Summary
אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) מהווה שכבה חזקה של ויסות הגנים על ידי המנחה RISC למקד לאתרים הממוקמים על mRNAs וכתוצאה מכך, על ידי ויסות דיכוי translational שלהם. שינויים בביטוי מירנה הוכחו להיות מעורבים בפיתוח של כל המחלות מורכבות הגדולות. יתר על כן, הממצאים אחרונים הראו כי יכול להיות מופרש miRNAs לסביבה תאית ולהיכנס למחזור הדם ונוזלי גוף אחרים שבו הם יכולים להסתובב עם יציבות גבוהה. הפונקציה של miRNAs במחזור כזה נשארה במידה רבה חמקמקה, אבל גישות שיטתיות תפוקה גבוהה, כגון מערכי פרופיל מירנה, יש להוביל לזיהוי של חתימות מירנה בכמה מצבים פתולוגיים, כוללים הפרעות ניווניות ומספר סוגים של סרטן. בהקשר זה, את זיהוי של פרופיל ביטוי מירנה בנוזל השדרה, כפי שדווח במחקר שנערך לאחרונה שלנו, הופך את המועמדים אטרקטיביים miRNAs לניתוח סמן ביולוגי.
_content "> ישנם מספר כלים זמינים לאפיון מיקרו RNA, כגון microarrays, כמותיים בזמן אמת PCR (qPCR), ורצף עמוק. כאן אנו מתארים שיטה רגישה לפרופיל מיקרו RNA בנוזלי המוח והשדרה על ידי בזמן אמת PCR כמוני. השתמש בפנלי האדם PCR Exiqon microRNA מוכנים לשימוש I ו-II V2.R, המאפשר זיהוי של מיקרו RNA האנושי 742 הייחודי. ביצענו מערכים בריצות בשלושה עותקים ועבדנו וניתחנו נתונים באמצעות תוכנת Genex המקצועית 5.באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו צדודית בהצלחה מיקרו RNA בסוגים שונים של שורות תאים ותאים ראשוניים, CSF, פלזמה, וברקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין.
Introduction
מיקרו RNA שייך למשפחתו של קטן (21-23 NT באורך) noncoding RNAs המווסתים את ביטוי הגנים שלאחר תעתיק. יכול להיות מופרש מיקרו RNA במרחב תאי שבו הם נראים יציבים יחסית. תוך קביעת שינויים בביטוי מירנה יכולה להיות צעד חשוב לקראת זיהוי של סמנים ביולוגיים, ביצוע פרופילי מירנה וטיפול בכמות גדולה של נתונים עלולים להיות מפחיד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע שינויים בביטוי מירנה בנוזל המוח והשדרה (החלים על נוזלי גוף אחרים) על ידי בזמן אמת רגיש ה-PCR. אנו גם מתארים את השימוש בתוכנות לניתוח נתונים, כוללים ניתוח סטטיסטי וייצוג גרפי של תוצאות. התהליך כולו הוא קל ופשוט יחסית, ותלוי במספר דגימות להיות צדודית ומספר מכונות PCR בזמן אמת זמין, גם מהיר יחסית. החלק הניסיוני דורש דיוק בטיפולרנ"א וpipetting לתוך צלחות 384 גם, ואילו סעיף ניתוח נתונים באמצעות Genex דורש קצת ידע בסיסי באינפורמטיקה ונתונים סטטיסטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך הסטנדרטי לבודד RNA ממייקרו RNA CSF והפרופיל באמצעות צלחות PCR מוכנות. שים לב שמיצוי השלב האורגני הוא אופציונלי, וכי רנ"א ספק מתווסף למדגם במהלך החילוץ להבטיח התאוששות מקסימלי של רנ"א. כתוצאה מכך, אין צורך לכמת את RNA.
בסך הכל, ממוצע של 6-8 צלחות ניתן להפעיל ביום אחד אם cDNA מסונתז ביום שלפני (כ 2 שעות). ניתוח של הנתונים מתבצע כאשר כל הדגימות היו צדודית ונטענות לתוך התוכנה. בהתאם למספר דגימות / קבוצות או השילוב שלהם, לצורך השוואה, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות.
1. RNA חילוץ
מיצוי RNA בוצע דגימות CSF, לאחסן קפוא ב -80 מעלות צלזיוס בaliquots עד לניתוח. להליך זה הייתה בשימוש בערכת בידוד mirVana פריז, בעקבות instru של היצרןctions לסך בידוד RNA. שים לב, כי על אף העשרה למיני RNA קטנים אפשרית עם ערכה זו, בשלב זה לא נעשה והליך מיצוי RNA הוא הסתיים לאחר בסך הכל צעד בידוד RNA. בנוסף, למרות שערכת mirVana פריז הבידוד (כמו ערכות בידוד RNA זמינות מסחרי אחרות) אינה דורשת מיצוי אורגני, ניתן למצוא בפרוטוקול בהליך זה בהמשך.
הפרוטוקול להפקת RNA מורכב משני שלבים:
1.1. הפקה אורגנית (לא נדרש אם באמצעות ערכת חילוץ RNA mirVana פריז)
1.2.2. בידוד RNA סה"כ
1.1. מיצוי אורגני
1.1.1. הכן את חומרים כימיים
- הוספת 375 μl של 2-mercaptoethanol ל2x denaturing פתרון, ולאחסן אותו ב 4 ° C.
1.1.2. הכן את CSF
- הפשירו כל aliquot של CSF על קרח לפני מיצוי RNA. הוסף 1 מיקרוגרם של ספק RNA MS2 ל0.5 מיליליטר של CSF מופשר ובעדינותלערבב. שים לב שאם המיצוי האורגני מושמט, מוביל MS2 יתווסף למדגם בידוד RNA לפני שמתואר ב1.2.2.1 להלן.
- מערבבים 0.5 מיליליטר של 2x denaturing פתרון בטמפרטורת חדר כדי CSF.
- הוסף 1 מיליליטר של חומצת פנול: כלורופורם לCSF בתוספת 2x denaturing הפתרון: הקפד נסוג השלב התחתון המכיל חומצת פנול: כלורופורם, לא חיץ המימית שנמצאת בחלק העליון של התערובת. בנוסף, שים לב שחומצת פנול: כלורופורם מכיל פנול, שהוא רעל ומגרים, כפפות ושימוש בציוד מגן אישי אחר כאשר עובדים עם מגיב זה.
- וורטקס למשך 30-60 שניות כדי לערבב. להנוחיות, 2 מיליליטר של מדגם / denaturing פתרון / חומצת פנול: כלורופורם תמהיל מחולק לשני צינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות המרבית (10,000 XG) בטמפרטורת חדר.
- מוציא בזהירות את השלב המימית (העליון) מבלי להפריע את השלב הנמוך או ביניים ולהעביר אותוצינור טרי. הערה הנפח התאושש.
1.2. בידוד RNA
מומלץ לי ספסל ייעודי, קבוצה של טפטפות, ומדפים לטיפול בדגימות רנ"א. אזור העבודה והכלים לחטא באמצעות תרסיס RNase זאפ ומנגב לפני כל ניסוי.
1.2.1. הכן את חומרים כימיים:
- הוספת 21 מיליליטר של אתנול 100% למירנה לשטוף פתרון 1 ואתנול 40 מיליליטר של 100% לשטוף פתרון 2/3. שים לב שמירנה לשטוף פתרון 1 מכיל thiocyanate guanidium שהוא חומר שעלול להיות מסוכן.
1.2.2. בידוד RNA סה"כ
- הוסף 1.25 כרכים של טמפרטורת חדר אתנול 100% לשלב מימיים ממיצוי האורגני ומערבבים היטב.
- הנח מחסנית מסנן לתוך אחד צינורות האיסוף.
- פיפטה לא יותר מ -700 μl של תערובת lysate / אתנול על פילטר.
- צנטריפוגה במשך 30 שניות במקסימוםמהירות. החל את התערובת עולה 700 μl ביישומים רצופים לאותו מסנן. מחק את הזרימה דרך אחרי כל צנטריפוגה ולשמור את צינור האיסוף לשלבי הכביסה.
- החל 700 μl מירנה לשטוף פתרון 1 למחסנית הסינון וצנטריפוגות במשך 15 שניות במהירות המרבית. מחק את הזרימה דרך מצינור האיסוף ולהחליף את מחסנית המסנן לתוך אותו צינור האיסוף.
- החל 500 μl לשטוף פתרון 2/3 ו צנטריפוגות במשך 15 שניות במהירות המרבית. מחק את הזרימה דרך מצינור האיסוף ולהחליף את מחסנית המסנן לתוך אותו צינור האיסוף. החל 500 μl שני לשטוף פתרון 2/3 ו צנטריפוגות במשך 15 שניות במהירות המרבית. מחק את הזרימה דרך מצינור האיסוף ולהחליף את מחסנית המסנן לתוך אותו צינור האיסוף. ספין ההרכבה 1 דקות במהירות המרבית כדי להסיר את הנוזלים שנותרו במסנן.
- העבר את מחסנית המסנן לתוך צינור אוסף טרי. החל 100 & mu; ליטר של (ל95 מעלות צלזיוס) nuclease ללא מים חוממו מראש למרכז של המסנן, ולסגור את המכסה. צנטריפוגה במשך 30 שניות במהירות המרבית כדי לשחזר את רנ"א.
- לאסוף RNA eluate מכיל ולאחסן אותו ב-80 ° C ליישומים שלאחר מכן.
- לכמת 1 μl של רנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר 2000C NanoDrop. שים לב שכימות RNA ניתן לדלג אם ספק RNA יתווסף למדגם במהלך מיצוי RNA. במקרה זה 8 μl של RNA חשופים לסינתזת cDNA כמפורט להלן.
2. פרופיל מירנה: qRT-PCR פרוטוקול
הפרוטוקול לפרופיל מירנה מורכב משני שלבים:
- סינתזת cDNA גדיל הראשונה
- הגברה PCR בזמן אמת
2.1. סינתזת cDNA גדיל הראשונה
2.1.1. לדלל RNA תבנית
- התאם כל אחת מהדגימות RNA התבנית לריכוז של 5 ng / μl שימוש במי nuclease חינם. אםRNA לא היה לכמת (ראה שלב 1.2.2.9), ולאחר מכן 8 μl של RNA מנוצלים לסינתזת cDNA
2.1.2. הכן את חומרים כימיים
- בעדינות להפשיר את מאגר תגובת 5x וnuclease מים חופשיים, ומייד מניח על קרח.
- מערבבים על ידי vortexing. Resuspend RNA ספייק-במים על ידי הוספה בחינם 40 nuclease μl לצינור ומערבבים על ידי vortexing; להשאיר אותו על קרח למשך 15-20 דקות. מייד לפני השימוש, הסר את תערובת האנזים מהמקפיא, לערבב על ידי מצליף את הצינורות ומניח על קרח. ספין למטה את כל חומרים כימיים.
2.1.3. הגדרת תגובת שעתוק לאחור
- הכן את הכמות הנדרשת של פתרון עובד RT בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf, או שווה ערך (בפרופורציות מפורטות בטבלה 1, פרט לתבנית RNA), מערבב על ידי vortexing (שניות 1-2 במהירות מקסימלית), ספין למטה בקצרה ( אנו משתמשים בצנטריפוגה Eppendorf מיני עם מהירות קבועה, 10 שניות) ולמקם אותו על קרח. שימו לב שספייק RNA UniSp6ב מתווסף למדגם לפני תגובת RT (ראה טבלה 1).
- לוותר על פתרון עובד RT לתוך צינורות PCR nuclease חינם.
- לוותר RNA תבנית בצינור אחד.
הערה: אל תשכח לחשב 10% נפח עודף / כל מגיב לpipetting ו / או נפח מת רובוטית.מגיב לוח כרך (μl) לוחי + כרך ב '(μl) מאגר תגובת 5x 4.4 8.8 מים nuclease חופשי 9.9 19.8 תערובת אנזים 2.2 4.4 UniSp6 RNA ספייק-בתבנית 1.1 2.2 רנ"א הכל התבנית (5 ng / μl) 4.4 8.8 r>נפח כולל 22 44
טבלת 1. הפוך התקנת תגובת שעתוק.
2.1.4. מערבבים וספין ריאגנטים
- מערבבים את התגובה על ידי vortexing העדין (1-2 שניות) כדי להבטיח שכל חומרים כימיים מעורבבים היטב. לאחר הערבוב, ספין למטה (צנטריפוגות אפנדורף המיני עם מהירות קבועה, 10 שניות).
2.1.5. דגירה ולהשבית חום
- לתכנת מכונה ה-PCR כדלקמן:
- דגירה של 60 דקות על 42 מעלות צלזיוס
- חום להשבית טרנסקריפטאז ההפוך למשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס
- מייד לצנן עד 4 מעלות צלזיוס
- חנות ב 4 מעלות צלזיוס או הקפאה
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מופרע בשלב זה. CDNA חי יכול להיות כל הזמן ב-20 מעלות צלזיוס לתקופה של עד 5 שבועות (אופציונלית חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים).
class = "jove_step"> 2.2. הגברה PCR בזמן אמת
2.2.1. הכן ריאגנטים עבור Real-Time PCR
- הנח cDNA (מצעד 2.1.5) על קרח.
- תמהיל הפשרת nuclease מים חופשיים ומאסטר PCR על קרח. להגן על בקבוקוני תמהיל מאסטר PCR מהאור על ידי מכסה אותם ברדיד אלומיניום. מייד לפני השימוש, לערבב את תערובת מאסטר PCR ידי vortexing 1-2 שניות בצנטריפוגה מיני ספין למטה ב1,500 XG דקות 1.
2.2.2. שלב SYBR תערובת ירוקה הורים, מים, וcDNA ולהוסיף לצלחות PCR
ההליך הבא מומלץ להימנע מריכוזים נמוכים של cDNA מהקפדה על פני השטח צינור:
- לפני הסרת חותם הצלחת, ספין בקצרה את הצלחת (ים) בצנטריפוגה בקירור ב1,500 XG דקות 1.
- בצינור חרוטי 15 מיליליטר, לשלב 2x תמהיל מאסטר PCR ומים. לוחי: 2,000 μl תערובת הורים 2x ו1,980 מים μl; לוח I + II: 4,000 μl תערובת ההורים 2x ו3,960 μ; מים ליטר.
- הוסף 20 cDNA μl (אני פנל) או cDNA 40 μl (פנל I + II) ומערבבים.
- מערבבים בעדינות על ידי vortexing 1-2 שניות וספין למטה בצנטריפוגה בקירור ב1,500 XG דקות 1.
- הנח את ה-PCR מיקס מאסטר / cDNA לערבב במאגר פיפטה רבה. ייתכן שיהיה צורך לזהות מאגר שיש לו את אורכו של פיפטה הרבה. הדבר זה שומר את רמת עוצמת הקול הגבוהה מספיק ומאפשר לaliquots נפח שווים לאורך רבת ערוצים. זה קריטי לכיוון כמה aliquots האחרונים.
- לוותר 10 μl תמהיל מאסטר PCR / cDNA לערבב היטב בכל הצלחת 384 גם באמצעות פיפטה 16 ערוצים.
- חותם את הצלחת עם איטום אופטי.
- ספין צלחת בקצרה בצנטריפוגה בקירור (1,500 XG במשך 1 דקות), כדי לערבב את הפתרונות ולהסיר בועות אוויר.
הערה: הניסוי יכול להיות מושהה בשלב זה. אחסן את התגובות מוגנות מפני אור על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות.
2.2.3. בזמן אמת PCR
לבצע בזמן אמת הגברה PCR וניתוח עקום ההתכה הבאה הפרמטרים מפורטים בטבלה 2.
| שלב תהליך | הגדרות, רוש LC480 |
| פולימראז ההפעלה / Denaturation | 95 C °, 10 דקות |
| הגברה | 45 מחזורי הגברה ב 95 C °, 10 שניות 60 ° C, 1 דקות רמפה שיעור 1.6 ° C / sec קריאה אופטית |
| ניתוח עקום התכה | כן |
טבלה 2. בזמן אמת בתנאי מחזור PCR באמצעות רוש LightCycler 480.
2.3. ניתוח נתוני ה-PCR בזמן אמת
לא בעקבות ניתוח נתונים PCR בזמן אמת נעשה עם Exiqon Genex המקצועית 5.0,הוא המליץ על הוראות. מדריך צעד אחר צעד Genex ניתן להוריד בhttp://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
ניתוח נתונים מורכב משלושה שלבים:
- יבוא של נתונים
- עיבוד מקדים של נתונים
- ניתוח סטטיסטי
2.3.1. יבוא של נתונים
- ברוש LightCycler 480 לבחור את שיטת ניתוח nd הנגזרת 2 ולחשב את ערכי CQ. הנתונים מיוצאים כטבלה ונשמרו כקבצי טקסט.
- כדי לייבא נתונים, Genex הפתוחה וללחוץ על כפתור אשף יבוא Exiqon ולחץ על "התחל". עקוב אחר ההוראות כדי לבחור פורמט, מכשיר וקובץ צלחת פריסה (ים). שים לב שקבצי צלחת הפריסה (קבצי Excel) הורדו מאתר האינטרנט Exiqon (http://www.exiqon.com/plate-layout-files).
- Imporפנלי t I ו-II ולחצו על "הבא".
- הטבלה שנוצרה לאחר יבוא קובץ מכילה עמודות מוגדרות מראש. ניתן לערוך דגימות שמות וניתן להוסיף עמודות סיווג או הוסרו בשלב זה. לחץ על "הבא" כאשר אתה עשית.
- שמור את הנתונים ולטעון לנתוני עורך.
2.3.2. עיבוד מקדים של נתונים
- כפי שהומלץ על ידי Exiqon וGenex, כאשר משווים צלחות מרובות הדבר הראשון שיש לעשות הוא לכייל את הנתונים בין הלוחות על ידי בחירת כיול בין צלחת מתפריט העיבוד המקדים.
- מומלץ להפעיל מערכי מירנה בריצות בשלושה עותקים. אם מירנה אינה נוכחת בלפחות שניים מתוך שלושה העתקיו ייקבעו כnonexpressed.
- בשלב הבא בעיבוד המקדים, להגדיר מנותק. הגדרת ערך מנותק מציינת כי נתונים עם מחזור סף (לא C) גבוה יותר מאשר ערך זה מבוטלים. בניסויים הנוכחיים באמצעות דגימת נוזל השדרתי, את החתך נקבע על 39. Therefore, כל הדגימות עם גבוה יותר t C מ39 בשלושת העתקים ייפסל. אם מירנה יש t C> 39 לבדיקה אחד (העתק אחד מתוך שלוש), קריאה שתוחלף עם הממוצע של לא C לשתי בדיקות האחרות, ובלבד שהם שניהם מתחת 39.
- הגדר גנים התייחסות. יש Genex מקצועית האפשרות לנצל geNorm ו / או NormFinder לזהות גנים התייחסות. בחר רשימה של miRNAs שיש ערכי CQ דומים בכל המדגם ולהפעיל geNorm ו / או NormFinder. על פי ניתוח זה, בדוגמא הניתנת כאן, miR-622 ו miR-1266 היו הערכים אחידים ביותר על פני הדגימות ונבחרו כגני התייחסות (איור 1).
- בשלב הבא, הנתונים מנורמלים באמצעות גנים ההתייחסות והערכים שהתקבלו מתאימות לt ΔC
- אם תגובות סינתזת cDNA בוצעו בtriplicates, בשלב זה צריכים להיות בממוצע הערכים.
- לאמת את הגיליון מחדשלהעביר את העמודות ריקות וכמעט ריקות. בחלון העיבוד המקדים בחר "אמת את הגיליון" ויותר מלהחיל על קו העמודות ריקות הסר. בשורה מתחת, בחר את האחוז הרצוי של נתונים חוקיים ולחץ על החל. לדוגמא, בחר 100% אם אתה רוצה להשוות miRNAs רק משותף לכל דוגמאות.
- להתמודד עם נתונים חסרים.
בחר באפשרות "נתונים חסרים" מתפריט העיבוד המקדים ובחרתי באחת מהאפשרויות לטיפול בנתונים חסרים. צעד זה נדרש. שים לב שGenex תיתן לך שגיאה אם אתה מנסה לטעון קבצים המכילים נתונים חסרים שלא טופלו. - לקבוע כימות יחסי בין קבוצות של דגימות (כלומר. ניסוי לעומת קבוצת ביקורת). כימות יחסי בקרב קבוצות מחושב בשיטה לא ΔΔ C. בGenex, לחץ על כרטיסיית העיבוד המקדימה ובחר כימות יחסי. בחלון בחר את קבוצת ההתייחסות ופגע להחיל. שים לב כי לייצוגים גרפיים ו / או עבור ניתוחים סטטיסטיים נוספים, exprנתוני ession יש להמיר לסולם לוגריתמים. בתפריט העיבוד המקדים, בחר log2.
2.3.3. ניתוח סטטיסטי
תוכנת Genex מאפשרת מגוון רחב של ניתוחים סטטיסטיים, כוללים מבחן t וניתוח שונה.
- טען את קובץ MDF הסופי לGenex ומנהל נתונים פתוח. זה קריטי כדי לבחור את דוגמאות או קבוצות הנכונות של דגימות שלניתוח סטטיסטי מבוצע.
- בחר "סטטיסטיקה" ובחר בסמל המתאים לבדיקה הרצויה.
- לחץ על "הפעל" בחלון לוח בקרה. שמירת תוצאות כקבצי mdf או Excel.
2.3.4. פרופיל ביטוי
מיקרו RNA ודגימות יכולים להיות מסווגים, באשכולות, ומדמיינים בחום מפות וdendrograms, כדלקמן
- טען את קובץ MDF הסופי לGenex ומנהל נתונים פתוח. השתמש בחלון זה כדי לבחור וליצור קבוצות של דוגמאות או miRNAs. לחץ על "החל" כאשר אתה עשית. <li> באשכול בחר בפינה השמאלית העליון וללחוץ על סמל Heatmap
- בחלון לוח הבקרה לחץ על "הפעלה". Heatmap ניתן לשמור בפורמטים שונים, כגון TIFF או BMP, זה גם יכול להיות מועתק והותאם בהתאם לצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות ממחקר זה כבר פורסמו בעבר 1. איור 1 מציג תוצאות מהניתוח של מיקרו RNA התייחסות המועמד באמצעות יישום geNorm. בהתאם לכך, שני מיקרו RNA, miR-622 ו miR-1266, זוהו כגני התייחסות ושימש לנרמל את ערכי מירנה.
לצורך המחקר CSF היו לנו שלוש קבוצות של דגימות: HIV-(n = 10), כוורת (n = 4), ו-HIV + ללא דלקת קרום המוח (HIV +, n = 5). שתי קבוצות, הכוורת וHIV +, הושוו עם השליטה ב-HIV-הקבוצה. לאחר ניתוח סטטיסטי (סעיף 2.3.3) רמות ביטוי של מיקרו RNA עשר נמצאו מובהקת סטטיסטי 1. איור 2 מייצגים מגרש קופסא של עשרה מיקרו RNA זה, miR-1203,-1224-3P, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5P, -484, -720, -744 *, -934, ו-937. כל עמודה מציגה את התפלגות הנתונים על פני הדגימות בתוך הקבוצה (הירוקה לכוורת ואדומה ל-HIV + ללא encephalitis). שפם מצביע על החציון, 1 st (Q1) ו3 rd (Q3) הרבעוניים, ולכל היותר וnonoutliers מינימום.
איור 1. מוט גרפי מראה תוצאות מיישום geNorm בתוך Genex. עשרה מיקרו RNA נותח כגני התייחסות אפשריים ותוצאות מצביעים על miR-622 ו miR-1266 (קווים אדומים) כmiRNAs הביע ביותר ביציבות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. עלילת תיבה המציגה את ההתפלגות של f נתוניםאו כל אחד מהעשרה miRNAs בתוך הקבוצות של כוורת (ירוק) ו-HIV + ללא דלקת המוח (HIV +, אדום). השפם בכל עמודה מציין את החציון, 1 st (Q1, חלק תחתון של התיבה) ו3 rd (Q3, עליון של התיבה) רבעונים, ערכי מקסימום ומינימום שהם nonoutliers (קווים שחורים). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרו RNA הוא RNAs noncoding הקטן המווסתים את ביטוי הגנים על ידי עיכוב תרגום ו / או קידום mRNA השפלה 2. בשל היציבות הגבוהה שלהם בתנאים ללא תא, מיקרו RNA שכבר זוהה בנוזלי גוף רבים. יתר על כן, פרופיל ביטוי מובהק של מיקרו RNA כבר בקורלציה עם שלב ו / או התקדמות בסוגים שונים של הסרטן אנושי 3-9.
ישנם מספר כלים העומדים לרשות פרופיל מיקרו RNA, כוללים מערכי שבבים קלאסיים או טכנולוגיית הריצוף העמוקה האחרונה. עם זאת, בחרתי לנצל את הפלטפורמה רגישה מאוד qPCR 10, 11, שבו יש יתרון נוסף של צורך בכמות מינימאלית של RNAs. פרוטוקול miRCURY LNA האוניברסלי RT microRNA PCR הוא מותאם לשימוש 20 ng-RNA הכולל ל20 תגובת סינתזת cDNA μl, 40 ng למערך דו פנל המלא. יש את האפשרות של שימוש בכמות קטנה של RNA הוא חשוב מאוד בעת התמודדות עם valuabl דואר ודגימות קליניות קשות להשגה, כגון CSF או רקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין 1. חשוב מכך, ניצול כמויות נמוכות של RNA למזער את הריכוז של מעכבים אפשריים הווה במדגם. מתוך ערכי ה-CT טווח לספייק-בצפוי להעיד על הנוכחות של כמה מעכבים במדגם. ניתן לרכוש בדיקות ספייק-בבנפרד כדי לבדוק את הדגימות לנוכחותם של מעכבים לפני פרופיל מירנה. לבדיקה זו, בזמן אמת אחת PCR מבוצע תוך שימוש בריכוזים הולך וגדל של RNA (אם ng או μl).
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדווחים על מיצוי השלב האורגני לפני בידוד RNA. יש לציין כי רבות ערכות מיצוי RNA חדשות אינן דורשות הליך זה. לדוגמא, יש לנו בהצלחה צדודית miRNAs פלזמה באמצעות biofluids ערכת בידוד miRCURY RNA להפקת RNA ישירות מ200 μl של פלזמה (מידע לא מוצג), ללא מיצוי פנול / כלורופורם.
_content "> באופן כללי, חשוב לתכנן את הניסוי מראש על מנת לקבוע את המספר הנכון של חזרות הנדרשות כדי להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית. מספר החזרות יכול להיות תלוי במספר הדגימות כדי להיות מנותחים ועשוי להיות תלוי וריאציות בתוך הדגימות או הקבוצה של דגימות. למחקר שלנו, שעבורו השתמש במספר נמוך יחסית של דגימות, 20 בסך הכל, החלטנו להקים את תגובת סינתזת cDNA בtriplicates. ייעוץ עם biostatistician לפני הקמת הניסויים רשאי להיות בחירה נבונה ומומלץ מאוד.ערך הגדרת t C מנותק הוא חשוב ותלוי בסוג של דגימות; לmiRNAs הביע מאוד ניתן להגדיר אותו בין 25-35, אבל לmiRNAs הנמוך בא לידי ביטוי, כגון דגימות CSF שלנו, יכול להיות מוגדר גבוהה יותר. עוד צעד קריטי כאשר מדובר בניתוח נתונים הוא הבחירה של גן התייחסות (ים). עבור חלק מנתונים חזקים (כמו מירנה פרופיל בתאים בתרבית) AGהנורמליזציה lobal, המייצגת את t C הממוצע של כל הדגימות, ניתן להשתמש. עם זאת, זה לא אופציה עבור דגימות כמו CSF שמציגות וריאציות. כמו כן, לא יכולנו לנצל כגני התייחסות אלה miRNAs שנחשב בדרך כלל ללא שינוי בנוזלי גוף. במקום זאת, בחרנו את כל miRNAs שהראה t C הדומה מעבר לכל דוגמאות, כולל העתקים, וניהלנו את ניתוח geNorm זמין בGenex (איור 1). תוצאות הצביעו על miR-1266 ו miR-622 כmiRNAs לפחות הביע variably והם שימשו כגני התייחסות. השוואה של הביטוי של miRNAs בין קבוצות ניתן לקבוע באמצעות הכלי היחסי הכימות בGenex, אשר עוקב אחר הנוסחה סטנדרטית 2 - (CT-Ctrel). לבסוף, ניתן דמיינו תוצאות כמו דיאגרמות מפת החום, ברים גרפיים או סוגים אחרים של מגרשים, כגון עלילת התיבה באיור 2. סוגים אחרים של הדמיה זמינות בGenex כוללים אשכולות היררכיים,עצמי מאורגן מפה (SOM), ורכיב עיקרי ניתוח (PCA). בנוסף לmiRNAs, תוכנת Genex יכולה לשמש לניתוח של סוגים אחרים של מערכים כגון RNAs noncoding הארוך פרופיל (lncRNAs). פריסת הצלחת ניתן לייבא בפורמט אקסל וניתן לטפל בנתונים כפי שתואר לניתוח מירנה. ואכן, יש לנו צדודית lncRNAs מתא עצב עכבר עוברי ראשוני בקליפת המוח באמצעות ערכת בידוד mirVana מירנה כפי שמתואר בצעדים לעיל ונתחנו נתונים באמצעות Genex (תוצאות לא פורסמו).
לסיכום, אנו תיארו פרוטוקול לפרופיל מיקרו RNA בנוזל השדרה. עם כמה שינויים הקשורים למיצוי RNA, הליך זה יכול להיות מותאם לפרופיל miRNAs בנוזלי גוף אחרים ו / או סוג אחר של רקמות. יצוין, כי בהליך שתואר כאן, צעד של מיצוי אורגני מתבצע לפני בידוד RNA. באופן כללי, זה לא נדרש בעת שימוש בערכות זמינות מסחרי, כמו שלוחה miRVANA פריזערכת raction. בנוסף, כאשר חילוץ RNA מנוזלי הגוף וRNA מוביל נוסף לדגימות אין צורך לכמת את הרנ"א ו2-8 RNA μl חשופים לסינתזת cDNA. מהניסיון שלנו ובהתחשב בעלויות גבוהות הקשורים לסוג זה של ניסויים, מומלץ לבדוק כמה דגימות ראשונה, ולאחר מכן התייעצות עם סטטיסטיקאי למספר דגימות / העתקים להיות צדודית על מנת לקבל תוצאות מובהקות סטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט המתואר נתמכה על ידי מספר פרס R01MH079751 (PI: פ Peruzzi) מהמכון הלאומי לבריאות נפש. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות נפש או המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3. List of equipment. |
|||
| Finnpipette Novus Multichannel Pipetter |
Thermo Scientific | HH05279 |
|
| Finntip Pipette Tips |
Thermo Scientific | 9400613 |
|
| Thermal Cycler C1000 |
Biorad | ||
| 0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes |
Biorad | TLS0801 |
|
| Flat Cap Strips |
Biorad | TLS0803 |
|
LightCycler 480 Real-Time PCR System |
Roche | ||
LightCycler 480 Sealing Foil |
Roche | 04 729 757 001 |
|
| Refrigerated Centrifuge 5804R |
Eppendorf | ||
| Swing-bucket Rotor, 4-place |
Eppendorf | A-4-44 |
|
| Bench-Top Mini Centrifuge |
Fisher | 05-090-100 |
|
| Bench-Top Vortex |
Fisher | ||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized |
Fisher | 02-681-5 |
|
| Matrix Reagent Reservoir, 25 ml |
Thermo Scientific | 8093 |
|
| Thermomixer Confort |
Eppendorf | ||
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15 |
Sigma | ||
| Bench-Top Vortex |
Velp Scientifica | F202A0173 |
|
Table 4. List of reagents. |
|||
| Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns |
Exiqon | 203300 |
|
| SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml |
Exiqon | 203400 |
|
| Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free |
Invitrogen | 10977-015 |
|
| MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R |
Exiqon | 203608 |
|
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations |
Ambion | AM1556 |
|
| MS2 RNA carrier |
Roche Applied Science | 10165948001 |
|
2-mercaptoethanol 98% |
Sigma Aldrich | M3148-25ml |
|
| Ethanol 100% |
Carlo Erba | 64-17-5 |
|
| Nuclease free water |
Qiagen | 1039480 |
|
RNAse Zap |
Ambion | AM9780 |
|
References
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
- Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
- Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
- Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
