Summary
Nous décrivons ici deux dosages pour mesurer l'activation du complément induite par des anticorps contre les globules rouges. L'avantage majeur sur les tests actuels est leur nature quantitative et facile à interpréter.
Abstract
Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peuvent conduire à l'activation du complément entraîne une clairance accélérée via les récepteurs du complément dans le foie (hémolyse extravasculaire) ou conduisant à la lyse des globules rouges intravasculaire. Allo-anticorps (par exemple ABO) ou auto-anticorps contre les antigènes RBC (comme on le voit dans l'anémie hémolytique auto-immune, AIHA) conduisant à l'activation du complément sont potentiellement dangereux et peuvent être - surtout quand conduisant à la lyse intravasculaire - fatale 1. Actuellement, l'activation du complément en raison de (auto)-anticorps sur les globules rouges est évaluée in vitro en utilisant le test de Coombs reflétant dépôt du complément sur RBC ou par un dosage hémolytique non quantitative reflétant lyse RBC 1-4. Cependant, pour évaluer l'efficacité des inhibiteurs du complément, il est obligatoire de disposer de techniques quantitatives. Nous décrivons ici deux de ces techniques. Tout d'abord, un dosage pour détecter C3 et C4 sur le dépôt de globules rouges qui est induite par des anticorps dans le sérum du patient est préprésentés. Pour cela, on utilise une analyse par FACS avec anticorps anti-C3 ou C4 anti-marquées par fluorescence. Ensuite, une analyse quantitative hémolytique est décrite. Dans ce dosage, l'hémolyse, médiée par le complément induite par le sérum du patient est mesurée usage de la fabrication de détection spectrophotométrique de l'hémoglobine libérée. Ces deux essais sont très reproductible et quantitative, ce qui facilite les études de l'activation du complément induite par des anticorps.
Introduction
Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peut être induite par la transfusion de globules rouges exprimant un antigène qui n'est pas présent sur les globules rouges de destinataire. Ces allo-anticorps peuvent provoquer de graves réactions transfusionnelles hémolytiques aiguës dues à l'activation du complément sur la transfusion 5 suivant. En cas d'anémie hémolytique auto-immune (AHAI), les patients ont des auto-anticorps contre leurs propres globules rouges. Cela conduit à la clairance accélérée des cellules via l'interaction de l'IgG lié à hématies avec les récepteurs Fcy sur des phagocytes dans la rate et / ou dans les cas d'auto-anticorps capables d'activer le complément par l'intermédiaire de récepteurs du complément dans le foie 6,7. L'activation du complément fulminante résultant de l'hémolyse intravasculaire est rare mais souvent fatale. Accélérée, compléter la destruction des hématies médiation induite soit par des résultats d'allo-ou auto-anticorps dans l'anémie aiguë et une hypoxie tissulaire donc potentiellement mortelle. Les auto-anticorps dans AHAI sont classés dans les anticorps chauds et froids, depending à la température optimale, ils se lient à des globules rouges (37 ° C ou plus bas, respectivement). Les anticorps chauds sont généralement de l'isotype IgG et les anticorps IgM froides de l'isotype 8,9. AIHA peut être secondaire à des troubles lymphoprolyferative par exemple, des maladies des tissus conjonctifs, les tumeurs solides, des infections ou des médicaments, mais dans 50% des cas AIHA 9 est idiopathique.
Détection des gammaglobulines (p. ex. IgG ou IgM) et compléter lié à globules rouges du patient est réalisée au moyen d'un Coombs direct semi-quantitative (Coombs) d'essai (DAT). Dans la DAT globules rouges de patients sont incubés avec des anticorps anti-IgG ou anti-C3d. Présence de RBC agglutination démontre la présence de composants du complément attachés ou liaison de l'IgG. Détection des allo-ou auto-anticorps dans le sérum du patient est réalisée par l'intermédiaire du test de Coombs indirect (IAT). Dans l'IAT, les globules rouges de test bromélaïne traitées sont incubées avec le sérum du patient, lavées puis incubées avec des anticorps anti-human IgG. Dans le cas où les globules rouges ont été sensibilisées avec un anticorps anti-IgG RBC présent dans le sérum du patient d'agglutination va se produire. IgM anti-globules rouges mènera directement à l'agglutination des globules rouges lors de l'incubation de test bromélaïne traités avec le sérum du patient. RBC agglutination dans le test de Coombs direct ou dans le TAI est évaluée visuellement, soit à l'oeil dans un tube à essai ou en chargeant l'échantillon sur une petite colonne de Sephadex séparer les globules rouges agglutinés et simples selon la taille 1.
Une autre technique fréquemment utilisée pour mesurer l'activation du complément sur les globules rouges est le dosage hémolytique 1, dans lequel la capacité du sérum du patient pour induire (médiée par le complément) hémolyse des hématies de bromélaïne traité 10 est évaluée. Le test est noté comme positif lorsque le surnageant après centrifugation est coloré en rouge en raison de l'hémoglobine libérée et considéré comme négatif si elle reste incolore. Tant le test de Coombs et le dosage hémolytique sont semi-quantitative, depuis la plus haute serum dilution est notée dans lequel le test est toujours positif.
Le test de Coombs et le dosage hémolytique sont des tests robustes qui sont couramment utilisés dans le diagnostic. Étant donné que ces tests sont semi-quantitative et en fonction de l'expérience du technicien effectuant le test, ils ne sont pas adaptés à l'étude des différences subtiles de l'activation du complément sur les globules rouges, en fonction des besoins lors de l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs du complément. Par conséquent, nous avons développé deux essais quantitatifs pour déterminer l'activation du complément par (auto)-anticorps de globules rouges, que nous décrirons dans le présent document.
Tout d'abord, nous avons développé un dosage pour mesurer le dépôt de fragments d'activation du complément C3 et C4 sur les globules rouges (figure 1A). Dans cet essai, la bromélaïne traitée humains de type 0 globules rouges sont mis à incuber avec du sérum inactivé à la chaleur du patient (source d'anticorps anti-RBC), de sérum AB frais (source de complément) et anti-C5 anticorps monoclonal (eculizumab). Au cours de cette incubation, C3 et C4 dépôt se produit si le sérum du patient contient de compléter l'activation des anticorps anti-RBC. Afin d'empêcher la lyse RBC par l'activation du complément en aval d'un anticorps monoclonal anti-C5 est ajouté blocage. Ensuite, C3 et C4 sur le dépôt des hématies est détecté par FACS en utilisant des anticorps monoclonaux marqués par fluorescence ou des fragments Fab réagissant avec C3 et C4, respectivement. Déclenchement sur simple globules rouges est important de s'assurer de la fiabilité des résultats. Les avantages de cette technique sont que d'un petit volume de matière du patient est nécessaire, l'activation du complément à un stade précoce de la cascade est évaluée et le procédé est reproductible et quantitative. Un avantage supplémentaire de la recherche à la fois à C3 et C4 est de faire une distinction peut être faite entre l'activation et la lectine voie classique (à la fois C3 et C4 dépôt) et l'activation de la voie alterne (seulement de dépôt C3). L'utilisation d'hématies de bromélaïne traitée au lieu de globules rouges non traités augmente la sensibilité de l'endire.
Le second test est basé sur le dosage hémolytique actuellement utilisée (Figure 1B). Bromélaïne traitée humaines de type 0 globules rouges sont mis à incuber avec du sérum inactivé à la chaleur du patient (source d'anticorps anti-RBC) et du sérum AB frais (source de complément). Si le complément est activé par des anticorps anti-RBC patients, dose-dépendante lyse RBC aura lieu, entraînant la libération de l'hémoglobine. La quantité d'hémoglobine libérée est quantifiée en mesurant son absorbance à 414 nm dans le surnageant après filage en bas des globules rouges intacts et fragmentés. L'absorbance est en corrélation avec la quantité d'hémolyse produite. Contrairement au dosage utilisé actuellement, ce protocole permet à un objectif, la valeur quantitative de l'hémolyse qui est très reproductible et ne dépend pas de la personne qui interprète le dosage.
Une application de ces méthodes a été décrite en 11, où l'utilisation potentielle de C1-inhibiteur comme inhibiteur du complément dans l'AIHA a studied.
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Protocol
Une. Préparation des globules rouges broméline traités
- Globules rouges Laver 0 typées 3x avec 1x PBS (centrifugation à 664 g pendant 2-5 min).
- Incuber 1 volume de globules rouges emballées avec deux volumes d'une solution de broméline à 0,5% pendant 10 min à 37 ° C.
- Laver les cellules 3x avec PBS 1x.
- Les cellules peuvent être stockées sous la forme d'une solution à 3% à 4 ° C dans 1 x de PBS pendant au moins une semaine.
2. C3 et C4 dépôt analyse des globules rouges par FACS
- Inactiver à la chaleur la quantité requise de sérum d'un patient (ou une autre source d'anticorps anti-RBC) en chauffant l'échantillon pendant 30 min à 56 ° C.
- Laver les hématies de bromélaïne traitée trois fois dans VBG - (5 mM véronal, NaCl 150 mM, 0,05% de gélatine, pH 7,4) et les remettre en suspension dans VBG + + (VBG - + 2 mM de MgCl2 + 10 mM de CaCl2) pour donner un solution à 0,5%.
- Introduire à la pipette les éléments suivants dans une plaque à fond rond avec une perle de verre (fou un mélange approprié): 25 pi 0,5% de globules rouges, 37,5 ul de sérum frais AB (en complément) et 37,5 pi 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 est cher et peut être difficile à obtenir. On pourrait envisager d'utiliser du sérum C5-/C6-/C7- ou C8 déficient au lieu de sérum AB et anti-C5.
- Ajouter le sérum du patient par puits à une concentration finale de 0,1 à 33%. Corriger les différences de concentration de sérum par puits en raison utilisant du sérum AB inactivé à la chaleur. Ajouter VBG + + pour obtenir un volume final de 150 pl / puits. Fermer plaque avec une feuille ELISA.
- Incuber 1,5-2 h à 37 ° C tout en agitant.
- Laver les globules rouges trois fois avec du PBS + BSA à 0,5% (centrifugation à 664 g pendant 2 min).
- Ajouter marquées par fluorescence anti-C3 et les anticorps monoclonaux anti-C4 ou leurs fragments Fab (pour réduire l'agglutination) dans du PBS + 0,5% de BSA à une concentration finale de 1 pg / ml. Voici personnalisé développé des anticorps anti-C3-Alexa Fluor 488 et anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorps monoclonaux sont utilisés, le choix de these marqueurs fluorescents permet la détection simultanée de C3 et C4 par FACS.
- Incuber 30 à 45 min à température ambiante avec agitation douce.
- Laver les globules rouges 3x avec PBS + 0,5% de BSA.
- Remettre en suspension les globules rouges 150 pi dans du PBS 0,5% de BSA et la pipette dans un nouveau plateau (pour se débarrasser des perles de verre avant l'analyse FACS).
- Effectuer une analyse FACS. Des cellules individuelles de doublets dans une dispersion de traçage FSC-A; mis la porte sur les globules rouges simples et sélectionnez le canal de détection approprié pour les signaux de fluorescence (par exemple FITC et APC).
- Quantifier les résultats en utilisant l'intensité médiane de fluorescence.
Note: Il est possible d'utiliser un contrôle isotypique (par exemple marqué par fluorescence anti-IL6 souris IgG1). Cependant, il est recommandé d'inclure un véritable témoin négatif, par exemple par incubation de globules rouges sans sérum de patient (seulement de sérum AB) ou en l'absence d'une source de complément (sérum AB inactivé par la chaleur et le sérum du patient inactivé par la chaleur), und puis colorer ces avec le même anti-C3-Alexa Fluor 488 et anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorps. On obtient ainsi un contrôle plus valide que l'isotype contrôle dans le cas de globules rouges 12, bien que ces différents contrôles donnent généralement la même, résultat négatif.
3. Dosage hémolytique quantitative
- Inactiver à la chaleur la quantité requise de sérum du patient (ou une autre source d'anticorps anti-RBC) par chauffage de l'échantillon de 30 min à 56 ° C.
- Laver les globules rouges 3x VBG - et une fois avec VBG + +.
- Introduire à la pipette les éléments suivants dans une plaque à fond rond avec une perle de verre (pour un bon mélange): 35 pi 3% des globules rouges, 25 pl frais sérum AB (en complément) et 1-50% de sérum du patient. Corriger les différences de concentration dans le sérum à l'aide de sérum AB inactivé par la chaleur. Ajouter VBG + + pour obtenir un volume final de 150 pl / puits. Fermer plaque avec une feuille ELISA.
- Incuber à 37 ° C pendant 1,5 à 2 heures avec agitation.
- Cplaque entrifuge à 664 g pendant 5 min avec une décélération réduite (par exemple de décélération pour s'immobiliser dans 2-3 min).
- Pipetage soigneux 90 pi surnageant dans une nouvelle plaque de microtitration. Il est important à cette étape pour éviter les bulles d'air et pour éviter de prendre le long des cellules intactes.
- Mesurer A414/690 dans un spectrophotomètre approprié.
- Exprimer la lyse en pourcentage de la lyse des hématies d'un échantillon avec de l'eau pure.
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Representative Results
La figure 2A montre un nuage de points représentant des globules rouges. Déclenchement adapté pour les globules rouges simples peut être vu dans de FSC-W - FSC Une parcelle (P1). Habituellement, environ 95% des globules rouges entrent dans cette grille de P1 (cellules simples), mais quand un pourcentage élevé de sérum du patient est utilisé, cela peut tomber à 70-80%, en particulier lorsque des IgM anti-RBC est présent dans le sérum du patient.
Les résultats représentatifs de l'effet de AHAI sérum du patient sur le dépôt de C4 sont présentés dans la figure 2B et sur le dépôt de C3 sur la figure 2C. Comme on peut le voir sur ces figures, le sérum des patients de plus conduit à un dépôt plus du complément, comme on pourrait s'y attendre. Curieusement, le dépôt du complément se fait en deux pics positifs distincts. Ce n'est probablement pas dû à l'hétérogénéité de la population RBC, car les globules rouges sont tirés d'un seul donneur. Nous enquêtons toujours sur la cause de ce phénomène. Figures 2D et 2E démonstrationTE la reproductibilité du C4 (figure 2D) et C3 (figure 2E) des dosages de dépôt. Ils montrent également la grande variation de la capacité de dépôt de complément des divers échantillons de patients AIHA.
Un résultat représentatif du test hémolytique avec un échantillon de sérum du patient AIHA contenant des auto-anticorps dirigés contre les globules rouges peut être vu sur la figure 3A. Normalement, un titrage avec échantillon de sérum donne une belle courbe reproductible. Les sérums des patients varient considérablement la capacité de complément, activant, par conséquent effectuer un titrage de chaque sérum du patient. Les échantillons sans sérum de patient donnent généralement un fond autour de 10 à 15% en raison de l'absorption par l'échantillon de sérum utilisé comme source de complément. Par conséquent, il faut prendre soin d'utiliser une concentration suffisamment élevée de sérum du patient pour obtenir un signal qui est nettement supérieur à ce contexte. Avec un inhibiteur du complément approprié comme anti-C5, le signal de hémolytique peut être titré comme représenté sur la distance de Figure 3B.
Figure 1. Aperçu schématique du dépôt dosage C3 et C4 (A) et le dosage hémolytique quantitatif (B). En bref, dans l'essai de dépôt de C3 et C4, de compléter le dépôt induit par le sérum du patient AIHA est mesuré, tandis que dans l'essai d'hémolyse hémolytique induite par le sérum du patient AHAI est détecté. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Les résultats représentatifs pour C3 et C4 dépôt d'uneéssayé. A) suggéré gating stratégie. Montré ici est de savoir comment sélectionner seulement pour les globules rouges simples (P1, rouge). Les agglutinats sont indiquées en vert (P2). B) L'effet d'un titrage d'AHAI sérum du patient sur le dépôt de C4. Le contrôle isotypique (anti-IL6 souris IgG1) est représentée en gris solide, tandis que l'échantillon est affiché en noir. L'augmentation de la quantité de sérum d'un patient conduit à une augmentation de la C4 dépôt. C) analogue à celui de B), mais maintenant avec une détection pour le dépôt de C3. D) C4 dépôt FACS résultats représenté dans un graphique montrant la reproductibilité de l'analyse et de montrer les différences considérables entre des échantillons de sérum provenant de patients différents. L'axe des Y représente l'intensité médiane de fluorescence. E) similaire à celle D), mais maintenant pour le dépôt de C3. Cliquez ici pouragrandir l'image.
Figure 3. Les résultats représentatifs pour les tests hémolytiques quantitatives. A) AIHA de titrage sérique des patients dans l'essai hémolytique, montrant que les augmentations lyse reproductible avec la concentration de sérum du patient. Pas de lyse se produit avec du sérum sain des bailleurs de fonds (en orange; contrôle négatif) B) Un inhibiteur du complément approprié (anti-C5 dans ce cas) peut abroger la lyse médiée par le complément.. Montré ici est un titrage d'anticorps anti-C5 tandis que le sérum du patient AIHA a été maintenu à une concentration constante. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Les dosages ci-dessus sont reproductibles et robuste. Ils sont faciles à réaliser et il est possible de les réaliser avec de nombreux échantillons à la fois (dans une plaque à 96 puits). Par conséquent, cette approche serait également approprié pour un système entièrement automatisé, par exemple un système de robot ELISA. Par contraste avec les techniques actuellement utilisées, ces dosages sont quantitatifs et cela aide par exemple dans l'étude de l'effet des inhibiteurs du complément. En outre, l'interprétation est objective, ce qui est une amélioration par rapport aux dosages utilisés actuellement.
Les deux dosages ont une étape critique. Important dans l'analyse FACS c'est-à-porte sur les globules rouges simples, car les globules rouges agglutinés donneront un signal artificiellement élevé, car ils sont comptés comme un seul événement. Il est même préférable de prévenir l'agglutination en utilisant de faibles concentrations de sérum de patients, puisque les concentrations faibles donnent toujours de bons signaux. Dans l'essai hémolytique, il est essentiel de transférer soigneusement le surnageant unprès avoir incubation dans une nouvelle plaque, puisque report des globules rouges va conduire à un signal fiable (comme les bulles d'air de volonté). Il est recommandé d'utiliser des globules rouges 0 typées dans les deux essais pour éviter toute confusion avec l'activation du complément AB0 de décalage.
En raison de leur fiabilité et la robustesse de ces dosages sont adaptés pour étudier l'efficacité des inhibiteurs du complément pour AIHA comme démontré dans la référence 11, afin de détecter quantitativement les différences subtiles dans l'activation du complément. En raison de leur sensibilité à ces tests peuvent détecter l'activation du complément chez les patients dont l'activation du complément sur RBC est fortement recommandé mais pas détecté par les analyses de routine, comme dans AHAI test de Coombs négatif, si cette déclaration a encore besoin de vérification. Ils peuvent également être utilisés pour déterminer complément capacité d'activation de allo-anticorps (induites par la transfusion de sang par exemple ou dans un RhD - mère portant un enfant RhD +) qui pourrait aider le clinicien à prédictivet le comportement clinique d'un allo-anticorps détectés.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
SZ et DW reçoivent une subvention sans restriction de Viropharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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