Summary
Les mesures de propriétés de conduction nerveuses in vivo illustrent un outil puissant pour caractériser différents modèles animaux de maladies neuromusculaires. Ici, nous présentons un protocole simple et fiable qui analyse électrophysiologique sur les nerfs sciatiques des souris anesthésiées peut être effectuée.
Abstract
Les études électrophysiologiques permettent une classification rationnelle des diverses maladies neuromusculaires et sont de l'aide, ainsi que des techniques neuropathologiques, dans la compréhension de la physiopathologie sous-jacente 1. Nous décrivons ici une méthode pour réaliser des études électrophysiologiques sur les nerfs sciatiques de souris in vivo.
Les animaux sont anesthésiés avec de l'isoflurane, afin d'assurer une analgésie pour les souris testées et perturbées environnement de travail au cours des mesures qui ont environ 30 min / animal. A température constante de 37 ° C est maintenue par une plaque de chauffage et de mesure en continu par une sonde thermo rectale 2. En outre, un électrocardiogramme (ECG) est régulièrement enregistré au cours des mesures afin de surveiller en permanence l'état physiologique des animaux étudiés.
Des enregistrements électrophysiologiques sont effectués sur le nerf sciatique, le plus grand nerf de ee système nerveux périphérique (SNP), en fournissant le membre postérieur de la souris avec des faisceaux de fibres à la fois motrices et sensorielles. Dans notre protocole, les nerfs sciatiques rester in situ et par conséquent n'ont pas besoin d'être extrait ou exposé, ce qui permet des mesures sans aucune irritation des nerfs indésirables avec des enregistrements réels. En utilisant des électrodes à aiguilles appropriées 3, nous effectuons tous les deux proximale et distale stimulations nerveuses, l'enregistrement des potentiels transmises avec des électrodes de détection à muscles jumeaux. Après traitement des données, fiable et valeurs très cohérentes pour la vitesse de conduction nerveuse (NCV) et le composé potentiel d'action du moteur (CMAP), les paramètres clés pour la quantification de fonctionnement brut de nerf périphérique, peuvent être atteints.
Introduction
Mesures électrophysiologiques sont un outil indispensable pour étudier l'intégrité fonctionnelle des nerfs périphériques dans des environnements cliniques et de laboratoire. Chez l'homme, un grand nombre de troubles neuromusculaires et des neuropathies diagnostic repose sur des mesures électrophysiologiques. En mesurant les propriétés nerveuses que la vitesse de conduction et l'amplitude possibles du signal, il est possible de caractériser l'origine grossière de maladies des nerfs périphériques.
La vitesse de conduction nerveuse est très dépendante de propagation de signal rapide est activée par la myélinisation. Par conséquent, les processus de démyélinisation montrent généralement diminué la vitesse de conduction 4. Le potentiel d'action composé de moteur (CMAP) - en corrélation avec le nombre d'axones fonctionnels - est un indicateur de lésions axonales quand considérablement réduit 5.
Ainsi, au moyen de procédés électrophysiologiques l'étiologie de la lésion des nerfs périphériquespeut être discriminé, comme par neuropathies héréditaires, la neuropathie diabétique 6,7 8,9, polyneuropathies inflammatoires chroniques démyélinisantes (CIDP), 10 ou des neuropathies métaboliques 11.
Normalement, dans l'application humaine des enregistrements non invasifs sur le nerf saphène ou ulnaire sont préférés. Chez la souris, il est facile d'analyser les propriétés nerveuses du nerf sciatique, le plus grand nerf du système nerveux périphérique (SNP) contenant à la fois grand - et les axones de petit calibre du système moteur et sensoriel.
La procédure comme l'a démontré ici est une méthode rapide, simple et fiable de mesurer toutes les valeurs standards pertinents pour électrophysiologie sur les nerfs périphériques chez la souris intacte. En prenant des enregistrements à partir d'un organisme préservé, les conditions physiologiques de l'environnement de nerf sont garantis.
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Protocol
La présente étude a été réalisée selon la protection des animaux Loi de la République fédérale d'Allemagne (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) et a été approuvé par l'Office d'Etat de Thuringe pour la sécurité alimentaire et la protection des consommateurs (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Configuration des mesures
- Anesthésier les souris par isoflurane / O 2 inhalation - pour l'initiation de l'anesthésie à 3%, pour l'entretien 2% d'isoflurane dans de l'oxygène à 100% (Figure 1). Confirmez l'anesthésie suffisamment en testant les réflexes simples comme des réflexes et des tests de sensibilité pour la douleur de bas grade mouvement. L'utilisation de la pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie est recommandé mais pas indispensable car la procédure prend généralement que 30 min / animaux au total. En cas d'expériences de survie, d'administrer en temps opportun plus analgésiques à action pour la gestion de la douleur postopératoire.
- Raser les poils qui recouvrent les pattes arrière avec un rasoir électrique et effectuer l'épilation avec une crème d'épilation disponibles dans le commerce alors que les animaux sont déjà sous analgésie. Afin de maintenir le statut exempt d'agents pathogènes tout au long de la procédure, porter des gants aseptiques et toujours utiliser des instruments soigneusement nettoyées à l'éthanol à 70%.
- Organe de contrôle de la stabilité de la température par une plaque de chauffage de retour et contrôlée sonde thermo rectale (figure 2). Si nécessaire, s'il vous plaît utiliser un champ stérile pour couvrir la plaque de chauffage entre les animaux afin de maintenir un environnement expérimental stérile. En outre, il est recommandé d'utiliser une plaque de chauffage, qui est commandé électroniquement par l'intermédiaire d'un capteur intégré pour limiter la température de chauffage à ≤ 40 ° C, afin d'éviter des dommages aux tissus.
Figure 1. Expconfiguration erimental montrant une souris anesthésiée avec les membres postérieurs rasé. - Prenez l'électrocardiographie (ECG) pour surveiller le rythme cardiaque comme un paramètre essentiel. Installez trois électrodes pour les enregistrements ECG comme suit: une électrode sous la peau de chaque patte avant et une électrode sous la peau dans la région du cou.
- Électrodes Lieu d'anneau utilisant un gel de contact pour la résistance de conductivité / transfert optimal. L'électrode de détection (marqué en noir) est placé à la position où le muscle gastrocnémien a son diamètre maximal. L'électrode de référence (indiqué en rouge) est placé juste en dessous de l'électrode de détection.
Note: S'il vous plaît voir «Tableau des matériaux» pour les détails d'équipement. - Marquez les positions correctes de mesure des distances prédéterminées mais cohérentes entre la stimulation proximale et distale du nerf sciatique et l'électrode de plomb. Proposition expérimentale: À une distance de 4 mm de l'électrode de détection, la stimulation distale aura lieu.Dans une distance de 16 mm à l'électrode de détection, la stimulation proximale sera réalisée (figure 2).
Figure 2. D'image représentative montrant la situation expérimentale juste avant le début des mesures. La flèche blanche indique la position du palpeur (noir) et de référence (rouge) à l'électrode muscle jumeau de la patte arrière gauche. La stimulation par des électrodes à aiguille est réalisée à des positions définies par rapport à l'électrode de détection noir. Le point de stimulation distale (marque noire avec "ds" à la patte arrière gauche) a une distance de 4 mm de l'électrode de détection; le lieu de la stimulation proximale (marque noire "ps") est de 16 mm de distance. La ligne rouge sur la patte postérieure droite montre l'env iMate trajet anatomique du nerf sciatique. En outre, les positions approximatives des muscles des pattes postérieures pertinents sont présentés comme points de repère. L'astérisque indique la sonde thermique rectale.
2. Mesure
- Principe: Effectuez une série de stimulations nerveuses avec des impulsions carrés d'ondes simples générés de façon répétitive de 0,1 msec par jetables 28 G électrodes aiguilles monopolaires (taux de répétition de 200 ms, voir la figure 3A). Pour l'analyse des données hors de la ligne, il est recommandé d'acquérir simultanément des signaux de stimulation neuromusculaire avec la courbe de réponse en fonction (Figure 3B) du fait de la stimulation du nerf. Moyenne d'une série de réponses maximales («réponse de la fonction neuromusculaire représentant") pour une analyse ultérieure des données. Afin de produire des données fiables, fiche et au moins trois courbes plus tard moyennes indépendantes, optimales réponse par site de stimulation et animale.
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Figure 3. Procédure d'acquisition de données et d'analyse (présentation schématique). Impulsions générées sont appliquées répétitivement au nerf sciatique par l'intermédiaire d'électrodes à aiguille (rangée supérieure sur la figure 3A). Simultanément, plusieurs courbes de réponse neuromusculaire correspondantes sont enregistrées (rangée inférieure de la figure 3A). Lorsque la moyenne et agrandie, des courbes de réponse neuromusculaire due à des impulsions de stimulation (rangée supérieure sur la figure 3B) présentent les propriétés suivantes caractéristiques (rangée inférieure sur la figure 3B): Temps de latence de la réponse de signal ainsi que la durée et l'amplitude du signal sont indiquées et peuvent être obtenu pour les calculs et les statistiques suivantes. Conduction du signal irrégulière et / ou enregistrements sous-optimaux aboutissent généralement à diverses déformations de signaux avec plus que juste une positive et une déviation négative ou déformation du signal(Forme bimodale) avec une amplitude réduite (figure 3C). - Effectuer une stimulation avec une électrode proximale de l'aiguille à la position déterminée ("ps" sur la figure 2).
- Afin d'obtenir les meilleures conditions d'enregistrement avec des amplitudes maximales, de visualiser des courbes de réponse réels simultanés au processus de stimulation. En faisant cela, l'expérimentateur est en mesure d'évaluer immédiatement la forme de courbes de réponse ainsi que la taille de l'amplitude.
- Le cas échéant, un peu d'attention et de manipuler la position et / ou l'angle de l'aiguille de stimulation par rapport au nerf sciatique. Cette optimisation douceur de conditions de stimulation permet d'atteindre des amplitudes constantes avec la plus grande valeur possible, et une courbe de réponse typique de forme biphasique (figure 4).
- Effectuer une stimulation distale avec une électrode à aiguille en position déterminée ("ds" dans la figure 2).
- Après des achèvementsn de la mesure, de transférer la souris testée à une cage séparée jusqu'à ce qu'il ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Ne pas laisser un animal sans surveillance, et en compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré de l'anesthésie. Administrer en temps opportun plus analgésiques à action pour la gestion de la douleur postopératoire. L'administration systémique de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les opioïdes sont recommandés pour 1-3 jours.
- Sinon, sacrifier la souris encore anesthésiés de façon rapide et sans cruauté sans autre douleur pour l'animal, par exemple par dislocation cervicale.
Figure 4. Illustration de déterminer les enregistrements CMAP avec des amplitudes maximales. Une série d'inscription complète est présentée. (A (B) les résultats du mouvement de l'aiguille légère de stimulation dans les enregistrements CMAP avec amplitudes maximales. (C) D'autres changements dans le placement de l'aiguille produisent enregistrements CMAP avec des amplitudes différentes, y compris près du maximum des amplitudes. (D) la stimulation de remplacement de l'aiguille avec des enregistrements CMAP série d'amplitudes quasi-maximales. Remarque: décroissance typique des amplitudes CMAP peut se produire lors de la stimulation répétitive à optimale site de stimulation 12, 13. Les astérisques indiquent les enregistrements CMAP avec des amplitudes maximales représentées pour la moyenne.
3. Analyse
- Extraire des paramètres de conduction nerveuse sur la base de l'ensemble neuromusculaire représentant de réponse de la fonction de données en utilisant un logiciel approprié (par exemple AtisaPro).
Note: S'il vous plaît traiter détermination de données en fonction du temps avec un soin particulier car le point d'inflexion de détermination composé action motrice potrentiel (CMAP) début et la fin peut être difficile. Une procédure avec une reproductibilité garantie est donnée à la figure 3B, où les tangentes sur des détournements de signal après le début et avant la fin sont utilisés. - Calculez «signal latence» et les valeurs «CMAP.
- Latence »représente le délai entre la stimulation et CMAP apparition, tandis que le laps de temps entre CAMP début de déviation initiale négative à parapher retour à la ligne de base est appelé« durée CMAP. Utiliser la différence entre les latences distales et proximales pour calculer la vitesse de conduction en même temps que la distance entre les sites de stimulation distale et proximale.
= vitesse de conduction de latence / distance entre les sites de stimulation - CMAP '(composé potentiel d'action du moteur) amplitude représente l'amplitude entre le point positif et négatif maximum de redressement du signal CMAP (donnée en mV).
CMAP = valeur "point de retournement positif» - valeur «négative redressement point '
- Latence »représente le délai entre la stimulation et CMAP apparition, tandis que le laps de temps entre CAMP début de déviation initiale négative à parapher retour à la ligne de base est appelé« durée CMAP. Utiliser la différence entre les latences distales et proximales pour calculer la vitesse de conduction en même temps que la distance entre les sites de stimulation distale et proximale.
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Representative Results
Nous avons effectué une série de mesures électrophysiologiques in vivo sur les nerfs sciatiques de 12 souris au total pour cette étude: 6 animaux de chaque sexe. Les mesures ont été réalisées avec le protocole présenté et livrés aux résultats suivants:
Les deux souris mâles et femelles présentent une vitesse sciatique moyen de conduction nerveuse de l'ordre de 20 m / sec (figure 5). Ceci est cohérent avec d'autres mesures dans la littérature. En outre, il montre qu'il n'y a pas de différences pertinentes dans le nerf vitesse de conduction entre les hommes et les femmes en fonction de nos données.
Figure 5. Conduction nerveuse vitesses du nerf sciatique mesurée chez les souris mâles et femelles in vivo.
Figure 6. Amplitudes CMAP après proximale (violet) et distale (rouge) la stimulation du nerf sciatique in vivo.
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Discussion
Le protocole décrit fournit une méthode simple et fiable pour déterminer nerf sciatique propriétés de conduction sur des souris anesthésiée sans la nécessité d'exposer le nerf d'intérêt. Néanmoins, cette procédure expérimentale provoque des lésions du tissu par ponction à l'aiguille. Il est donc raisonnable d'une option de sacrifier les animaux après la fin des enregistrements. Cependant, par rapport à d'autres procédures plus invasives, qui nécessitent l'exposition du nerf avant enregistrements, des lésions tissulaires est comparable petit 3,14. Par conséquent, des mesures répétées sont possibles et dépendent de la conception de l'étude en question. Cependant, certains points doivent être pris en considération afin d'assurer des résultats cohérents.
Afin de réaliser des conditions d'enregistrement optimales, il est important de réduire la résistance de la peau par l'épilation complète, un nettoyage en profondeur de la peau et en utilisant un gel de contact, qui garantisse un niveau de bruit suffisamment faible / contamination pendant measurements.
En outre, il est important de comparer optimales, de formes de courbe biphasique des signaux détectés comme représenté sur la figure 3B. Parfois, nous détectons également courbes qui ne sont évidemment un produit de la conduction du signal irrégulier par antidrome signal d'étalement ou par des branches nerveuses. Ce scénario se traduit par des déformations différentes du signal avec plus que juste une positive et une déviation négative ou avec une forme de signal divisé, d'amplitude réduite, et / ou un signal étendu (figure 3C). Afin d'assurer la propagation du signal orthodromie classique du point de stimulation du muscle, seuls les enregistrements doivent être utilisés pour des quantifications qui affichent une forme claire comme le montre la figure 3B.
Il faut tenir compte du fait que l'anesthésie peut influencer les enregistrements électrophysiologiques sur les nerfs périphériques. Des rapports antérieurs ont indiqué que l'utilisation de l'isoflurane pendant unenesthesia réduit valeurs CMAP nettement, par rapport à la mesure CMAP dans des conditions anesthésiés, 14. Néanmoins, le mode opératoire utilisé ici a un impact minimal sur NCV, délivre des données reproductibles pendant l'exécution expérimentale et est la méthode la plus sûre, la plus efficace de l'anesthésie en vue d'évaluer les fonctions des nerfs périphériques chez les souris 15.
Enfin, il faut considérer que le nerf sciatique contient des faisceaux de fibres à la fois motrices et sensorielles. Une analyse séparée des deux composants moteur ou sensoriel est impossible en raison de la stimulation du nerf utilisé ici supra-maximale externe et la propagation du signal de orthodromie induite. Afin de répondre à cette question, nous avons également réalisé des enregistrements électrophysiologiques du nerf saphène 16, un nerf sensitif pur qui peut être stimulée à la cheville latérale arrière du limbe de la souris. Cependant, la petite taille du nerf sural conduit aux problèmes suivants: d'abord, en général une assez smataille potentielle ll pendant les enregistrements peuvent être obtenues qui exige l'analyse de données sophistiqués. Deuxièmement, un certain nombre de blessures accidentelles du nerf saphène à l'étude en raison de la perforation ne peut être évitée, tout en essayant d'accomplir des enregistrements.
Contrairement à d'autres protocoles 17, il n'est pas nécessaire d'extraire le culot d'intérêt - dans notre cas, le nerf sciatique - avant les mesures. En prenant les enregistrements provenant d'un organisme conservés, des conditions physiologiques de l'environnement de nerfs intacts sont préservées. En outre, les lésions tissulaires à la souris est faible par rapport à des procédures plus invasives.
D'autre part, l'absence d'exposition du nerf en utilisant cette technique permet la reproduction cohérente des stimulations plus difficile car la confirmation visible du bon positionnement des électrodes par rapport au nerf sciatique n'est pas possible. Cependant, la surveillance simultanée des courbes de réponse pendant Recordes coups est un moyen facile de définir de manière fiable le bon positionnement de l'aiguille de stimulation.
En utilisant cette méthode, différents modèles de souris existants et nouveaux de maladies neuromusculaires peuvent être correctement caractérisés en termes de propriétés de conduction nerveuse: phénotypes démyélinisantes peuvent être clairement distingués des modèles animaux de maladies principalement musculaires ou axonales, par exemple, comme indiqué dans un précédent travail où le décrit méthode a été effectuée 7.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par SFB 604, DFG MO 1421/2-1 et Krebshilfe 107089 (HM). AS est récipiendaire du prix du jeune chercheur de la tumeur du Children Foundation (New York, États-Unis).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
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