Summary
In vivo sinir iletim özelliklerinin ölçümleri nöromüsküler hastalıkların çeşitli hayvan modelleri karakterize etmek için güçlü bir araç örneklemektedir. Burada, biz anestezi farelerin siyatik sinirlerin elektrofizyolojik analizi yapılabilir hangi ile kolay ve güvenilir bir protokol mevcut.
Abstract
Elektrofizyolojik çalışmalar patofizyoloji 1 anlayış, birlikte nöropatolojik teknikleri ile çeşitli nöromüsküler hastalıklar rasyonel bir sınıflandırma izin ve yardım vardır. Burada in vivo fare siyatik sinirlerin elektrofizyolojik çalışmalar gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Hayvanlar, test edilen fareler için analjezi sağlamak amacıyla izofluran ile anestezi uygulandı ve yaklaşık 30 dakika / hayvan almak ölçümler sırasında çalışma ortamı engellenmez. 37 ° C'lik bir sabit vücut sıcaklığı bir ısıtma plakası ile tutulur ve bir termo rektal sonda 2 ile ölçülür. Buna ek olarak, bir elektrokardiyogram (EKG) rutin olarak sürekli olarak incelenen hayvanların fizyolojik durumunu izlemek amacıyla, ölçümler sırasında kaydedilir.
Elektrofizyolojik kayıtlar siyatik sinir th en büyük sinir yapılmaktadırmotorik ve duyusal hem de elyaf yolları ile fare arka uzuv temin e periferik sinir sistemi (PNS),. Protokolde, siyatik sinirler yerinde kalır ve bu nedenle ekstre veya maruz zorunda değilsiniz, gerçek kayıtları ile birlikte herhangi bir olumsuz sinir tahriş olmadan ölçümler sağlar. Uygun iğne elektrotlar 3 kullanma biz gastrokinemius kaslara algılama elektrotlar ile iletilen potansiyelleri kayıt, yakın ve uzak sinir uyaranları hem de gerçekleştirin. Veri işleme, güvenilir ve sinir iletim hızı (NCV) ve bileşik motor aksiyon potansiyeli (CMAP) için son derece tutarlı değerler, brüt periferik sinir işleyişi ölçümü için anahtar parametreler, elde edilebilir sonra.
Introduction
Elektrofizyolojik ölçümler klinik ve laboratuvar ortamında hem de periferik sinirlerin fonksiyonel bütünlüğünü araştırmak için vazgeçilmez bir araç bulunmaktadır. İnsanlarda, nöromüsküler bozukluklar ve nöropatilerin, çok sayıda teşhis elektrofizyolojik ölçümlere dayanmaktadır. Iletim hızı ya da sinyal amplitüdleri potansiyel olarak sinir özellikleri ölçerek, periferik sinir hastalıkları kaba kökenini karakterize etmek mümkündür.
Sinir iletim hızı miyelinasyonda tarafından etkin, hızlı sinyal yayılması son derece bağlıdır. Bu nedenle, demiyelinizan süreçleri genellikle iletim hızları 4 azalma göstermektedir. Bileşik motor aksiyon potansiyeli (CMAP) - fonksiyonel akson sayısı ile ilişkilendirilmesi - anlamlı 5 azaltılmış aksonal hasar için bir göstergedir.
Bu nedenle, elektrofizyolojik yöntemler vasıtasıyla periferik sinir hasarı etyolojisiörneğin kalıtsal nöropatiler 6,7, diyabetik nöropati 8,9, kronik enflamatuvar demiyelinizan polinöropatiler (CIDP) 10 ya da metabolik nöropatiler 11 için olduğu gibi, ayırt edilebilir.
Normalde, insan uygulamasında sural veya ulnar sinire invaziv kayıtları tercih edilir. Ve motorik ve duyu sisteminin küçük kalibreli aksonlar - Farelerde, siyatik sinirlerin sinir özellikleri, büyük hem de içeren periferal sinir sisteminin (PNS) en büyük sinir analiz basittir.
Burada gösterildiği gibi prosedür sağlam fare periferik sinirler elektrofizyoloji hakkında tüm standart değerlerini ölçmek için hızlı, kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Korunmuş bir organizmadan kayıtları alarak, sinir ortamının fizyolojik koşulları garanti edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Almanya Federal Cumhuriyeti (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) Hayvanlar Yasası Korunmasına göre yapıldı ve Gıda Güvenliği ve Tüketiciyi Koruma (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) için Thüringen Eyalet Dairesi tarafından onaylandı.
1.. Ölçümleri Kurma
- Izofluran / O 2 inhalasyon yoluyla fareler anestezi - anestezi% 3 başlatılması için,% 100 oksijen bakım izofluran% 2 (Şekil 1). Böyle hareket refleksleri ve düşük-dereceli ağrı duyarlılık testleri gibi basit reflekslerinin testi ile yeterli anestezi onaylayın. Prosedür genellikle toplam sadece 30 dakika / hayvan sürer, çünkü anestezi sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri merhem kullanılması önerilir, ancak vazgeçilmez değil. Sağkalım deneylerde durumunda, ameliyat sonrası ağrı yönetmek için zamanında uzun etkili analjezikler yönetmek.
- Elektrikli ustura ile arka bacaklarda kaplayan kürk tıraş ve hayvanlar analjezi altında zaten ise piyasada mevcut saç dökücü krem ile epilasyon gerçekleştirin. Prosedür boyunca patojen-serbest statülerini korumak için, aseptik eldiven giyin ve her zaman dikkatli bir şekilde% 70 etanol ile temizlenmiş araçlarını kullanın.
- Bir geri besleme kontrollü ısıtma plakası ve rektal ısı probu (Şekil 2) ile kontrol vücut ısısı kararlılığı. Eğer gerekli ise, steril bir deney ortamı tutmak için hayvanlar arasında, ısıtma plakası karşılamak için steril bir örtü kullanın. Ayrıca, elektronik olarak doku hasarını önlemek için 40 ° C ≤ için ısıtma sıcaklığı sınırlamak için entegre bir sensör ile kontrol edilir, bir ısıtma levhası, kullanımı tavsiye edilir.
Şekil 1. Exptıraşlı arka uzuvları ile bir anestezi fare gösteren erimental kurulum. - (EKG) kayıtları hayati bir parametre olarak kalp atışlarının izlenmesi için elektrokardiyografi çekmek. Boyun bölgesinde deri altında, her ön ayakları ve bir elektrot deri altında bir elektrot aşağıdaki gibidir: ECG kayıtları için üç elektrotlar yükleyin.
- Optimum iletkenlik / transfer direnci için iletişim jel kullanarak Sıra halka elektrotlar. (Siyah etiketli) algılama elektrodu gastrokinemius kası maksimum çapa sahip pozisyonda yerleştirilir. (Kırmızı ile gösterilen) referans elektrot sadece algılama elektrodu altındaki yerleştirilir.
Not: donanım detayları için 'Material tablo' bakınız. - Proksimal ve distal siyatik sinir uyarımı ve kurşun elektrot arasında önceden tespit edilmiş bir mesafe ile tutarlı fakat ölçüm doğru pozisyonları işaretleyin. Deneysel öneri: algılama elektrottan 4 mm'lik bir mesafede, uzak uyarım gerçekleştirilecektir.Algılama elektroda 16 mm'lik bir mesafede, proksimal stimülasyonu (Şekil 2) yürütülecektir.
Şekil 2.. Hemen önce ölçümlerin başına deneysel durumu gösteren Temsilcisi resim. Beyaz ok algılama (siyah) ve referans (kırmızı), sol arka bacak gastrocnemius kasında elektrot konumunu gösterir. İğne elektrotlar tarafından uyarım siyah algılama elektrodu için tanımlandığı konumlarda gerçekleştirilir. Distal stimülasyon noktası (sol arka bacakta "DS" ile siyah işareti) algılama elektrottan 4 mm'lik bir mesafe vardır; proksimal stimülasyon ("ps" ile siyah marka) yer uzaklıkta 16 mm'dir. Sağ arka bacak üzerinde kırmızı çizgi yakl gösterir siyatik sinirin anatomik ders Imate. Ayrıca, ilgili arka bacak kaslarının kaba pozisyonları işareti olarak gösterilmiştir. Yıldız işareti rektal ısı sondasını göstermektedir.
2. Ölçüm
- İlke: monopolar atılabilir 28 G iğne elektrotlar 0.1 msn süresince tekrar tekrar üretilen tek kare dalga darbeleri ile sinir uyarılarının bir dizi yapın (tekrarlama hızı 200 ms; bkz. Şekil 3A). Off-line veri analizi için, aynı anda nedeniyle sinir stimülasyonu için nöromüsküler işlev yanıt eğrisinde (Şekil 3B) ile birlikte uyarma sinyalleri elde etmek için tavsiye edilir. Sonraki veri analizi için maksimal yanıtları bir dizi ("temsilci nöromüsküler fonksiyonu yanıtı") ortalama. Güvenilir veri, kayıt ve stimülasyon site ve hayvan başına daha sonra ortalama en az 3 bağımsız, optimum tepki eğrileri üretmek için.
p_upload/51181/51181fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
Veri toplama ve analizi (şematik sunum) Şekil 3. Prosedür. Tekrar tekrar oluşturulan darbe iğne elektrot (Şekil 3A'da üst sıra) ile siyatik sinir uygulanır. Aynı zamanda, karşılık gelen çok sayıda nöromüsküler yanıt eğrileri (Şekil 3A'da alt satır) kaydedilir. Sinyal yanıtın Gecikme hem de süresi ve sinyalin genliği gösterilir ve can edilir: Ortalama ve büyütülmüş zaman nedeniyle uyarım darbeleri (Şekil 3B'de üst satır) nöromüsküler yanıt eğrileri, aşağıdaki karakteristik özellikleri (Şekil 3B'de alt sıra) göster sonraki hesaplamalar ve istatistik elde edilebilir. Düzensiz sinyal iletim ve / veya idare kayıtları genellikle sadece tek bir pozitif ve bir negatif sapma veya sinyal deformasyon daha fazla olan çeşitli sinyal deformasyonlar sonucuDüşük genlikli (Şekil 3C) ile (Bimodal şekli). - Belirlenmiş bir pozisyonda bir iğne elektrot (Şekil 2'de "PS") ile yakın stimülasyon yapın.
- Azami amplitüd ile en iyi kayıt koşulları elde etmek için, uyarım işlemine aynı anda fiili tepki eğrileri görselleştirmek. Böyle yaparak, deneyci hemen tepki eğrilerinin şekli hem de genlik boyutunu değerlendirmek edebilmektedir.
- Gerekirse, hafif ve dikkatli bir şekilde konumunu ve / veya siyatik sinir ile ilgili olarak uyarım iğne açısını işlemek. Uyarım koşulları bu nazik optimizasyon olası en büyük değeri ve tipik bifazik şekil bir yanıt eğrisi (Şekil 4) ile sürekli genlikleri ulaşılmasını sağlar.
- Belirlenmiş bir pozisyonda (Şekil 2'de "DS"), bir iğne elektrot ile distal stimülasyon yapın.
- Completio sonraBu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar n ölçümü, ayrı bir kafese test fare aktarmak. Tam anestezi kurtarıldı kadar sahipsiz diğer hayvanların şirket bir hayvan bırakmayın. Ameliyat sonrası ağrı yönetmek için zamanında artık oyunculuk analjezikler yönetmek. Steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID) ve opioid sistemik uygulama 1-3 gün için tavsiye edilir.
- Alternatif olarak, boyun çıkığı örneğin hayvan için herhangi bir başka ağrı olmadan hızlı ve insancıl bir şekilde hala anestezi fare kurban.
Şekil 4. Maksimum genlikli CMAP kayıtları belirlemek için İllüstrasyon. Eksiksiz bir kaydı serisi sunulmaktadır. (A (b) hafif stimülasyon iğne hareketi sonuçları. (C) iğne yerleştirme ek değişiklikler yakın maksimum genliklerinin dahil olmak üzere farklı genlikli CMAP kayıtları üretmek. Yakın-maksimum genliklerinin seri CMAP kayıtları ile (d) Uyarım iğne değiştirme. Not: CMAP amplitudes Tipik eksiltme stimülasyon sitesinde 12, 13, mükerrer uyarılma sırasında oluşabilir. Yıldız ortalama için gösterilen azami amplitüd ile CMAP kayıtlarını gösterir.
3. Analizi
- Uygun bir yazılım paketi (örneğin AtisaPro) kullanarak temsilcisi nöromüsküler fonksiyon tepki veri setine dayalı sinir iletim parametrelerini ayıklayın.
Not: özel bakım ile zamanla ilişkili verileri kararlılık idare edin çünkü bileşik motor aksiyon pot bükülme noktası tayiniential (CMAP) başlangıçlı ve sonlandırma zor olabilir. Doğrulanmış tekrarlanabildiğini bir prosedür başlangıcından sonra ve sona ermeden önce sinyal deplasmanlar üzerinde teğetlerinin kullanılan Şekil 3B, verilmiştir. - 'Sinyal gecikmesini' ve 'CMAP değerlerini hesaplayın.
- CMAP süresi 'Gecikme' ilk negatif sapma CAMP başlangıcı arasındaki zaman aralığı baz denir için dönüşünü alınmalarını ise, uyarılması ve CMAP başlangıcı arasındaki zaman gecikmesini temsil '. Uzak ve yakın stimülasyon siteler arasındaki mesafe ile birlikte iletim hızını hesaplamak için uzak ve yakın gecikmeleri arasındaki farkı kullanın.
stimülasyon siteler arasında iletim hızı = gecikme / mesafe - CMAP '(bileşik motor aksiyon potansiyeli) genlik (mV verilen) CMAP sinyalinin maksimum pozitif ve negatif dönüş noktası arasındaki büyüklüğünü temsil eder.
CMAP = değer 'olumlu bir dönüş noktası' - değerin 'negatif dönüş point '
- CMAP süresi 'Gecikme' ilk negatif sapma CAMP başlangıcı arasındaki zaman aralığı baz denir için dönüşünü alınmalarını ise, uyarılması ve CMAP başlangıcı arasındaki zaman gecikmesini temsil '. Uzak ve yakın stimülasyon siteler arasındaki mesafe ile birlikte iletim hızını hesaplamak için uzak ve yakın gecikmeleri arasındaki farkı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bir cinsiyet 6 hayvan: Bu çalışma için toplam 12 fareden oluşan siyatik sinirler üzerinde in vivo elektrofizyolojik ölçümler bir dizi yapılmıştır. Ölçümler sunulan protokol ile gerçekleştirilmiştir ve aşağıdaki sonuçlar elde edildi:
Hem erkek hem dişi farenin yaklaşık 20 m / sn 'lik bir ortalama siyatik sinir iletim hızı (Şekil 5) gösterir. Bu, literatürde diğer ölçümler ile tutarlıdır. Ayrıca, kadınlar ve erkekler arasındaki sinir iletim hızı hiç bir önemli farklılık bizim verilerine göre olduğunu gösteriyor.
In vivo olarak, erkek ve dişi farelere için ölçülen siyatik sinirinin Şekil 5,. Sinir iletim hızları.
In vivo olarak siyatik sinirinin Şekil 6,. CMAP amplitüdleri proksimal sonra (mor) ve distal (kırmızı) uyarılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokol, ilgi konusu siniri ortaya çıkarmak için gerek kalmadan, anestezi uygulanmış farelerde ilgili siyatik sinir iletim özelliklerini belirlemek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu deneysel prosedür İğne doku hasarına neden olur. Bu nedenle kayıtları bittikten sonra hayvanları kurban etmek makul bir seçenektir. Ancak önceki kayıtları sinirin pozlama gerektiren diğer invaziv işlemler karşılaştırıldığında, doku hasarı 3,14 nispeten küçük. Bu nedenle, tekrarlanan ölçümler yapmak mümkündür ve ilgili çalışma tasarımına bağlıdır. Ancak, bazı noktalar tutarlı sonuçlar temin etmek için dikkate alınması gerekir.
Optimum kayıt koşullarını gerçekleştirmek için, onu tam epilasyon, yaygın cilt temizliği ile ve mea sırasında uygun bir şekilde düşük gürültü seviyesi / kirlenmesini izin tüm bunların temas jel kullanılarak deri direncini azaltmak için önemlidirsurements.
Şekil 3B'de gösterildiği gibi, bundan başka, bu tespit edilen sinyallerin uygun, iki fazlı eğri şekiller aramak için önemlidir. Bazen, biz de yayılması antidrome sinyal veya bazı sinir dalları tarafından açıkça düzensiz sinyal iletim bir ürünüdür eğrileri algılar. Bu senaryo, tek bir pozitif daha fazla ve bir negatif sapma ya da bölünmüş bir sinyal şekli, düşük genlik ve / veya genişletilmesi sinyali (Şekil 3C), farklı şekil sinyal ile sonuçlanır. Kas stimülasyon noktasından klasik orthodrome sinyal yayılma sağlamak amacıyla, sadece o kayıtları Şekil 3B'de gösterildiği gibi, açık bir şekil arzeden quantifications için kullanılmalıdır.
Bu anestezi periferik sinirlerin elektrofizyolojik kayıtları etkileyebileceğini dikkate alınmalıdır. Önceki raporlar belirtilen bir için izofluran kullanımınesthesia nonanesthetized koşullar altında 14 CMAP ölçümü ile karşılaştırıldığında, belirgin CMAP değerlerini azaltır. Bununla birlikte, burada kullanılan prosedür, NCV üzerinde minimal etkisi vardır deneysel performans boyunca tekrarlanabilir verileri sunar ve farelerde 15 periferik sinir fonksiyonlarını değerlendirmek için anestezi en güvenli, en etkili yöntemdir.
Son olarak, bir siyatik sinir motorik ve duyusal hem de lif yolları içerdiğini dikkate sahiptir. Motor veya duyusal bileşenlerin ya ayrı bir analiz çünkü dış supra-maksimal sinir uyarımı ve isteyerek orthodrome sinyal yayılmasını kullanılan burada kullanım mümkün değildir. Bu sorunu gidermek için, biz de sural sinir 16, fare arka bacak yan ayak bileğinde teşvik edilebilir saf bir duyusal sinir elektrofizyolojik kayıtları yapılır. Bununla birlikte, sural sinirin küçük boyutu, aşağıdaki sorunlara yol açar: İlk olarak, tipik olarak, oldukça smakayıtları sırasında ll potansiyel büyüklüğü gelişmiş veri analizi gerekli elde edilebilmektedir. Kayıtları gerçekleştirmek için çalışırken, ikinci nedeniyle delinme çalışma kapsamında sural sinirin kaza yaralanma belli bir sayıda kaçınılması mümkün değildir.
Bizim durumumuzda siyatik sinir - - önce ölçümleri için başka protokoller 17 aksine, bu ilgi sinir çıkarmak için gerekli değildir. Korunmuş bir organizmadan kayıtları alarak, dokunulmamış sinir ortamının fizyolojik koşulları korunur. Ayrıca, farelere doku hasarı invaziv işlemler ile karşılaştırıldığında küçüktür.
Siyatik sinir göre uygun elektrot yerleştirme görünür teyit mümkün değildir, çünkü, diğer yandan, bu teknik kullanılarak sinir maruz eksikliği stimülasyondan tutarlı üretimi daha zor hale getirir. Bununla birlikte, recor sırasında yanıt eğrileri aynı anda izlenmesidings güvenilir uygun stimülasyon iğne konumlandırma tanımlamak için kolay bir yoldur.
Bu yöntemi kullanarak, nöromüsküler hastalıkların, var olan ve yeni fare modelleri uygun şekilde sinir iletim özellikleri açısından karakterize edilebilir: demiyelinizan fenotipler açıkça tarif edilen önceki bir çalışmada gösterildiği gibi, örneğin, esas olarak kas veya aksonal hastalıkların hayvan modellerinde ayırt edilebilir 7 yöntem gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma SFB 604, DFG MO 1421/2-1 ve Krebshilfe 107089 (HM) tarafından desteklenmiştir. Çocuk Tümörü Vakfı (New York, ABD) Genç Araştırmacı Ödülü alıcı AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
References
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F.
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M.
- Stalberg, E., Falck, B.
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
