser gendeletion / överuttryck har studerats utförligt i jäst 19,20. Det har dock inte varit helt okomplicerad att studera effekten av uttryck på olika fenotyper över en rad olika uttrycksnivåer. En primär funktion i systemet som presenteras häri är dess graderade karaktär (Figur 8). Samtidigt som ofta antas, kan förhållandet mellan genuttryck och fenotyper av intresse inte nödvändigtvis vara monoton. Artificiella transkriptionsfaktorer såsom Z 3 EV och Z 4 EV kommer att göra uppgiften att analysera de fenotypiska svar på förändringar i genuttryck okomplicerad.
Slutligen protokollen diskuterared i detta manuskript är till konstruktion och karaktärisering av artificiella transkriptionsfaktorer som svarar på β-östradiol, men ett viktigt alternativ till kemiskt responsiva domäner är användning av ljus-responsiva domäner (såsom PhyB/Pif3, LOV, och Bluf), vars verksamhet är reversibla utan att störa odlingstillväxtmedium 21-23. Ljus-baserade system underlättar spatiotemporal kontroll av genuttryck, protein-proteininteraktioner, jontransport, och enzymatisk aktivitet, som redan har visat kraftfull 21-26.
Sammanfattningsvis har vi presenterat metoder för snabb konstruktion av inducerbara, artificiella transkriptionsfaktorerna i jäst. Protokollet ger en mall för deras konstruktion tillsammans med besläktade GFP reportrar, samt metoder för att analysera reportern data med hjälp av flödescytometri och analysera effekten av ATF aktivering på tillväxt.
The authors have nothing to disclose.
RSM erkänner finansiering från NSF Graduate Research Fellowship. MBN erkänner finansiering från en Lewis-Sigler Fellowship och begåvad gåva av Peter Lewis. DB erkänner finansiering från NIH (GM046406) National Institute of General medicinska vetenskaper Centrum för kvantitativ biologi (GM071508). Vi erkänner Christina DeCoste för hjälp med flödescytometri experiment.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |