Summary
Las mediciones de las propiedades de conducción nerviosa in vivo ejemplo de una poderosa herramienta para caracterizar diversos modelos animales de enfermedades neuromusculares. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable por lo cual el análisis electrofisiológico en los nervios ciáticos de ratones anestesiados se puede realizar.
Abstract
Los estudios electrofisiológicos permiten una clasificación racional de diversas enfermedades neuromusculares y son de ayuda, junto con técnicas de neuropatológicos, en el entendimiento de la fisiopatología subyacente 1. Aquí se describe un método para realizar estudios electrofisiológicos en nervios ciáticos de ratones in vivo.
Los animales se anestesiaron con isoflurano con el fin de garantizar la analgesia para los ratones probados y sin molestias entorno de trabajo durante las mediciones que se llevan alrededor de 30 min / animal. Una temperatura corporal constante de 37 ° C es mantenida por una placa de calentamiento y mide de forma continua por una sonda termo rectal 2. Además, un electrocardiograma (ECG) se registra habitualmente durante las mediciones con el fin de vigilar continuamente el estado fisiológico de los animales investigados.
Los registros electrofisiológicos se realizan en el nervio ciático, el nervio más grande de the sistema nervioso periférico (SNP), el suministro de la cierva extremidad ratón con tractos de fibras, tanto motoras y sensoriales. En nuestro protocolo, nervios ciáticos permanecer in situ y por lo tanto no tienen que ser extraídos o expuestos, lo que permite mediciones sin ningún irritaciones nerviosas adversos junto con grabaciones reales. El uso de electrodos de aguja apropiadas 3 que realizamos tanto proximal y estimulaciones nerviosas distales, el registro de los potenciales de transmisión con electrodos sensores en músculos gemelos. Después del procesamiento de datos, fiable y valores altamente consistentes para la velocidad de conducción nerviosa (NCV) y el compuesto potencial de acción motor (CMAP), los parámetros clave para la cuantificación de funcionamiento de los nervios periféricos bruto, se puede lograr.
Introduction
Las medidas electrofisiológicas son una herramienta indispensable para la investigación de la integridad funcional de los nervios periféricos, tanto en entornos clínicos y de laboratorio. En los seres humanos, un gran número de trastornos neuromusculares y neuropatías diagnóstico se basan en mediciones electrofisiológicas. Mediante la medición de propiedades nerviosas como la velocidad de conducción o potenciales amplitudes de la señal, es posible caracterizar el origen áspera de las enfermedades nerviosas periféricas.
La velocidad de conducción nerviosa es altamente dependiente de la rápida propagación de la señal habilitada por la mielinización. Por lo tanto, los procesos desmielinizantes generalmente muestran una disminución de la velocidad de conducción 4. El potencial de acción compuesto de motor (CMAP) - se correlaciona con el número de axones funcionales - es un indicador de daño axonal cuando redujo significativamente 5.
Por lo tanto, por medio de métodos electrofisiológicos la etiología de daño nervioso periféricopuede ser discriminado, tal como, por neuropatías hereditarias 6,7, neuropatía diabética 8,9, polineuropatías desmielinizantes inflamatorias crónicas (PDIC) 10, o neuropatías metabólicas 11.
Normalmente, en la aplicación en seres humanos se prefieren las grabaciones no invasivas en el nervio sural o cubital. En los ratones, es sencillo para analizar propiedades nerviosas de los nervios ciáticos, el nervio más grande del sistema nervioso periférico (SNP) que contiene tanto grandes - y axones de pequeño calibre del sistema motriz y sensorial.
El procedimiento como se ha demostrado aquí es un método rápido, sencillo y fiable para medir todos los valores estándar pertinentes para electrofisiología en los nervios periféricos en el ratón intacto. Al tomar grabaciones de un organismo conservado, se garantizan las condiciones fisiológicas del medio ambiente nervio.
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Protocol
El presente estudio se realizó de acuerdo a la Ley de Protección de Animales de la República Federal de Alemania (Tierschutzgesetz der República Federal de Alemania) y fue aprobado por la Oficina Estatal de Turingia para la Inocuidad de los Alimentos y Protección del Consumidor (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Configuración de las mediciones
- Se anestesia a los ratones por isoflurano / O 2 inhalación - para la iniciación de la anestesia 3%, para el mantenimiento de 2% de isoflurano en oxígeno al 100% (Figura 1). Confirme la anestesia suficientes probando los reflejos simples, como los reflejos del movimiento y las pruebas de sensibilidad para el dolor leve. Se recomienda el uso de una pomada en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia, pero no es indispensable ya que el procedimiento suele durar sólo 30 min / animal en total. En el caso de los experimentos de supervivencia, administrar oportuna ya analgésicos de acción para el control del dolor postoperatorio.
- Afeitarse la piel que cubre las extremidades posteriores con una maquinilla de afeitar eléctrica y realizar la depilación con una crema de depilación disponibles en el mercado, mientras que los animales están ya en la analgesia. Con el fin de mantener el estatus libre de patógenos durante todo el procedimiento, utilice guantes asépticos y utilizar siempre instrumentos cuidadosamente limpiados con etanol al 70%.
- Control de estabilidad de la temperatura del cuerpo por una placa de calefacción controlada y retroalimentación (Figura 2) sonda termo rectal. Si es necesario, utilice un paño estéril para cubrir la placa de calentamiento entre los animales con el fin de mantener un entorno experimental estéril. Además, se recomienda utilizar una placa de calentamiento, que se controla electrónicamente a través de un sensor integrado para limitar la temperatura de calentamiento a ≤ 40 ° C con el fin de evitar daños en los tejidos.
Figura 1 Exp.configuración erimental mostrando un ratón anestesiado con extremidades posteriores afeitadas. - Tome electrocardiografía (ECG) grabaciones para monitorear la frecuencia cardiaca como un parámetro vital. Instalar tres electrodos para las grabaciones de ECG de la siguiente manera: un electrodo debajo de la piel de cada extremidad anterior y un electrodo debajo de la piel en la zona del cuello.
- Electrodos Place anillo utilizando gel de contacto para la resistencia óptima conductividad / transferencia. El electrodo sensor (marcado en negro) se coloca en la posición en el músculo gastrocnemio tiene su diámetro máximo. El electrodo de referencia (indicado en rojo) se coloca justo debajo de la electrodo de detección.
Nota: Por favor vea 'tabla de materiales "para detalles del equipamiento. - Marque las posiciones de medida correctas con distancias predeterminadas pero consistentes entre los extremos proximal y estimulación del nervio ciático distal y el electrodo de plomo. Propuesta experimental: A una distancia de 4 mm del electrodo de detección, la estimulación distal se llevará a cabo.En una distancia de 16 mm hasta el electrodo de detección, la estimulación proximal se llevará a cabo (Figura 2).
Figura 2. Imagen representativa que muestra la situación experimental justo antes del comienzo de las mediciones. La flecha blanca indica la posición de la detección (negro) y de referencia (rojo) de electrodo en el músculo gastrocnemio de la extremidad posterior izquierda. La estimulación por electrodos de aguja se realizará en las posiciones definidas en relación con el electrodo sensor negro. El punto de estimulación distal (punto negro con "DS" en la extremidad posterior izquierda) tiene una distancia de 4 mm del electrodo de detección; el lugar de la estimulación proximal (punto negro con "ps") es de 16 mm de distancia. La línea roja en la extremidad posterior derecha muestra el ca Imate curso anatómico del nervio ciático. Por otra parte, las posiciones aproximadas de los músculos de las extremidades traseras relevantes se muestran como puntos de referencia. El asterisco indica que la sonda térmica rectal.
2. Medición
- Principio: Realice una serie de estimulaciones nerviosas con repetitivamente generados pulsos de onda cuadrada única de 0,1 ms de duración por electrodos de aguja monopolar desechable 28 T (tasa de repetición 200 ms; ver Figura 3A). Para el análisis de datos fuera de línea, se recomienda para adquirir simultáneamente las señales de estimulación junto con la curva de respuesta de la función neuromuscular (Figura 3B) debido a la estimulación del nervio. Promedio, una serie de respuestas máximas ("respuesta representativa de la función neuromuscular") para el análisis de datos posterior. Con el fin de obtener datos fiables, ficha y después promedio por lo menos 3, las curvas de respuesta óptimos independientes por zona de estimulación y de los animales.
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Figura 3. Procedimiento para la adquisición de datos y análisis (presentación esquemática). Repetitivamente impulsos generados son aplicados para el nervio ciático a través de electrodos de aguja (fila superior en la Figura 3A). Al mismo tiempo, se registran varias curvas de respuesta neuromuscular correspondientes (fila inferior en la Figura 3A). Cuando promediado y ampliada, curvas de respuesta neuromuscular debido a impulsos de estimulación (fila superior de la Figura 3B) muestran las propiedades siguientes características (fila inferior de la Figura 3B): Latencia de la respuesta de la señal, así como la duración y la amplitud de la señal se indican y pueden ser obtenido para los cálculos y las estadísticas posteriores. Conducción de la señal irregular y / o grabaciones subóptimas suelen dar lugar a diversas deformaciones de señal con algo más que una positiva y una desviación negativa o deformación de la señal(Forma bimodal) con una reducción de la amplitud (Figura 3C). - Realizar la estimulación proximal con un electrodo de aguja en la posición determinada ("PS" en la Figura 2).
- Con el fin de lograr mejores condiciones de grabación con amplitudes máximas, visualizar las curvas de respuesta reales simultáneas para el proceso de estimulación. Al hacerlo, el experimentador es capaz de evaluar inmediatamente la forma de las curvas de respuesta, así como el tamaño de la amplitud.
- Si es necesario, ligeramente y cuidadosamente manipular la posición y / o el ángulo de la aguja con respecto a la estimulación del nervio ciático. Este suave optimización de las condiciones de estimulación permite alcanzar amplitudes constantes con el valor más grande posible y una curva de respuesta de forma típica bifásica (Figura 4).
- Realice la estimulación distal con un electrodo de aguja en la posición determinada ("DS" en la Figura 2).
- Después completion de la medida, transferir el ratón a prueba a una jaula separada hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No deje un animal desatendido y en la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado totalmente de la anestesia. Administrar oportuna ya analgésicos de acción para el control del dolor postoperatorio. La administración sistémica de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y los opioides se recomiendan durante 1-3 días.
- Alternativamente, sacrifica el ratón sigue anestesiado en una manera rápida y cruel y evitarle más dolor para el animal, por ejemplo, la dislocación cervical.
Figura 4. Ilustración para determinar las grabaciones CMAP con amplitudes máximas. Una serie de registro completo se presenta. (Un (B) los resultados del movimiento de la aguja de estimulación leve en CMAP grabaciones con amplitudes máximas. (C) Los cambios adicionales en la colocación de agujas producen CMAP grabaciones con diferentes amplitudes entre ellos-cerca de la máxima amplitud. (D) La estimulación de reemplazo de la aguja con CMAP grabaciones de serie de amplitudes casi máximos. Nota: disminución típica en amplitudes de CMAP puede ocurrir durante la estimulación repetitiva en el sitio de estimulación óptima 12, 13. Los asteriscos indican las grabaciones CMAP con amplitudes máximas representados para el promediado.
3. Análisis
- Extraer parámetros de conducción nerviosa basadas en el conjunto de datos representativo respuesta de la función neuromuscular mediante un paquete de software apropiado (por ejemplo AtisaPro).
Nota: Por favor, maneje la determinación de datos relacionada con el tiempo, con especial cuidado, porque la determinación del punto de inflexión de la acción motriz compuesto potrencial (CMAP) de inicio y terminación puede ser difícil. Un procedimiento con reproducibilidad verificado se da en la Figura 3B, donde se utilizan las tangentes en deflexiones de señal después del inicio y antes de rescisión. - Calcular los valores de los CMAP '' latencia de la señal 'y.
- Latencia 'representa el retardo de tiempo entre la estimulación y la CMAP inicio, mientras que el intervalo de tiempo entre el inicio de CAMP de deflexión inicial negativa a regresar a la línea de base se llama iniciales «duración CMAP'. Utilice la diferencia entre latencias distales y proximales para calcular la velocidad de conducción junto con la distancia entre los sitios de estimulación distal y proximal.
velocidad de conducción = latencia / distancia entre los sitios de estimulación - CMAP '(compuesto potencial de acción motor) amplitud representa la magnitud entre el máximo punto de inflexión positivo y negativo de la señal CMAP (dado en mV).
«Punto de inflexión positiva" CMAP = valor - po de respuesta negativa de valor "int '
- Latencia 'representa el retardo de tiempo entre la estimulación y la CMAP inicio, mientras que el intervalo de tiempo entre el inicio de CAMP de deflexión inicial negativa a regresar a la línea de base se llama iniciales «duración CMAP'. Utilice la diferencia entre latencias distales y proximales para calcular la velocidad de conducción junto con la distancia entre los sitios de estimulación distal y proximal.
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Representative Results
Hemos llevado a cabo una serie de in vivo mediciones electrofisiológicas sobre los nervios ciáticos de 12 ratones en total para este estudio: 6 animales de cada sexo. Las mediciones se realizaron con el protocolo presentado y se entregan los siguientes resultados:
Ambos ratones machos y hembras muestran una velocidad de conducción del nervio ciático media de aproximadamente 20 m / seg (Figura 5). Esto es consistente con otras mediciones en la literatura. Además, muestra que no existen diferencias relevantes en los nervios velocidad de conducción entre hombres y mujeres de acuerdo con nuestros datos.
Figura 5. Velocidades de conducción nerviosa del nervio ciático medido para ratones machos y hembras en vivo.
Figura 6. Amplitudes CMAP después proximal (púrpura) y distal (rojo) la estimulación del nervio ciático en vivo.
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Discussion
El protocolo descrito proporciona un método sencillo y fiable para determinar las propiedades de conducción del nervio ciático en ratones anestesiados y sin la necesidad de exponer el nervio de interés. Sin embargo, este procedimiento experimental provoca lesión tisular por punción con aguja. Por tanto, es una opción razonable para sacrificar a los animales después de terminar las grabaciones. Sin embargo, en comparación con otros procedimientos más invasivos, que requieren la exposición del nervio antes de grabaciones, daño a los tejidos es comparativamente pequeña 3,14. Por lo tanto, las mediciones repetidas son posibles y dependen del diseño del estudio respectivo. Sin embargo, ciertos puntos tienen que ser consideradas a fin de asegurar resultados consistentes.
Con el fin de llevar a cabo condiciones de grabación óptimas, es importante para reducir la resistencia de la piel por la depilación completa, extensa limpieza de la piel y mediante el uso de gel de contacto, todo lo cual permite una apropiadamente bajo nivel de ruido / contaminación durante MEAsurements.
Además, es importante buscar formas de curva óptimos, bifásicos de las señales detectadas como se muestra en la Figura 3B. En ocasiones, también se detecta curvas que son, obviamente, un producto de la conducción de la señal irregular a través antidrome señal de esparcimiento o por algunas ramas del nervio. Este escenario da lugar a diferentes deformaciones de señal con algo más que una positiva y una desviación negativa o con una forma de la señal de división, amplitud reducida, y / o señal ampliado (Figura 3C). Con el fin de asegurar la propagación de la señal ortodrómica clásica desde el punto de estimulación al músculo, sólo aquellas grabaciones deben ser utilizados para cuantificaciones que muestran una forma clara, como se muestra en la Figura 3B.
Hay que tener en cuenta que la anestesia puede influir en los registros electrofisiológicos en los nervios periféricos. En informes anteriores indicaron que el uso de isoflurano para unanesthesia reduce los valores CMAP notablemente, en comparación con la medición CMAP en condiciones nonanesthetized 14. Sin embargo, el procedimiento utilizado en el presente documento tiene un impacto mínimo en un VCN, proporciona datos reproducibles en todo el rendimiento experimental y es el método más seguro, más eficaz de la anestesia con el fin de evaluar las funciones de los nervios periféricos en ratones 15.
Por último, hay que considerar que el nervio ciático contiene tractos de fibras, tanto motoras y sensoriales. Un análisis separado de cualquier motor o de los componentes sensoriales es imposible debido a la utilizada en el presente documento estimulación nerviosa externa supra-máximo y propagación de la señal inducida ortodrómica. Con el fin de abordar esta cuestión, también se realizaron registros electrofisiológicos del nervio sural 16, un nervio sensitivo que puede ser estimulado en el lateral del tobillo de la extremidad posterior del ratón. Sin embargo, el pequeño tamaño del nervio sural conduce a los siguientes problemas: En primer lugar, típicamente un lugar SMAtamaño potencial ll durante las grabaciones se puede conseguir lo que necesita un análisis sofisticado de datos. En segundo lugar, un cierto número de lesiones accidentales de la nervio sural en estudio debido a la perforación no se puede evitar al intentar lograr grabaciones.
En contraste con otros protocolos 17, no es necesario extraer el nervio de interés - en nuestro caso el nervio ciático - antes de las mediciones. Al tomar grabaciones de un organismo conservado, se conservan las condiciones fisiológicas del medio ambiente nervio intacto. Además, daños en los tejidos a los ratones es pequeño en comparación con los procedimientos más invasivos.
Por otro lado, la falta de exposición del nervio usando esta técnica hace que la reproducción consistente de estimulaciones más difícil, ya que la confirmación visible de colocación de los electrodos apropiada con respecto al nervio ciático no es posible. Sin embargo, la monitorización simultánea de las curvas de respuesta durante Recorgolpes es una manera fácil de definir con fiabilidad adecuada colocación de la aguja de estimulación.
Usando este método, varios modelos de ratón existentes y nuevos de enfermedades neuromusculares se podrían caracterizar adecuadamente en términos de propiedades de conducción nerviosa: fenotipos desmielinizantes pueden distinguirse claramente de los modelos animales de enfermedades principalmente musculares o axonal, por ejemplo, como se muestra en un trabajo previo en el que se describe método se ha realizado 7.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por SFB 604, DFG MO 1421/2-1 y Krebshilfe 107089 (HM). AS es destinatario de un Premio Joven Investigador de Tumor Infantil Foundation (Nueva York, EE.UU.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
References
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