Summary
Här beskriver vi två analyser för mätning av komplementaktivering inducerad av antikroppar mot röda blodkroppar. Den stora fördelen över de aktuella analyserna är deras kvantitativa och lätt att tolka naturen.
Abstract
Antikroppar mot röda blodkroppar (RBC) kan leda till komplementaktivering vilket resulterar i en accelererad clearance via komplementreceptorer i levern (extravaskulär hemolys) eller som leder till intravaskulära lys av de röda blodkropparna. Alloantikroppar (t.ex. ABO) eller autoantikroppar mot RBC antigener (som sett i autoimmun hemolytisk anemi, AIHA) leder till komplementaktivering är potentiellt skadliga och kan vara - speciellt när leder till intravaskulära lys - fatal 1. För närvarande, komplementaktivering på grund av (auto)-antikroppar på RBC utvärderas in vitro med hjälp av Coombs test reflekterar komplement nedfall på RBC eller genom en nonquantitative hemolytisk analys avspeglar RBC lys 1-4. Men för att bedöma effekten av komplementhämmare, är det obligatoriskt att ha kvantitativa metoder. Här beskriver vi två sådana tekniker. För det första är pre en analys för att detektera C3 och C4 avsättning på röda blodkroppar som är inducerade av antikroppar i patientserumpresenteras. För detta är FACS-analys används tillsammans med fluorescensmärkta anti-C3-eller anti-C4-antikroppar. Därefter görs en kvantitativ hemolytisk analys beskriven. I denna analys, komplementmedierad hemolys inducerad av patientserum mäts som utnyttjar spektrofotometrisk detektion av den frigjorda hemoglobinet. Båda dessa analyser är mycket reproducerbar och kvantitativ, underlätta studier av antikropp-inducerad komplementaktivering.
Introduction
Antikroppar mot röda blodkroppar (RBC) kan induceras genom transfusion av röda blodkroppar som uttrycker ett antigen som inte finns på mottagarens röda blodkropparna. Dessa allo antikroppar kan orsaka allvarliga akuta hemolytiska transfusionsreaktioner på grund av komplementaktivering på följande transfusion 5. I autoimmun hemolytisk anemi (AIHA), patienter har autoantikroppar mot sina egna röda blodkropparna. Detta leder till snabbare avslut av celler via interaktion av IgG bundet till röda blodkroppar med Fcy-receptorer på fagocyter i mjälten och / eller, i händelse av auto-antikroppar som kan aktivera komplement via komplementreceptorer i levern 6,7. Fulminant komplementaktivering som resulterar i intravaskulär hemolys är sällsynt men ofta dödlig. Accelerated, komplement medierad RBC förstörelse inducerad av antingen allo-eller autoantikroppar ger akut blodbrist och därmed potentiellt dödlig hypoxi. De autoantikroppar i AIHA klassificeras i varma och kalla antikroppar, depending på den optimala temperaturen de binder till röda blodkroppar (37 ° C eller lägre, respektive). De varma antikroppar vanligtvis av IgG isotyp och kalla antikroppar av IgM isotyp 8,9. AIHA kan vara sekundära till t.ex. lymphoprolyferative sjukdomar, bindvävssjukdomar, solida tumörer, infektioner eller droger, men i 50% av fallen AIHA är idiopatisk 9.
Detektion av gammaglobuliner (t ex. IgG-eller IgM) och komplement bundet till patientens RBC genomföres med hjälp av en semikvantitativ direkt antiglobulin (Coombs)-testet (DAT). I DAT patientens röda blodkropparna inkuberas med anti-IgG-eller anti-C3d. Förekomst av RBC agglutination påvisar förekomst av bifogade komplementkomponenter eller IgG-bindning. Detektion av allo-eller autoantikroppar i patientens serum utföres medelst indirekt antiglobulintest (IAT). I IAT är bromelain-behandlade prov RBC inkuberades med patientserum, tvättades och inkuberades sedan med anti-Human IgG. Vid RBC har sensibiliserats med anti-RBC-IgG närvarande i patientens serum agglutination kommer att ske. IgM-antikroppar mot röda blodkroppar kommer direkt att leda till agglutination vid inkubation av bromelain-behandlade prov RBC med patientserum. RBC agglutination i direkt Coombs test eller i IAT är visuellt bedöms antingen genom ögat i ett provrör eller genom att ladda provet på en liten Sephadex kolonn separera agglutinerade och enstaka röda blodkropparna efter storlek 1.
En annan ofta använd teknik för att mäta komplementaktivering på röda blodkroppar är det hemolytiska analysen 1, i vilken kapaciteten hos patientserum för att inducera (komplementmedierad) hemolys av bromelain-behandlade röda blodkroppar 10 bedöms. Testet noteras som positivt när supernatanten efter centrifugering är färgade röda på grund av utsläppt hemoglobin och anses vara negativt om det förblir färglös. Både antiglobulintestet och hemolytiska analysen är semikvantitativ, eftersom den högsta Serum späd betecknas där testet är fortfarande positivt.
Den antiglobulintest och hemolytiska analysen är robusta analyser som rutinmässigt används i diagnostik. Eftersom dessa analyser är semikvantitativ och beroende på erfarenheterna av teknikern som utför analysen de inte är lämpliga att studera subtila skillnader i komplementaktivering på RBC, som behövs vid utvärderingen av effekten av komplementhämmare. Därför utvecklade vi två kvantitativa analyser för att avgöra komplementaktivering av (auto-) antikroppar mot röda blodkroppar, vilket vi kommer att beskriva i denna uppsats.
Först utvecklade vi en analys för att mäta nedfallet av aktiverings fragment av komplement C3 och C4 på röda blodkropparna (Figur 1A). I denna analys är humana bromelain-behandlade typ-0 RBC inkuberades med värmeinaktiverat patientserum (anti-RBC-antikropp-källa), färska AB-serum (komplementkälla) och anti-C5 monoklonala antikroppen (Eculizumab). Under denna incubation kommer C3 och C4 nedfall uppstå om patienten serum innehåller komplement aktivera anti-RBC-antikroppar. För att förhindra att RBC-lys genom nedströms komplementaktivering en blockerande anti-C5 monoklonala antikroppen tillsätts. Härnäst C3 och C4 avsättning på RBCs detekteras genom FACS med användning av fluorescensmärkta monoklonala antikroppar eller Fab-fragment som reagerar med C3 och C4, respektive. Gating på enstaka röda blodkroppar är viktigt att säkerställa tillförlitligheten i resultaten. Fördelar med denna teknik innefattar att en liten volym av patientmaterial krävs, komplementaktivering i ett tidigt skede av kaskaden bedöms och metoden är reproducerbar och kvantitativ. En ytterligare fördel med att titta på både C3 och C4 är att kan man skilja mellan det klassiska och lektin väg aktivering (både C3 och C4 nedfall) och den alternativa vägen aktiveras (endast C3 nedfall). Användningen av bromelain-behandlade röda blodkroppar i stället för obehandlade RBC ökar känslighet somsäga.
Den andra analysen är baserad på den för närvarande använda hemolytiska analysen (Figur 1B). Mänskliga bromelain behandlad typ-0 RBK inkuberas med värmeinaktivpatientserum (anti-RBC antikroppskälla) och färsk AB-serum (komplementkälla). Om komplement aktiveras av patientens anti-RBC-antikroppar, kommer dosberoende RBC lys uppstå, vilket leder till frisättning av hemoglobin. Mängden utsläppt hemoglobin kvantifieras genom att mäta dess absorbans vid 414 nm i supernatanten efter spinning ner de intakta och fragmenterade RBK. Absorbansen korrelerar med mängden uppstått hemolys. I motsats till den för närvarande använda analysen, ger detta protokoll för en objektiv, kvantitativ värde på hemolys som är mycket reproducerbar och inte är beroende av den person som tolkar analysen.
En tillämpning av dessa metoder har beskrivits i 11, där den potentiella användningen av C1-inhibitor som komplementhämmare i AIHA var studied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av bromelain-behandlade röda blodkroppar
- Tvätta 0-typade röda blodkroppar 3x med 1x PBS (centrifugering vid 664 xg under 2-5 minuter).
- Inkubera en volym av packade röda blodkroppar med två volymer av en 0,5% bromelain lösning under 10 min vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna 3x med 1x PBS.
- Cellerna kan lagras som en 3% lösning vid 4 ° C i 1 x PBS under minst en vecka.
2. C3 och C4 Deposition Analys på de röda blodkropparna genom FACS
- Värme inaktivera den erforderliga mängden av patientserum (eller andra anti-RBC-antikropp källa) genom upphettning av provet under 30 min vid 56 ° C.
- Tvätta bromelain-behandlade röda blodkroppar tre gånger i VBG - (5 mM veronalbuffert, 150 mM NaCl, 0,05% gelatin, pH 7,4) och återsuspendera dem i VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl 2) för att ge en 0,5%-ig lösning.
- Pipettera följande komponenter i en rundbottnad platta med en glaspärla (feller korrekt blandning): 25 pl 0,5% röda blodkroppar, 37,5 l färska AB serum (komplementkälla) och 37,5 pl 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 är dyrt och kan vara svårt att få. Man skulle kunna överväga att använda C5-/C6-/C7- eller C8-brist serum istället för AB-serum och anti-C5.
- Lägg patientserum per brunn till en slutlig koncentration av 0,1 till 33%. Korrekt för skillnader i serumkoncentrationen per brunn grund använda värmeinaktiv AB-serum. Lägg VBG + + för att få en slutlig volym av 150 | il / brunn. Stäng platta med ELISA-folie.
- Inkubera 1,5-2 timmar vid 37 ° C under skakning.
- Tvätta RBC tre gånger med PBS + 0,5% BSA (centrifugering vid 664 x g under 2 minuter).
- Lägg fluorescensmärkt anti-C3-och anti-C4-monoklonala antikroppar eller deras Fab-fragment (för att minska agglutination) i PBS + 0,5% BSA till en slutlig koncentration av 1 pg / ml. Anpassade Här utvecklade anti-C3-Alexa Fluor 488 och anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonala antikroppar används, valet av these fluorescerande markörer tillåter samtidig detektion av C3 och C4 genom FACS.
- Inkubera 30-45 min vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Tvätta RBC 3x med PBS + 0,5% BSA.
- Resuspendera RBC 150 ^ i PBS + 0,5% BSA och pipettera dem till en ny platta (för att bli av glaspärlor före FACS-analys).
- Utför FACS-analys. Separata enstaka celler från dubbletter i en scatter rita FSC-A, ställ in porten på de enskilda röda blodkroppar, välj lämplig detekteringskanal för fluorescens signaler (t.ex. FITC och APC).
- Kvantifiera resultat med hjälp av medianfluorescensintensiteten.
OBS: Det är möjligt att använda en isotypkontroll (t.ex. fluorescerande anti-IL6-mus IgG1). Det är dock rekommenderat att inkludera en sann negativ kontroll t.ex. genom inkubation RBC utan patientserum (endast AB-serum) eller utan ett komplement källa (värmeinaktiverat AB-serum och värmeinaktivpatientserum), end sedan färga dem med samma anti-C3-Alexa Fluor 488 och anti-C4-Alexa Fluor 647-antikroppar. Detta ger en mer giltig kontroll än en isotypkontroll i fallet med röda blodkroppar 12, även om dessa olika kontroller ger oftast samma, negativt utfall.
3. Kvantitativ Hemolytisk Assay
- Värme inaktivera den erforderliga mängden av patientsera (eller andra anti-RBC-antikropp källa) genom upphettning av provet 30 min vid 56 ° C.
- Tvätta RBC 3x med VBG - och en gång med VBG + +.
- Pipettera följande komponenter i en rundbottnad platta med en glaspärla (för korrekt blandning): 35 l 3% röda blodkroppar, 25 l färska AB serum (komplementkälla) och 1-50% patientserum. Korrekt för skillnader i serumkoncentrationen med hjälp av värmeinaktiv AB-serum. Lägg VBG + + för att få en slutlig volym av 150 | il / brunn. Stäng platta med ELISA-folie.
- Inkubera vid 37 ° C under 1,5 till 2 h med skakning.
- Centrifuge plattan vid 664 xg under 5 minuter med reducerad retardation (t.ex. retardation till fullt stopp i 2-3 min).
- Försiktigt pipettera 90 | il supernatant i en ny mikrotiterplatta. Det är viktigt vid detta steg för att förhindra att luftbubblor och för att förhindra att ta med intakta celler.
- Mät A414/690 i en lämplig spektrofotometer.
- Uttryck lys i procent av lys av ett prov RBCs med rent vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A visar ett representativt spridningsdiagram för RBK. Lämplig gating för enstaka röda blodkropparna kan ses i de FSC-W - FSC-A plot (P1). Vanligtvis cirka 95% av de röda blodkropparna faller inom denna P1 gate (enstaka celler), men när en stor andel av patientserum används, kan det sjunka till 70-80%, speciellt när anti-RBC IgM är närvarande i patientens serum.
Representativa resultat för effekt av AIHA patientserum på C4 avsättning visas i figur 2B och på C3 avsättning i figur 2C. Som framgår av dessa siffror, leder mer patientserum till mer komplement nedfall, som väntat. Märkligt nog sker komplement nedfall i två distinkta positiva toppar. Detta är antagligen inte orsakats av heterogenitet i RBC befolkningen, eftersom de röda blodkropparna är hämtade från en enda donator. Vi undersöker fortfarande orsaken till detta fenomen. Figurerna 2D och 2E demonstrationste reproducerbarhet C4 (Figur 2D) och C3 (figur 2E) nedfall analyser. De visar också den stora variationen i komplement nedfall kapacitet de olika AIHA patientprover.
Ett representativt resultat av den hemolytiska analysen med en AIHA patientens serumprov innehållande autoantikroppar till röda blodkroppar kan ses i figur 3A. Normalt en titrering med serumprov ger en fin, reproducerbar kurva. Patientsera varierar avsevärt i komplementaktiverande kapacitet, därför utföra en titrering av varje patientserum. Prov utan patientserum ger oftast en bakgrund runt 10-15% på grund av absorption av serumprovet används som komplementkälla. Därför bör man vara noga med att använda en tillräckligt hög patientserum koncentration för att erhålla en signal som är väsentligen ovanför denna bakgrund. Med en lämplig komplementinhibitor som anti-C5, kan det hemolytiska signal titreras bort såsom visas i Figure 3B.
Figur 1. Schematisk översikt av C3-och C4 deponerings assay (A) och den kvantitativa hemolytisk analys (B). Kort sagt, i C3-och C4 deponerings assay, komplement nedfall inducerad av AIHA patientserum mäts, medan det i det hemolytiska analysen hemolys inducerad av AIHA patientserum upptäcks. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Representativa resultat för C3 och C4 nedfall enssay. A) Förslag på slussning strategi. Här visas hur man väljer bara för de enskilda röda blodkropparna (P1, röd). Agglutinaten visas i grönt (P2). B) Effekten av en titrering av AIHA patientserum på C4 nedfall. Den isotypkontroll (anti-IL6-mus IgG1) visas som fast grå, medan provet visas i svart. Ökning av mängden av patientserum leder till en ökning av den C4 avsättning. C) Liknande som B) men nu med detektion för C3 avsättning. D) C4 deponerings FACS-resultat visas i en graf som visar reproducerbarheten av analysen och som visar betydande skillnader mellan serumprover från olika patienter. Y-axeln representerar medianfluorescensintensiteten. E) Liknande som D) men nu för C3 nedfall. Klicka här för attvisa en större bild.
Figur 3. Representativa resultat för de kvantitativa hemolytiska analyser. A) AIHA patientserum titrering i hemolytiska analysen, som visar att de lys ökar reproducerbart med patientens serumkoncentrationen. Ingen lys sker med frisk givare serum (i orange, negativ kontroll) B) Ett lämpligt komplement hämmare (anti-C5 i detta fall) kan upphäva komplementmedierad lys.. Här visas en titrering av anti-C5 medan AIHA patientserum hölls vid en konstant koncentration. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovanstående analyser är reproducerbar och robust. De är lätt att utföra och det är möjligt att utföra dem med många prover samtidigt (i en 96-brunnars platta). Därför skulle detta synsätt också vara lämpliga för ett helautomatiskt system, t.ex. ett ELISA robotsystem. I motsats till de för närvarande använda tekniker, är dessa analyser är kvantitativ och detta kommer att hjälpa till exempel i studien av effekten av komplement-inhibitorer. Dessutom är tolkningen syfte, vilket är en förbättring jämfört med de för närvarande använda analyser.
Båda analyserna har ett avgörande steg. Viktigt i FACS-analys är att gate på de enskilda röda blodkroppar, eftersom agglutinerade röda blodkroppar kommer att ge en konstlat hög signal, eftersom de räknas som en händelse. Det är ännu bättre att förebygga agglutination med låga patientserumkoncentrationer, eftersom låga koncentrationer ger fortfarande goda signaler. I den hemolytiska analysen, är det viktigt att noggrant överföra supernatanten after inkubation in en ny platta, eftersom överföringen av röda blodkroppar leder till en opålitlig signal (vilket kommer luftbubblor). Det rekommenderas att använda 0-typade RBC i båda analyserna för att förhindra förväxling med AB0 mismatch komplementaktivering.
På grund av deras tillförlitlighet och robusthet dessa analyser är lämpliga för att studera effekten av komplementhämmare för AIHA vilket visas i referens 11, för att upptäcka kvantitativt subtila skillnader i komplementaktivering. På grund av deras känslighet dessa analyser kan detektera komplementaktivering hos patienter där komplementaktivering på RBC föreslås starkt men inte upptäcks av de rutinmässiga analyser, såsom i Coombs-negativ AIHA, även om detta uttalande fortfarande kräver verifiering. De kan också användas för att bestämma komplementaktiverande förmåga alloantikroppar (inducerade genom t.ex. blodtransfusion eller i en RhD - mor bär ett RhD + barn) som kan hjälpa läkaren att predict det kliniska beteendet hos en upptäckt alloantikroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
SZ och DW får en obegränsad bidrag på ViroPharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
