Summary
여기에서 우리는 적혈구에 대한 항체에 의해 유도 된 보체 활성화를 측정하기위한 두 가지 분석을 설명합니다. 현재의 분석을 통해 가장 큰 장점은 양적 및 쉬운 해석하는 성격이다.
Abstract
적혈구 (적혈구)에 대한 항체는 간 (혈관 외 용혈) 또는 적혈구의 혈관 내 용해에 이르는 보체 수용체를 통해 가속 정리의 결과로 활성화를 보완하기 위해가 발생할 수 있습니다. 혈관 내 용해 선도 특히 - - 활성화를 보완하기 위해 선도적 인 동종 항체 (자가 면역 용혈성 빈혈, AIHA에서 볼 수있는 것처럼) (예 ABO) 또는 적혈구 항원에 대한자가 항체가 잠재적으로 유해 할 수 있으며 치명적인 1. 현재 인해 적혈구에 (자동) - 항체 활성화를 보완은 RBC 또는 RBC 용해 1-4을 반영하는 nonquantitative 용혈성 분석에 의해 보완 증착을 반영하는 쿰스 테스트를 사용하여 체외에서 평가된다. 그러나, 보체 억제제의 효능을 평가하기 위해, 그것은 정량적 기법을 가지고 필수적이다. 여기에서 우리는 이러한 두 기술에 대해 설명합니다. 첫째, 환자의 혈청에서의 항체에 의해 유도되는 적혈구에 C3 및 C4 증착을 검출하는 분석법이다 사전하고 처리하며. 이를 위해, FACS 분석은 형광 표지 된 항-C3 또는 항-C4 항체로 사용된다. 이어서, 정량 분석 용혈성 설명한다. 환자의 혈청에 의해 유도 된이 분석에 보완 - 중재 용혈이 발표 헤모글로빈의 분광 검출 만들기 사용을 측정한다. 이러한 분석은 모두 항체에 의한 보체 활성화의 연구를 촉진, 재현성과 정량이다.
Introduction
적혈구 (적혈구)에 대한 항체는받는 사람의 적혈구에 존재하지 않는 항원을 발현하는 적혈구의 수혈에 의해 유발 될 수있다. 이러한 알로 - 항체는 다음과 같은 수혈 5에 활성화를 보완에 의한 중증 급성 용혈성 수혈 반응을 일으킬 수 있습니다. 자가 면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 환자는 자신의 적혈구에 대한 자동 항체가있다. 이것은 비장 및 / 또는 간 6,7 보체 수용체 활성화를 통해 보완 할 수 자동 항체의 경우 식세포상의 Fcγ 수용체에 결합하여 적혈구의 IgG의 상호 작용을 통해 세포의 가속 간극에 이르게한다. 혈관 내 용혈의 결과로 전격 보체 활성화는 드물지만 종종 치명적이다. 가속, 급성 빈혈 알로 또는 항체 결과, 따라서 잠재적으로 치명적인 조직의 저산소증 중 하나에 의해 유도 된 매개 RBC 파괴를 보완. AIHA의 자동 항체 dependin, 따뜻하고 차가운 항체로 분류된다그들은 적혈구 (각각 37 ° C 이하)에 바인딩 최적의 온도에 g. 따뜻한 항체의 IgG 아이소 타입의 일반적이며, IgM 항체의 차가운 항체는 8,9 이소. AIHA 예 : lymphoprolyferative 장애, 결합 조직 질환, 고형 종양, 감염이나 약물에 보조 할 수 있지만, 50 %의 경우에 AIHA 특발성 9입니다.
gammaglobulins (예.의 IgG 또는 IgM 항체)의 검출 및 환자의 적혈구에 바인딩 보완은 반 정량적 직접 글로불린 (쿰스) 시험 (DAT)에 의해 수행된다. DAT에서 환자의 적혈구가 항-IgG의 또는 항-C3D와 함께 배양된다. RBC의 응집의 발생이 부착 보완 구성 요소 나 IgG의 바인딩의 존재를 보여줍니다. 알로 - 또는 환자의 혈청 내 항체의 검출은 간접 글로불린 테스트 (IAT)에 의해 수행된다. IAT에서, 브로 멜라 인 처리 테스트 적혈구는 환자의 혈청 배양 세척 한 후 항-H와 함께 배양하는IgG의 우만. 경우 적혈구 방지 RBC의 IgG 환자 혈청 응집에 존재 발생에 민감하게되었습니다. 적혈구에 대한 IgM 항체는 직접 환자의 혈청과 브로 멜라 인 처리 테스트 적혈구의 배양에 응집으로 이어질 것입니다. 직접 쿰스 시험이나 IAT에있는 RBC의 응집은 시각적으로 테스트 튜브에 눈 또는 크기 (1)에 의해 응집 및 단일 적혈구를 분리하는 작은 세파 덱스 컬럼에 샘플을로드하여 하나 평가한다.
적혈구의 보체 활성화를 측정하는 또 다른 자주 사용되는 기술은 브로 멜라 처리 적혈구 10의 (보완 중재) 용혈을 유도하는 환자 혈청의 능력이 평가되는 용혈성 분석 한 것이다. 원심 분리 후 상층 액 인해 출시 헤모글로빈에 빨간색 염색 무색 남아있는 경우 부정적인 것으로 간주 될 때 시험은 긍정적으로 기록됩니다. 글로불린 테스트 및 용혈성 분석 둘, 반 정량적이기 때문에 가장 높은 빼m은 희석 시험 여전히 양성되는 표시된다.
글로불린 테스트 및 용혈성 분석은 정기적으로 진단에 사용되는 강력한 분석이다. 이러한 분석은 반 정량적 및 보완 억제제의 효능을 평가할 때 필요에 따라 그들은 적혈구에 보체 활성화의 미묘한 차이를 연구하기에 적합하지 않은 분석을 수행하는 기술자의 경험에 의존하기 때문이다. 따라서, 우리는 우리가이 글에서 설명 할 것이다 적혈구로 (자동) 항체가 보체 활성화를 결정하는 두 개의 정량 분석법을 개발했다.
첫째, 우리는 적혈구에 보체 C3과 C4의 활성화 조각의 증착 (그림 1A)를 측정 할 수있는 분석을 개발했다. 이 분석에서, 인간의 브로 멜라 인 처리 유형 0 적혈구는 열 불 활성화 된 환자의 혈청 (항 적혈구 항체 원), 신선한 AB 혈청 (보완 소스) 및 안티-C5의 단일 클론 항체 (Eculizumab)와 함께 배양된다. 이 INC 중환자 혈청 안티 RBC 항체를 활성화 보완이 포함 된 경우 ubation, C3와 C4 증착이 발생합니다. 하류 보체 활성화하여 RBC 용해를 방지하기 위해 차단 항-C5 단클론 항체를 첨가한다. 이어서, 적혈구의 C3 및 C4 증착은 각각 C3 및 C4와 반응시켜 형광 표지 된 모노클로 날 항체의 Fab-단편을 사용하여 FACS에 의해 검출된다. 하나의 적혈구에 게이팅 결과의 신뢰성을 확보하는 것이 중요합니다. 이 기술의 이점은 환자 물질의 소량이, 캐스케이드의 조기 활성화를 보완이 평가된다 필요하고 상기 방법은 재현성 및 정량적 인 것을 포함한다. C3와 C4 모두보고의 또 다른 장점은 구별이 클래식과 렉틴 경로 활성화 (C3와 C4 증착 모두) 및 대안 경로 활성화 (만 C3 증착) 사이에 할 수 있다는 것입니다. 대신 치료 적혈구 브로 멜라 인 처리 적혈구의 사용으로 감도를 증가말한다.
두 번째 분석은 현재 사용되는 용혈성 분석 (그림 1B)를 기반으로합니다. 인간 브로 멜라 인 처리 유형 0 적혈구는 열 불 활성화 된 환자의 혈청 (항 적혈구 항체 소스)와 신선한 AB 혈청 (보완 소스)와 함께 배양된다. 보완이 환자 안티 RBC 항체에 의해 활성화되는 경우, 농도 의존적 RBC의 용해는 헤모글로빈의 방출로 이어지는, 발생합니다. 릴리스 된 헤모글로빈의 양이 본래와 단편화 적혈구 회전을 멈추지 후 상등액 414 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량한다. 흡광도가 발생 용혈 량과 상관. 현재 사용 된 분석과는 대조적으로,이 프로토콜은 대물, 재현성 및 분석을 해석하는 사람에 의존하지 용혈의 양적인 값을 허용한다.
이러한 방법의 애플리케이션은 AIHA에서 보체 억제제로서 C1-억제제의 잠재적 인 사용을 해제이었다 (11)에 기재 한 내용tudied.
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Protocol
1. 브로 멜라 인 처리 적혈구의 준비
- 세척 0 형식의 적혈구는 1X PBS (2 ~ 5 분 664 XG에 원심 분리)으로 3 배.
- 37 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 브로 멜라 인 솔루션의 두 개의 볼륨으로 포장 적혈구의 1 볼륨을 품다
- 세포는 1X PBS로 3 배 씻으십시오.
- 세포는 1 주일 이상 1X PBS에서 39 ° C에서 3 % 용액으로 저장 될 수있다.
2. FACS에 의한 적혈구에 C3와 C4 증착 분석
- 56 ℃에서 30 분 동안 샘플을 가열함으로써 환자 혈청의 필요량 (또는 다른 안티 RBC 항체 소스) 열 불 활성화
- (5 mM의 Veronal, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 %의 젤라틴의 pH 7.4)과 VBG는 + +에서 그들을 재현 탁 - VBG에 브로 멜라 인 처리 적혈구를 세 번 씻으십시오 (VBG - + 2 mM의 MgCl2를 2 + 10 mM의 염화칼슘 2)에게주는 0.5 % 용액.
- (F 유리 진주 둥근 바닥 판에 다음과 같은 구성 요소를 피펫또는 적절한 혼합) : 25 ㎕의 0.5 % 적혈구, 37.5 ㎕의 신선한 AB 혈청 (보수 원) 37.5 ㎕를 200 ㎍ / ㎖의 항-C5. 안티-C5는 비싼 구하기 어려울 수 있습니다. 하나는 C5-/C6-/C7- 또는 C8-결핍 혈청 대신 AB 혈청 및 안티-C5를 사용하여 고려할 수 있습니다.
- 0.1-33 %의 최종 농도에 잘 당 환자의 혈청을 추가합니다. 올바른 열 불 활성화 AB 혈청을 사용으로 인해 잘 당 혈청 농도의 차이. 물론 150 μL /의 최종 볼륨을 얻기 위해 VBG + +를 추가합니다. ELISA 호일 닫기 판.
- 흔들리는 동안 37 ° C에서 1.5 시간을 품어.
- PBS + 0.5 % BSA (2 분 664 XG에 원심 분리)과 적혈구 세 번 씻으십시오.
- 추가 형광으로 표지 된 항-C3 및 항-C4 단클론 항체 또는 Fab 단편은 1 ㎍ / ml의 최종 농도로 PBS + 0.5 % BSA에서 (응집을 감소시키기 위하여). 여기에 사용자 정의 앤티 C3-알렉사 플 루어 488 개발 및 안티-C4-알렉사 플 루어 647 단일 클론 항체를 사용, 살전의 선택전자 형광 라벨 FACS에 의해 C3과 C4의 동시 탐지 할 수 있습니다.
- 부드러운 흔들림과 실온에서 30 ~ 45 분을 품어.
- PBS + 0.5 % BSA와 함께 세척 적혈구 배.
- 재현 탁 적혈구 (150) PBS +0.5 %의 BSA의 μL과 (FACS 분석을하기 전에 유리 진주를 제거하는) 새 접시에 그들을 피펫.
- FACS 분석을 수행합니다. 분산하려 FSC-A의 이중선에서 분리 한 세포는, 하나의 적혈구에 게이트를 설정, 형광 신호 (예 : FITC 및 APC)에 대한 적절한 감지 채널을 선택합니다.
- 평균 형광 강도를 사용하여 결과를 정량화.
주 : 이소 타입 컨트롤 (예, 항-IL6 형광 쥐의 IgG1 표지 된)을 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 환자의 혈청 (만 AB 혈청)없이 또는 보완 소스 (열 불 활성화 AB 혈청 및 열 - 불 활성화 된 환자의 혈청)없이 적혈구를 배양하여 예를 들어 진정한 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 좋습니다D 다음 같은 항-C3-알렉사 플 루어 488 및 안티-C4-알렉사 플 루어 647 항체 이러한 얼룩. 이러한 상이한 조절은 일반적으로 동일한, 부정적인 결과를주고 있지만 이것은, 적혈구 (12)의 경우, 이소 제어보다 더 유효하게 제어 할 수 있습니다.
3. 양 용혈성 분석
- 56 ° C에서 샘플 30 분 가열하여 환자의 혈청 필요한 금액 (또는 다른 항 적혈구 항체 소스) 열 불 활성화
- VBG로 세척 적혈구 배 - 한 번 VBG와 + +.
- (적절한 혼합을위한) 유리 진주 둥근 바닥 판에 다음과 같은 구성 요소를 피펫 35 μL 3 % 적혈구, 25 ㎕의 신선한 AB 혈청 (보완 소스) 및 1~50% 환자의 혈청. 열 - 불 활성화 된 AB 혈청을 이용한 혈청 농도의 차이를 보정. 물론 150 μL /의 최종 볼륨을 얻기 위해 VBG + +를 추가합니다. ELISA 호일 닫기 판.
- 진탕 1.5 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- C감소 감속 (2 ~ 3 분에 완전 정지 등 감속)와 5 분 664 XG에 entrifuge 판.
- 조심스럽게 새로운 마이크로 플레이트에 90 ㎕의 상층 액을 피펫. 이 기포를 방지하고 세포 손상을 따라 취할 것을 방지하기 위해이 단계에서 중요하다.
- 적당한 분광 광도계에 A414/690을 측정합니다.
- 순수로 샘플 적혈구의 용해의 비율로 용해를 표현한다.
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Representative Results
그림 2A는 적혈구의 대표 산점도를 보여줍니다. FSC-A 플롯 (P1) - 하나의 적혈구에 적합한 게이트 드 FSC-W에서 볼 수 있습니다. 적혈구의 보통 약 95 %는이 P1 게이트 (단일 세포) 내에 있지만, 환자 혈청의 높은 비율을 사용하는 경우 안티 RBC IgM 항체가 환자의 혈청에 존재 특히,이 70 ~ 80 %로 떨어 뜨릴 수 있습니다.
C4 증착에 AIHA 환자 혈청의 효과에 대한 대표적인 결과는 그림 2B 및 그림 2C에서 C3 증착에 표시됩니다. 이들 도면에서 알 수있는 바와 같이, 예상되는 바와 같이, 더 많은 환자 혈청 자세한 보완 증착에 이르게한다. 이상하게도, 보수 증착은 두 가지 긍정적 인 피크에서 발생합니다. 적혈구가 하나의 기증자로부터 인출되어 있기 때문에 이것은 아마도, RBC 인구의 이질성에 의해 발생하지 않습니다. 우리는 아직이 현상의 원인을 조사하고 있습니다. 2D 및 2E 시연 피규어C4 (그림 2D)와 C3 (그림 2E) 증착 분석의 재현성을 테. 또한 각종 AIHA 환자 샘플의 보수 증착 용량의 편차 폭을 보여준다.
적혈구에 자동 항체를 함유 AIHA 환자 혈청 샘플과 용혈성 분석의 대표적인 결과가도 3a에서 볼 수있다. 일반적으로 혈청 샘플과 적정 좋은 재현 곡선을 얻을 수 있습니다. 환자의 혈청 보체 활성화 능력에 상당히 다양하므로 각각의 환자 혈청의 적정을 수행합니다. 환자의 혈청이없는 샘플은 일반적으로 인해 보완 소스로 사용되는 혈청 시료에 의해 흡수에 배경에게 약 15 %를 제공합니다. 따라서, 치료는 실질적으로 이러한 배경 위에 신호를 구하는 것이 충분히 높은 환자의 혈청 농도를 사용하도록주의해야한다. F에 나타낸 바와 같이 항-C5 같은 적합한 보체 억제제, 용혈성 신호까지는 적정 수igure 3B.
그림 1. C3 및 C4 증착 분석에서 요컨대 C3 및 C4 증착 분석 (A) 및 정량적 용혈성 분석 (B).의 개략적 개요는 AIHA 환자 혈청에 의해 유도 증착을 편안하게는, 측정 용혈성 분석 용혈 내 AIHA 환자의 혈청이 감지에 의해 유도. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. C3와 C4 증착을위한 대표 결과ssay. A) 전략을 게이팅 제안했다. 여기에 표시된 전용 (빨간색 P1) 하나의 적혈구에 선택하는 방법입니다. 응집체가 녹색 (P2)에 표시됩니다. B) C4 증착에 AIHA 환자 혈청의 적정의 효과. 샘플이 검은 색으로 표시되어있는 동안 이소 컨트롤 (안티 IL6 마우스의 IgG1)은 고체 회색으로 표시됩니다. 환자 혈청의 양을 증가시키는 것은 B로 유사 C4 피착. C))의 증가에 이르게하지만 지금 C3 증착 검출로. D) C4 증착 FACS 결과 분석의 재현성을 도시와 상당한 차이를 나타내는 그래프에 도시 다른 환자의 혈청 샘플 사이. Y 축은 D와 유사한) E. 평균 형광 강도를 나타냅니다)하지만 지금은 C3의 증착. 을하려면 여기를 클릭하십시오큰 이미지를 볼 수 있습니다.
그림 3. 보여주는 양적 용혈성 분석 용혈성 분석에서.) AIHA 환자의 혈청 적정, 대표적인 결과가 환자의 혈청 농도 재현성 용해 증가한다. B)이 경우에 적절한 보완 억제제 (항-C5) 보체 매개 용해를 폐지 할 수 있습니다., 더 용해는 (음성 대조군 오렌지) 건강한 기증자의 혈청 발생하지 않습니다. AIHA 환자의 혈청이 일정한 농도로 유지하면서 안티-C5의 적정이 여기에 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
위의 분석을 재현하고 강력한 있습니다. 그들은 수행하기 쉽고 그것이 (96 - 웰 플레이트에서) 동시에 많은 샘플들을 수행 할 수있다. 따라서,이 방법은 ELISA 로봇 시스템 예를 들어, 완전 자동화 된 시스템에 적합하다. 현재 사용되는 기술과 대조적으로, 이러한 분석은 정량적이며 이것은 보체 억제제 효과의 연구에서 예를 도울 것이다. 또한, 해석은 현재 사용되는 분석법에 비해 개선하는 목적이다.
두 분석은 하나의 중요한 단계가있다. 그들은 하나의 이벤트로 계산되기 때문에 응집 적혈구는 인위적으로 높은 신호를 제공하기 때문에 FACS 분석에서 중요, 하나의 적혈구에 게이트입니다. 낮은 농도는 여전히 좋은 신호를 제공하기 때문에 그것은 낮은 환자의 혈청 농도를 사용하여 응집을 방지하기 위해 더 나은입니다. 용혈성 분석에서, 신중 상청액을 전송하는 데있어 매우 중요새 접시에 따고 배양은, 적혈구의 이월 때문에 (뜻 기포 등) 신뢰할 수없는 신호로 이어질 것입니다. 그것은 AB0 불일치 보체 활성화와 혼란을 방지하기 위해 모두 분석에 0 입력 한 적혈구를 사용하는 것이 좋습니다.
때문에 자신의 신뢰성과 견고성 이러한 분석은 참고 11에서와 같이 보체 활성화에 정량적으로 미묘한 차이를 감지하기 위해, AIHA에 대한 보완 억제제의 효능을 연구하기에 적합하다. 이 문은 아직 검증이 필요하지만, RBC에 보체 활성화를 강력하게 제안되는 경우 인해 감도 이러한 분석은 환자의 보체 활성화를 검출 할 수 있지만, 이러한 쿰스 음성 AIHA와 같이 일상적인 분석에 의해 감지되지 않습니다. predic에 임상의를 도움이 될 수 있습니다 - 그들은 또한 (의 RhD + 아이 베어링 어머니 예 수혈 또는의 RhD 유도) 알로 - 항체의 보완 활성화 용량을 결정하는 데 사용할 수 있습니다검출 된 동종 항체의 임상 동작을 t.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
SZ와 DW는 Viropharma의 무제한 허가를받을 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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