Summary
Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.
Abstract
Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden dar lugar a la activación del complemento que resulta en un procedimiento acelerado de aprobación a través de los receptores del complemento en el hígado (hemólisis extravascular) o bien dirigiéndose a la lisis intravascular de los glóbulos rojos. Aloanticuerpos (por ejemplo ABO) o los anticuerpos contra antígenos de glóbulos rojos (como se ve en la anemia hemolítica autoinmune, AHA) que conducen a la activación del complemento son potencialmente dañinas y pueden ser - especialmente cuando se conduce a la lisis intravascular - fatal 1. En la actualidad, la activación del complemento, debido a (auto)-anticuerpos en los glóbulos rojos se evalúa in vitro mediante el uso de la prueba de Coombs reflejando la deposición del complemento en eritrocitos o por un ensayo hemolítico no cuantitativo que refleja RBC lisis 1-4. Sin embargo, para evaluar la eficacia de los inhibidores del complemento, es obligatorio disponer de técnicas cuantitativas. Aquí se describen dos de estas técnicas. En primer lugar, un ensayo para detectar la deposición de C3 y C4 en las células rojas de la sangre que es inducida por anticuerpos en el suero del paciente es preSENTED. Para esto, el análisis FACS se utiliza con anticuerpos anti-C3 o anti-C4 marcados con fluorescencia. A continuación, se describe un ensayo hemolítico cuantitativa. Hemólisis mediada por el complemento En este ensayo, inducida por el suero del paciente se mide haciendo uso de la detección espectrofotométrica de la hemoglobina liberada. Ambos de estos ensayos son muy reproducible y cuantitativo, facilitar los estudios de activación del complemento inducida por anticuerpos.
Introduction
Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden ser inducidos por la transfusión de glóbulos rojos que expresan un antígeno que no está presente en los glóbulos rojos receptores. Estos aloanticuerpos pueden causar reacciones hemolíticas agudas graves de transfusión debido a la activación del complemento en la siguiente transfusión 5. En la anemia hemolítica autoinmune (AHA), los pacientes tienen autoanticuerpos contra sus propios glóbulos rojos. Esto conduce a acelerado de aprobación de las células a través de la interacción de IgG unida a los glóbulos rojos con Fc gamma-receptores en los fagocitos en el bazo y / o en caso de auto-anticuerpos capaces de activar el complemento a través de los receptores del complemento en el hígado 6,7. La activación del complemento fulminante resultando en hemólisis intravascular es raro pero a menudo mortal. Acelerado, complementar destrucción de glóbulos rojos mediada inducida por cualquiera de los resultados de alo-o autoanticuerpos en la anemia aguda y la hipoxia tisular, por tanto, potencialmente fatal. Los auto-anticuerpos en AIHA se clasifican en los anticuerpos fríos y calientes, depending de la temperatura óptima que se unen a los glóbulos rojos (37 ° C o inferior, respectivamente). Los anticuerpos calientes son por lo general de isotipo IgG y los anticuerpos fríos del isotipo IgM 8,9. AIHA puede ser secundaria a trastornos lymphoprolyferative por ejemplo, enfermedades del tejido conectivo, tumores sólidos, infecciones o medicamentos, pero en 50% de los casos AIHA es idiopática 9.
La detección de gammaglobulinas (por ejemplo. IgG o IgM) y complementar unido a glóbulos rojos del paciente se realiza por medio de una prueba de antiglobulina directa semicuantitativa (Coombs) (DAT). En el DAT glóbulos rojos del paciente se incuban con anti-IgG o anti-C3d. Ocurrencia de RBC de aglutinación demuestra la presencia de componentes del complemento adjuntos o unión de IgG. La detección de alo-o autoanticuerpos en el suero del paciente se realiza a través de la prueba de antiglobulina indirecta (IAT). En el IAT, los RBCs de ensayo tratado con bromelaína se incuban con suero de paciente, se lavaron y después se incubaron con anti-hUman IgG. En el caso de los glóbulos rojos han sido sensibilizados con anti-IgG RBC presente en la aglutinación de suero del paciente se producirá. Anticuerpos IgM contra RBC conducirán directamente a la aglutinación tras la incubación de los eritrocitos de prueba bromelina tratados con suero del paciente. RBC aglutinación en la prueba de Coombs directa o en el IAT se evaluó visualmente, ya sea por el ojo en un tubo de ensayo o mediante la carga de la muestra en una columna de Sephadex pequeña separación de los glóbulos rojos aglutinados e individuales por tamaño 1.
Otra técnica utilizada frecuentemente para medir la activación del complemento en los glóbulos rojos es el ensayo hemolítico 1, en el que se evalúa la capacidad de suero del paciente para inducir (mediada por el complemento) hemólisis de los glóbulos rojos tratado con bromelaína 10. La prueba se considera como positiva cuando el sobrenadante después de la centrifugación se tiñe de color rojo debido a la hemoglobina liberada y considera negativa si permanece incoloro. Tanto la prueba de antiglobulina y el ensayo hemolítico son semicuantitativo, puesto que la más alta Serum dilución se denota en el que la prueba es todavía positiva.
La prueba de Coombs y el ensayo hemolítico son ensayos robustos que se utilizan de forma rutinaria en el diagnóstico. Dado que estos ensayos son semicuantitativa y depende de la experiencia del técnico que realiza el ensayo no son adecuados para estudiar las diferencias sutiles de la activación del complemento en eritrocitos, según sea necesario cuando la evaluación de la eficacia de los inhibidores del complemento. Por lo tanto, hemos desarrollado dos ensayos cuantitativos para determinar la activación del complemento por la (auto)-anticuerpos contra los glóbulos rojos, que vamos a describir en este artículo.
En primer lugar, hemos desarrollado un ensayo para medir la deposición de fragmentos de activación de complemento C3 y C4 en glóbulos rojos (Figura 1A). En este ensayo, humanos tratado con bromelaína tipo-0 glóbulos rojos se incuban con suero inactivado por calor paciente (fuente de anticuerpo anti-RBC), suero AB fresco (fuente de complemento) y anticuerpo monoclonal anti-C5 (eculizumab). Durante este Incubation, C3 y C4 deposición se producirá si el suero de paciente contiene complementar la activación de anticuerpos anti-RBC. Con el fin de evitar la lisis de glóbulos rojos por la activación del complemento aguas abajo se añade un anticuerpo monoclonal anti-C5 de bloqueo. Siguiente, C3 y C4 deposición sobre el RBC es detectada por FACS utilizando anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia o fragmentos Fab que reaccionan con C3 y C4, respectivamente. Supresión de un solo RBC es importante para garantizar la fiabilidad de los resultados. Ventajas de esta técnica incluyen que se requiere un pequeño volumen de material del paciente, la activación del complemento en una etapa temprana de la cascada es evaluada y el método es reproducible y cuantitativo. Una ventaja adicional de mirar tanto C3 y C4 es que una distinción se puede hacer entre la activación clásica y de lectina vía (tanto C3 y C4 deposición) y la activación de la vía alternativa (sólo la deposición de C3). El uso de glóbulos rojos tratado con bromelaína en lugar de los glóbulos rojos sin tratar aumenta la sensibilidad de la comodecir.
El segundo ensayo se basa en el ensayo hemolítico utilizado actualmente (Figura 1B). Bromelina tratados Humanos de tipo 0 RBC se incuban con suero inactivado por calor paciente (fuente de anticuerpos anti-RBC) y suero AB fresca (fuente de complemento). Si el complemento se activa por anticuerpos anti-RBC del paciente, se producirá la lisis dependiente de la dosis de glóbulos rojos, lo que conduce a la liberación de hemoglobina. La cantidad de hemoglobina liberada se cuantificó midiendo su absorbancia a 414 nm en el sobrenadante después de centrifugar los glóbulos rojos intactos y fragmentados. La absorbancia se correlaciona con la cantidad de hemólisis producido. En contraste con el ensayo utilizado en la actualidad, este protocolo permite un objetivo, valor cuantitativo de hemólisis que es muy reproducible y no depende de la persona interpretar el ensayo.
Una aplicación de estos métodos ha sido descrita en 11, en el que el uso potencial de C1-inhibidor como inhibidor del complemento en la AIHA era studied.
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Protocol
1. Preparación de los glóbulos rojos tratados con bromelina
- Glóbulos rojos Lave 0 mecanografiadas-3X con PBS 1x (centrifugación a 664 xg durante 2-5 min).
- Incubar 1 volumen de glóbulos rojos empaquetados con dos volúmenes de una solución de bromelina 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
- Se lavan las células 3 veces con 1 × PBS.
- Las células se pueden almacenar como una solución de 3% a 4 ° C en 1x PBS durante al menos una semana.
2. C3 y C4 deposición Análisis en glóbulos rojos por FACS
- Calor-inactivar la cantidad requerida de suero del paciente (u otra fuente de anticuerpo anti-RBC) por calentamiento de la muestra durante 30 min a 56 ° C.
- Lavar los glóbulos rojos tratado con bromelaína tres veces en GVB - (5 mM de veronal, NaCl 150 mM, 0,05% de gelatina de pH 7,4) y resuspender en GVA + + (VBG - + 2 mM de MgCl 2 + CaCl2 10 mM) para dar una solución al 0,5%.
- Pipetear los siguientes componentes en una placa de fondo redondo con una perla de vidrio (fo una mezcla adecuada): 25 mu l 0,5% glóbulos rojos, 37,5 l fresco suero AB (fuente de complemento) y 37,5 l anti-C5 200 g / ml. Anti-C5 es caro y podría ser difícil de obtener. Se podría considerar el uso de suero C5-/C6-/C7- o C8-deficiente en lugar de suero AB y anti-C5.
- Añadir suero de paciente por pocillo a una concentración final de 0,1 a 33%. Corregir las diferencias en concentración de suero por pocillo debido utilizando suero AB inactivado por calor. Añadir GVA + + para obtener un volumen final de 150 l / pocillo. Cerrar la placa con papel de ELISA.
- Incubar 1,5-2 horas a 37 ° C mientras se agita.
- Lavar los eritrocitos tres veces con PBS + 0,5% de BSA (centrifugación a 664 xg durante 2 min).
- Añadir marcadas fluorescentemente anti-C3 y anticuerpos monoclonales anti-C4 o sus fragmentos Fab (para reducir la aglutinación) en PBS + 0,5% de BSA a una concentración final de 1 g / ml. Aquí desarrollado de encargo anti-C3-Alexa Fluor 488 y se usan anti-C4-Alexa Fluor 647 anticuerpos monoclonales, la elección de los these etiquetas fluorescentes permite la detección simultánea de C3 y C4 por FACS.
- Incubar 30-45 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
- Lavar los hematíes 3 veces con PBS + 0,5% de BSA.
- Resuspender los eritrocitos 150 l de PBS 0,5% de BSA y la pipeta en una nueva placa (para deshacerse de las perlas de vidrio antes del análisis FACS).
- Realizar análisis FACS. Células individuales separadas de dobletes en una dispersión de conspirar FSC-A, establecer la puerta de los glóbulos rojos individuales; seleccionar el canal apropiado para la detección de las señales de fluorescencia (por ejemplo, FITC y APC).
- Cuantificar los resultados utilizando la intensidad media de fluorescencia.
Nota: Es posible utilizar un control de isotipo (por ejemplo, etiqueta fluorescente anti-IL-6 IgG1 de ratón). Sin embargo, se recomienda incluir un cierto control negativo, por ejemplo, mediante la incubación de los glóbulos rojos sin suero del paciente (sólo suero AB) o sin una fuente de complemento (suero AB inactivado por calor y suero del paciente inactivado por calor), unad entonces manchar estos con el mismo anti-C3-Alexa Fluor 488 y anti-C4-Alexa Fluor 647 anticuerpos. Esto da un control más válido que un control de isotipo en el caso de las células rojas de la sangre 12, aunque estos diferentes controles suelen dar la misma, resultado negativo.
3. Ensayo hemolítico cuantitativa
- Calor-inactivar la cantidad requerida de sueros de pacientes (u otra fuente de anticuerpo anti-RBC) por calentamiento de la muestra de 30 min a 56 ° C.
- Lavar los hematíes 3 veces con VBG - y una vez con GVA + +.
- Pipetear los siguientes componentes en una placa de fondo redondo con una perla de vidrio (para la mezcla adecuada): 35 l 3% RBC, 25 l fresco suero AB (fuente de complemento) y 1-50% de suero de paciente. Corregir las diferencias en concentración de suero utilizando suero AB inactivado por calor. Añadir GVA + + para obtener un volumen final de 150 l / pocillo. Cerrar la placa con papel de ELISA.
- Incubar a 37 ° C durante 1,5-2 h con agitación.
- Cplaca entrifuge a 664 xg durante 5 min con una reducción de deceleración (p. ej deceleración hasta la parada completa en 2-3 min).
- Cuidadoso pipeteado 90 l sobrenadante en una nueva placa de microtitulación. Es importante en este paso para evitar las burbujas de aire y evitar de tomar a lo largo de las células intactas.
- Mida A414/690 en un espectrofotómetro adecuado.
- Expresar la lisis como un porcentaje de la lisis de los glóbulos rojos con una muestra de agua pura.
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Representative Results
La Figura 2A muestra un gráfico de dispersión representativo de glóbulos rojos. Gating Conveniente para los glóbulos rojos individuales se puede ver en de FSC-W - FSC-Una parcela (P1). Por lo general, alrededor de 95% de los glóbulos rojos caen dentro de esta puerta de P1 (células individuales), pero cuando se utiliza un alto porcentaje de suero del paciente, esto puede caer al 70-80%, especialmente cuando el anti-RBC IgM está presente en el suero del paciente.
Los resultados representativos para el efecto de AIHA suero del paciente sobre la deposición de C4 se muestran en la Figura 2B y sobre la deposición de C3 en la figura 2C. Como puede verse en estas figuras, el suero más paciente conduce a una mayor deposición del complemento, como sería de esperar. Curiosamente, la deposición del complemento se produce en dos picos positivos distintos. Esto probablemente no es causada por la heterogeneidad en la población de glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se han extraído de un solo donante. Seguimos investigando la causa de este fenómeno. Figuras 2D y 2E demostraciónte La reproducibilidad del C4 (Figura 2D) y C3 (Figura 2E) ensayos de deposición. También muestran la amplia variación en la capacidad de deposición del complemento de las diversas muestras de pacientes AIHA.
Un resultado representativo del ensayo hemolítico con una muestra de suero del paciente que contiene AIHA auto-anticuerpos a los glóbulos rojos se puede ver en la Figura 3A. Normalmente, una valoración con una muestra de suero se obtiene un agradable, curva reproducible. Los sueros de paciente varían considerablemente en la capacidad de activación de complemento, por lo tanto realizar una titulación de suero de cada paciente. Las muestras sin suero del paciente por lo general dan un fondo en torno al 10-15%, debido a la absorción por la muestra de suero se utiliza como fuente de complemento. Por lo tanto, se debe tener cuidado de usar una concentración lo suficientemente alta como suero del paciente para obtener una señal que es sustancialmente por encima de este fondo. Con un inhibidor del complemento adecuado como anti-C5, la señal hemolítica puede ser titulada de distancia como se muestra en la Figura 3B.
Figura 1. Visión general esquemática del ensayo C3 y C4-deposición (A) y el ensayo hemolítico cuantitativa (B). En resumen, en el ensayo de deposición de C3 y C4-, complementar inducida por AIHA suero del paciente se mide la deposición, mientras que en la hemólisis ensayo hemolítico inducido por la que se detecta AIHA suero del paciente. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Los resultados representativos para C3 y C4 deposición de unssay. A) sugerido gating estrategia. Aquí se muestra cómo seleccionar sólo a los glóbulos rojos individuales (P1, rojo). Los aglutinados se muestran en verde (P2). B) El efecto de una titulación de AIHA suero del paciente sobre la deposición de C4. El control de isotipo (anti-IL-6 IgG1 de ratón) se muestra como sólido de color gris, mientras que la muestra se muestra en negro. El aumento de la cantidad de suero del paciente conduce a un aumento en la deposición de C4. C) similares como B), pero ahora con la detección para la deposición de C3. D) C4 deposición FACS resultados representados en un gráfico que muestra la reproducibilidad del ensayo y que muestra las diferencias considerables entre muestras de suero de diferentes pacientes. El eje Y representa la intensidad media de fluorescencia. E) Similar a D), pero ahora para la deposición de C3. Haga clic aquí paraver la imagen más grande.
Figura 3. Los resultados representativos para los ensayos hemolíticos cuantitativos. A) AIHA de titulación del suero del paciente en el ensayo hemolítico, que muestran que los aumentos de lisis reproducible con la concentración de suero del paciente. No se produce la lisis con suero sano de donantes (en naranja; control negativo) B) Un inhibidor del complemento adecuado (anti-C5 en este caso) puede abrogar la lisis mediada por el complemento.. Aquí se muestra una titulación de anticuerpos anti-C5, mientras que el suero del paciente AIHA se mantuvo a una concentración constante. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Los ensayos anteriores son reproducibles y robusto. Ellos son fáciles de realizar y es posible llevar a cabo con muchas muestras al mismo tiempo (en una placa de 96 pocillos). Por lo tanto, este enfoque también sería adecuado para un sistema totalmente automatizado, por ejemplo, un sistema de robot de ELISA. En contraste con las técnicas utilizadas actualmente, estos ensayos son cuantitativos y esto ayudará por ejemplo, en el estudio del efecto de inhibidores del complemento. Por otra parte, la interpretación es objetivo, que es una mejora sobre los ensayos utilizados actualmente.
Ambos ensayos tienen un paso crítico. Importante en el análisis FACS es puerta a los glóbulos rojos individuales, porque los glóbulos rojos aglutinados darán una señal artificialmente elevado, ya que se cuentan como un solo evento. Es aún mejor para evitar la aglutinación utilizando bajas concentraciones de suero de pacientes, ya que las concentraciones bajas siguen dando buenas señales. En el ensayo hemolítico, es crucial para transferir cuidadosamente el sobrenadante unaespués de incubación en una nueva placa, ya que el traspaso de los glóbulos rojos dará lugar a una señal poco fiables (como burbujas de aire). Se recomienda el uso de glóbulos rojos 0 tipadas en ambos ensayos para evitar la confusión con la activación del complemento desajuste AB0.
Debido a su fiabilidad y robustez estos ensayos son adecuados para estudiar la eficacia de los inhibidores del complemento para la AIHA como se demuestra en la referencia 11, con el fin de detectar diferencias sutiles cuantitativamente en la activación del complemento. Debido a su sensibilidad de estos ensayos pueden detectar la activación del complemento en pacientes en los que se sugiere fuertemente la activación del complemento en RBC pero no detectada por los ensayos de rutina, tales como en la AIHA de Coombs-negativas, aunque esta declaración todavía requiere la verificación. También pueden ser utilizados para determinar la capacidad de activación de complemento de aloanticuerpos (inducida por transfusión de sangre o por ejemplo en una madre RhD - teniendo un niño RhD +) que podría ayudar al clínico predictivot el comportamiento clínico de un aloanticuerpo detectado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
SZ y DW reciben una subvención sin restricciones de Viropharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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