Summary
Qui si descrivono due saggi per misurare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.
Abstract
Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) possono portare ad attivazione del complemento con un conseguente approvazione accelerata attraverso recettori del complemento nel fegato (emolisi extravascolare) o portano alla lisi intravascolare dei globuli rossi. Alloanticorpi (ad esempio ABO) o gli anticorpi degli antigeni RBC (come si è visto in anemia emolitica autoimmune, MEA) che portano alla attivazione del complemento sono potenzialmente dannose e possono essere - soprattutto quando conduce alla lisi intravascolare - fatale 1. Attualmente, l'attivazione del complemento a causa di (auto-anticorpi) in globuli rossi viene valutata in vitro utilizzando il test di Coombs riflettendo complemento deposizione su RBC o da un saggio emolitico nonquantitative riflettendo RBC lisi 1-4. Tuttavia, per valutare l'efficacia di inibitori del complemento, è obbligatorio avere tecniche quantitative. Qui descriviamo due tali tecniche. In primo luogo, un test di rilevare C3 e C4 deposizione su globuli rossi che è indotto da anticorpi nel siero del paziente è prepresentate. Per questo, analisi FACS è usato con anticorpi anti-C3 o anti-C4 fluorescente. Accanto, un saggio emolitico quantitativo è descritto. Emolisi In questo saggio, complemento-mediata indotta dal siero del paziente viene misurata facendo uso di rilevazione spettrofotometrica della emoglobina rilasciata. Entrambi questi saggi sono molto riproducibile e quantitativa, facilitando studi di attivazione del complemento anticorpo-indotta.
Introduction
Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) può essere indotta da trasfusione di globuli rossi che esprimono un antigene che non è presente in globuli rossi del destinatario. Questi anticorpi ALLO possono causare gravi reazioni trasfusionali emolitiche acute dovute a completare l'attivazione sul seguente trasfusione 5. In auto-immune anemia emolitica (MEA), i pazienti hanno auto-anticorpi contro i propri globuli rossi. Questo porta alla clearance accelerata delle cellule attraverso l'interazione di IgG legati a globuli rossi con Fcy-recettori sulla fagociti nella milza e / o in caso di auto-anticorpi capaci di attivare il complemento attraverso recettori del complemento nel fegato 6,7. Attivazione del complemento fulminante con conseguente emolisi intravascolare è rara, ma spesso fatale. Accelerata, integrare mediata distruzione RBC indotta da entrambi risultati-allo o autoanticorpi in anemia acuta e ipossia tissutale, quindi, potenzialmente fatale. Gli auto-anticorpi in MEA sono classificati in anticorpi caldi e freddi, depending della temperatura ottimale si legano a RBC (rispettivamente 37 ° C o inferiori,). Gli anticorpi caldi sono generalmente di isotipo IgG e gli anticorpi fredde del isotipo IgM 8,9. MEA può essere secondaria ad es lymphoprolyferative disturbi, malattie del tessuto connettivo, tumori solidi, infezioni o droghe, ma nel 50% dei casi è idiopatica MEA 9.
Rilevamento di gammaglobuline (ad es. IgG o IgM) e complementare legato a globuli rossi del paziente viene eseguita mediante un diretto all'antiglobulina semiquantitativa (Coombs) Test (DAT). Nella DAT globuli rossi del paziente vengono incubati con anticorpi anti-IgG o anti-C3d. Presenza di RBC agglutinazione dimostra la presenza di componenti del complemento montati o IgG vincolante. Rilevamento di-allo o autoanticorpi nel siero del paziente viene eseguita mediante il test indiretto (IAT). Nel IAT, globuli rossi prova bromelina trattati vengono incubati con siero del paziente, lavate e poi incubate con anti-hUman IgG. Nel caso in cui i globuli rossi sono stati sensibilizzati con anticorpi anti-IgG RBC presenti nel agglutinazione siero del paziente si verificherà. Anticorpi IgM anti globuli rossi saranno direttamente portare a agglutinazione su di incubazione di globuli rossi prova bromelina trattati con siero del paziente. RBC agglutinazione nel test di Coombs diretto o in IAT è valutata visivamente sia dall'occhio in una provetta o caricando il campione su una piccola colonna Sephadex separa RBC agglutinate e singoli per dimensione 1.
Un'altra tecnica frequentemente utilizzata per misurare l'attivazione del complemento su globuli rossi è il saggio emolitico 1, in cui viene valutata la capacità del siero del paziente per indurre (complemento-mediata) emolisi dei globuli rossi bromelina trattati 10. Il test è notato come positivo quando il surnatante dopo centrifugazione è macchiato rosso causa emoglobina rilasciata e considerato negativo se rimane incolore. Sia il test antiglobulina e il saggio emolitico sono semiquantitativa, poiché la massima Serum diluizione è indicato in cui il test è ancora positivo.
Il test di Coombs e il saggio emolitico sono test affidabili che sono abitualmente utilizzati nella diagnostica. Poiché questi saggi sono semiquantitativa e dipendente dall'esperienza del tecnico esecuzione del saggio non sono adatti per studiare le sottili differenze di attivazione del complemento di globuli rossi, come necessario quando valutare l'efficacia di inibitori del complemento. Pertanto, abbiamo sviluppato due analisi quantitative per determinare l'attivazione del complemento da anticorpi (auto-) per i globuli rossi, che descriveremo in questo articolo.
In primo luogo, abbiamo sviluppato un saggio per misurare la deposizione di frammenti attivazione del complemento C3 e C4 su globuli rossi (Figura 1A). In questo saggio, bromelina trattati umane di tipo-0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi), siero fresco AB (fonte complemento) e anti-C5 anticorpo monoclonale (Eculizumab). Durante questa incubation, C3 e C4 deposizione si verifica se il siero del paziente contiene completano l'attivazione di anticorpi anti-RBC. Per evitare di lisi da attivazione del complemento a valle viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-C5 blocco. Successivamente, C3 e C4 deposizione sul globuli rossi viene rilevato mediante FACS utilizzando anticorpi monoclonali fluorescente o frammenti Fab-reagiscono con C3 e C4, rispettivamente. Gating sul singolo globuli rossi è importante per garantire l'affidabilità dei risultati. I vantaggi di questa tecnica sono che è necessaria una piccola quantità di materiale paziente, l'attivazione del complemento in una fase iniziale della cascata è valutato e il metodo è riproducibile e quantitativa. Un ulteriore vantaggio di guardare sia C3 e C4 è che una distinzione può essere fatta tra l'attivazione classica e lectina pathway (sia C3 e C4 deposizione) e l'attivazione della via alternativa (solo C3 deposizione). L'uso di GR bromelina trattato invece di eritrociti non trattati aumenta la sensibilità del comedire.
Il secondo saggio è basato sul dosaggio emolitica attualmente utilizzato (Figura 1B). Umani bromelina trattati tipo 0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi) e siero fresco AB (fonte complemento). Se complemento è attivato da anticorpi anti-RBC paziente, si verificherà dose-dipendente di lisi, porta al rilascio di emoglobina. La quantità di emoglobina rilasciata viene quantificato misurando la sua assorbanza a 414 nm nel supernatante dopo la filatura le eritrociti intatti e frammentati. L'assorbanza è correlata alla quantità di emolisi verificato. In contrasto con il dosaggio attualmente in uso, questo protocollo permette un obiettivo, valore quantitativo di emolisi che è molto riproducibile e non dipende dalla persona interpretazione del saggio.
Un'applicazione di questi metodi è stato descritto in 11, in cui l'uso potenziale di C1-inibitore come inibitore del complemento in MEA era studied.
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Protocol
1. Preparazione di bromelina trattati globuli rossi
- Globuli rossi Lavare 0 tipizzate 3x con 1x PBS (centrifugazione a 664 xg per 2-5 min).
- Incubare 1 volume di eritrociti concentrati con due volumi di una soluzione bromelina 0,5% per 10 min a 37 ° C.
- Lavare le cellule 3x 1x PBS.
- Le cellule possono essere memorizzati come una soluzione al 3% a 4 ° C in PBS 1x per almeno una settimana.
2. C3 e C4 Deposizione Analisi su globuli rossi di FACS
- Calore inattivare la quantità necessaria di siero del paziente (o altra sorgente anticorpo anti-RBC) mediante riscaldamento del campione per 30 minuti a 56 ° C.
- Lavare RBC bromelina trattati tre volte in VBG - (5 veronal mM, NaCl 150 mM, 0,05% gelatina pH 7.4) e risospendere in VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl 2 + 10 mM CaCl 2) per dare un soluzione allo 0,5%.
- Pipettare i seguenti componenti in un piatto fondo rotondo con una perla di vetro (fo corretta miscelazione): 25 microlitri 0,5% globuli rossi, 37,5 ml di siero fresco AB (fonte complemento) e 37,5 ml 200 mg / ml anti-C5. Anti-C5 è costoso e potrebbe essere difficile da ottenere. Si potrebbe considerare l'utilizzo di siero C5-/C6-/C7- o C8-deficienti, invece di siero AB e anti-C5.
- Aggiungere siero del paziente per pozzetto per una concentrazione finale di 0,1-33%. Corretto per le differenze di concentrazione sierica per pozzetto dovute utilizzando siero AB inattivato al calore. Aggiungere VBG + + per ottenere un volume finale di 150 microlitri / pozzetto. Chiudi piastra con ELISA pellicola.
- Incubare 1,5-2 ore a 37 ° C sotto agitazione.
- Lavare gli RBC tre volte con PBS + 0,5% BSA (centrifugazione a 664 xg per 2 minuti).
- Aggiungere fluorescente anti-C3 e anticorpi monoclonali anti-C4 o loro frammenti Fab (per ridurre l'agglutinazione) in PBS + 0,5% BSA ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Qui personalizzata sviluppata anti-C3-Alexa Fluor 488 e vengono utilizzati anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorpi monoclonali, la scelta di These le etichette fluorescenti permette la rilevazione simultanea di C3 e C4 da FACS.
- Incubare 30-45 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente.
- Lavare globuli rossi 3x con PBS + 0,5% BSA.
- Risospendere GR 150 microlitri di PBS +0,5% BSA e li pipetta in una nuova piastra (di sbarazzarsi delle perle di vetro prima dell'analisi FACS).
- Eseguire l'analisi FACS. Separare singole cellule da doppietti in una dispersione tracciato FSC-A, impostare la porta sui singoli globuli rossi; selezionare il canale di rilevamento appropriato per i segnali di fluorescenza (ad esempio FITC e APC).
- Quantificare risultati usando l'intensità di fluorescenza mediana.
Nota: E 'possibile utilizzare un controllo isotipico (es fluorescente anti-IL6 topo IgG1). Tuttavia, si raccomanda di includere un vero controllo negativo esempio incubando RBC senza siero del paziente (solo siero AB) o senza una fonte complemento (AB siero inattivato al calore e siero inattivato al calore), und poi macchiare questi con lo stesso anti-C3-Alexa Fluor 488 e anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorpi. Questo dà un controllo più valido di un isotipo di controllo in caso di globuli rossi 12, sebbene questi diversi controlli tipicamente danno lo stesso, esito negativo.
3. Quantitative Assay emolitica
- Calore inattivare la quantità necessaria di sieri dei pazienti (o altra sorgente anticorpo anti-RBC) riscaldando il campione 30 min a 56 ° C.
- Lavare globuli rossi 3x con VBG - e una volta con VBG + +.
- Pipettare i seguenti componenti in un piatto fondo rotondo con una perla di vetro (per una corretta miscelazione): 35 ml 3% globuli rossi, 25 ml di siero fresco AB (fonte complemento) e il siero del paziente 1-50%. Corretto per le differenze di concentrazione del siero utilizzando siero AB inattivato al calore. Aggiungere VBG + + per ottenere un volume finale di 150 microlitri / pozzetto. Chiudi piastra con ELISA pellicola.
- Incubare a 37 ° C per 1,5-2 ore con agitazione.
- CPiastra entrifuge a 664 xg per 5 minuti con la decelerazione ridotta (ad esempio, la decelerazione alla piena fermata in 2-3 min).
- Pipetta con cautela 90 microlitri surnatante in una nuova micropiastra. È importante, in questa fase per evitare bolle d'aria e per evitare di portare con cellule intatte.
- Misurare A414/690 in uno spettrofotometro adeguato.
- Esprimere la lisi come percentuale della lisi di un campione eritrociti con acqua pura.
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Representative Results
Figura 2A mostra un grafico rappresentante dispersione di globuli rossi. Gating Adatto per singoli globuli rossi può essere visto in de FSC-W - FSC-A plot (P1). Solitamente circa il 95% dei globuli rossi rientrano in questa porta P1 (singole cellule), ma quando viene usata una percentuale di siero del paziente, questo può cadere al 70-80%, specialmente quando anti-RBC IgM è presente nel siero del paziente.
Risultati rappresentativi per l'effetto del siero del paziente MEA su C4 deposizione sono mostrati nella Figura 2B e sulla deposizione di C3 in Figura 2C. Come visibile in queste figure, siero più paziente porta a più complemento deposizione, come ci si aspetterebbe. Curiosamente, la deposizione complemento avviene in due picchi positivi distinti. Questo non è probabilmente causato da eterogeneità nella popolazione RBC, dal momento che i globuli rossi sono tratte da un singolo donatore. Stiamo ancora investigando la causa di questo fenomeno. Figure 2D e 2E dimostrazionetE la riproducibilità della C4 (Figura 2D) e C3 (Figura 2E) saggi di deposizione. Essi mostrano anche l'ampia variazione nella capacità complemento deposizione dei vari campioni MEA.
Un risultato rappresentativo del saggio emolitico con un campione di siero MEA contenente autoanticorpi di globuli rossi può essere visto in Figura 3A. Normalmente, una titolazione con il campione di siero produce una bella curva riproducibile. Sieri dei pazienti variano notevolmente in complemento attivazione capacità, quindi eseguire una titolazione di ciascun siero del paziente. I campioni senza siero del paziente di solito danno un fondo circa il 10-15% a causa dell'assorbimento da parte del campione di siero utilizzato come sorgente di complemento. Pertanto, occorre prestare attenzione a utilizzare una sufficientemente elevata concentrazione nel siero del paziente per ottenere un segnale che è sostanzialmente sopra questo sfondo. Con un inibitore del complemento adatto come anti-C5, il segnale emolitica può essere titolato via come illustrato in FIGURA 3B.
Figura 1. Schema della deposizione dosaggio C3-C4 e (A) e il saggio emolitico quantitativa (B). In breve, nel saggio deposizione C3-C4 e, complemento deposizione indotta dal siero del paziente MEA è misurata, mentre nel saggio emolisi emolitica indotta dal siero del paziente viene rilevato MEA. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Risultati rappresentativi per C3 e C4 deposizione unssay. A) consigliato gating strategia. Indicato qui è come selezionare solo per i singoli globuli rossi (P1, rosso). Le agglutinati sono visualizzati in verde (P2). B) L'effetto di una titolazione di siero del paziente MEA su C4 deposizione. L'isotipo di controllo (anti-IL6 topo IgG1) è indicata come solido grigio, mentre il campione appare in bianco. Aumentando la quantità di siero del paziente porta ad un aumento nella deposizione C4. C) simili come B) ma ora con rilevamento per deposizione di C3. D) C4 deposizione FACS risultati rappresentata in un grafico che mostra la riproducibilità del dosaggio e mostrando le notevoli differenze tra i campioni di siero di pazienti diversi. L'asse Y rappresenta l'intensità di fluorescenza mediana. E) simili come D), ma ora deposizione di C3. Clicca qui pervedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Risultati rappresentativi per le analisi quantitative emolitiche. A) MEA titolazione del siero del paziente nel saggio emolitica, che dimostrano che la lisi aumenta riproducibile con la concentrazione di siero del paziente. Nessuna lisi avviene con siero donatore sano (in arancio; controllo negativo) B) Un inibitore del complemento idoneo (anti-C5 in questo caso) può abrogare lisi mediata dal complemento.. Qui è una titolazione di anticorpi anti-C5, mentre il siero del paziente MEA è stato mantenuto ad una concentrazione costante. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
I dosaggi di cui sopra sono riproducibili e robusto. Essi sono di facile esecuzione ed è possibile effettuare loro con molti campioni Allo stesso tempo (in una piastra a 96 pozzetti). Pertanto, questo approccio sarebbe idoneo per un sistema completamente automatico, ad esempio un sistema robot ELISA. Contrariamente alle tecniche attualmente utilizzate, questi test sono quantitative e questo permette, ad esempio nello studio degli effetti di inibitori del complemento. Inoltre, l'interpretazione è obiettivo, che è un miglioramento rispetto ai dosaggi attualmente utilizzati.
Entrambi i test hanno un passo critico. Importante per l'analisi FACS è quello di porta sui singoli globuli rossi, perché i globuli rossi agglutinati darà un segnale artificialmente elevato, in quanto sono considerati come un evento. E 'ancora meglio prevenire agglutinazione utilizzando basse concentrazioni di siero, dal momento che basse concentrazioni ancora dare buoni segnali. Nel saggio emolitico, è fondamentale per trasferire accuratamente il supernatante unopo l'incubazione in una nuova piastra, dato che riporto di GR porterà ad un segnale inaffidabile (come bolle d'aria). Si consiglia di utilizzare globuli rossi 0 tipizzate in entrambi i saggi per evitare confusione con AB0 mancata corrispondenza attivazione del complemento.
Grazie alla loro affidabilità e robustezza questi test sono adatti per studiare l'efficacia di inibitori del complemento per MEA come dimostrato in riferimento 11, al fine di rilevare le differenze quantitativamente sottili attivazione del complemento. Grazie alla loro sensibilità questi saggi possono rilevare l'attivazione del complemento in pazienti in cui l'attivazione del complemento su RBC è fortemente consigliata ma non rilevato dai saggi di routine, come in MEA Coombs-negativo, anche se questa affermazione richiede ancora verifica. Possono anche essere utilizzati per determinare l'attivazione del complemento capacità di allo-anticorpi (indotti da trasfusione di sangue ad esempio, o in un Rh - madre portava un bambino Rh +), che potrebbe aiutare il clinico di predizionet il comportamento clinico di un alloanticorpo rilevato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
SZ e DW ricevono una sovvenzione illimitata di Viropharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
