Summary
Mätningar av nervledningsegenskaper in vivo exemplifiera ett kraftfullt verktyg för att karakterisera olika djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar. Här presenterar vi ett enkelt och tillförlitligt protokoll genom vilka elektrofysiologiska analys på ischiasnerver av sövda möss kan utföras.
Abstract
Elektrofysiologiska studier tillåter en rationell klassificering av olika neuromuskulära sjukdomar och är till hjälp, tillsammans med neuropatologiska tekniker, i förståelsen av den underliggande patofysiologin 1. Här beskriver vi en metod för att utföra elektrofysiologiska studier på mus ischiasnerver in vivo.
Djuren sövdes med isofluran i syfte att säkerställa analgesi för de testade mössen och ostört arbetsmiljö under mätningarna som tar ungefär 30 min / djur. En konstant kroppstemperatur på 37 ° C upprätthålls av en värmeplatta och kontinuerligt mätt genom en rektal termosonden 2. Dessutom är ett elektrokardiogram (EKG) rutinmässigt registreras under mätningarna för att kontinuerligt övervaka fysiologiska tillstånd av de undersökta djuren.
Elektrofysiologiska inspelningar utförs på ischiasnerven, den största nerven av the perifera nervsystemet (PNS), som levererar musen bakbenet med både motoriska och sensoriska fiberområden. I våra protokoll, ischiasnerver kvar på plats och därför inte behöver extraheras eller utsatta, vilket gör mätningar utan några negativa nerv irritationer tillsammans med faktiska inspelningar. Med hjälp av lämpliga nålelektroder 3 Vi utför både proximala och distala nerv stimuli, registrera de överförda potentialer med avkänningselektroderna på gastrocnemius muskler. Efter databearbetning, tillförlitlig och mycket konsekventa värden för nervledningshastighet (NCV) och föreningen motor aktionspotentialen (CMAP), de viktigaste parametrarna för kvantifiering av brutto perifer nerv funktion, som kan uppnås.
Introduction
Elektrofysiologiska mätningar är ett oumbärligt verktyg för att undersöka den funktionella integriteten hos perifera nerver i både kliniska och laboratoriemiljöer. Hos människor är ett stort antal av neuromuskulära sjukdomar och neuropatier förlita diagnostiskt på elektrofysiologiska mätningar. Genom att mäta nervegenskaper såsom ledningshastighet eller möjliga amplituder hos signalen, är det möjligt att karakterisera den grova ursprunget för perifera nervsjukdomar.
Den nervledningshastighet är starkt beroende av snabb signalutbredning aktiveras av myelination. Därför demyeliniserande processer i allmänhet visar minskad ledningshastigheter 4. Substansen motor aktionspotential (CMAP) - korrelerar med antalet funktionella axoner - är en indikator för axonal skada när minskas betydligt 5.
Sålunda genom elektrofysiologiska metoder etiologin för perifer nervskadakan särskiljas, som till ärftliga neuropatier 6,7, diabetisk neuropati 8,9, kronisk inflammatorisk demyeliniserande polyneuropatier (CIDP) 10, eller metaboliska neuropatier 11.
Normalt, i den mänskliga ansökan icke-invasiv inspelningar på sural eller ulnar nerven är att föredra. I möss, är det enkelt att analysera nerv egenskaper ischiasnerven, den största nerven i det perifera nervsystemet (PNS) som innehåller både stora - och finkalibriga axoner i den motoriska och sensoriska system.
Proceduren som demonstreras här är en snabb, enkel och tillförlitlig metod för att mäta alla standardvärden relevanta för elektrofysiologi på perifera nerver i intakta musen. Genom att ta inspelningar från en bevarad organism, är fysiologiska tillstånd av nerv miljö garanteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den aktuella studien utfördes enligt djurskyddslagen för Förbundsrepubliken Tyskland (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) och godkändes av statskontoret Thüringer för livsmedelssäkerhet och konsumentskydd (Thüringer Lande für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Installera de Mätningar
- Bedöva möss med isofluran / O 2 inandning - för initiering av anestesi 3%, för underhåll 2% isofluran i 100% syre (Figur 1). Bekräfta tillräckliga anestesi genom att testa enkla reflexer såsom rörelse reflexer och testning av känslighet för låggradig smärta. Användning av salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi rekommenderas men inte är nödvändiga eftersom proceduren tar normalt bara 30 min / djur totalt. Vid överlevnadsexperiment, administrera tid längre verkande analgetika för hantering av postoperativ smärta.
- Raka pälsen täcker bakbenen med en elektrisk rakapparat och utför hårborttagning med ett kommersiellt tillgängligt hår-borttagning grädde medan djur redan i smärtlindring. För att upprätthålla patogen status under hela förfarandet, bär aseptiska handskar och alltid använda instrument rengörs noggrant med 70% etanol.
- Kontroll kroppstemperatur stabilitet genom en återkoppling styrd värmeplatta och ändtarmstermosond (figur 2). Om det behövs, använd en steril duk för att täcka värmeplattan mellan djuren för att hålla en steril experimentell miljö. Vidare är det rekommenderat att använda en värmeplatta, som är elektroniskt styrda via en integrerad sensor för att begränsa uppvärmningstemperaturen till ≤ 40 ° C för att undvika vävnadsskada.
Figur 1. Experimental inställning visar en sövda mus med rakade bakbenen. - Ta elektrokardiografi (EKG) inspelningar för att övervaka hjärtfrekvens som en viktig parameter. Montera tre elektroder för EKG-registreringar enligt följande: en elektrod under huden på varje framben och en elektrod under huden i nacken.
- Placera ringelektroder som använder kontakt gel för optimal ledningsförmåga / överföringsmotstånd. Den avkännande elektroden (märkt i svart) är placerad i den position där gastrocnemius har sin största diameter. Referenselektroden (markerad med rött) är placerad precis under den avkännande elektroden.
Obs: Se "Material bord" för utrustningsdetaljer. - Kryssa för rätt positioner för mätning med förutbestämda men konsekventa avstånd mellan den proximala och distala ischiasnervstimulering och ledningen elektroden. Experimentell förslag: På ett avstånd av 4 mm från den avkännande elektroden, kommer den distala stimulering ske.På ett avstånd av 16 mm till den avkännande elektroden, kommer den proximala stimulering utföras (figur 2).
Figur 2. Representativ bild som visar den experimentella situationen just före början av mätningarna. Den vita pilen indikerar positionen av den avkännande (svart) och referens (röd) elektrod vid gastrocnemius av det vänstra bakbenet. Stimuleringen av nålelektroder kommer att utföras vid definierade positioner i förhållande till det svarta avkänningselektroden. Poängen med distala stimulering (svart märke med "ds" vid den vänstra bakbenet) har ett avstånd av 4 mm från den avkännande elektroden; platsen för proximal stimulering (svart märke med "ps") är 16 mm bort. Den röda linjen på den högra bakbenet visar ca Imate anatomiska loppet av ischiasnerven. Vidare är de grova positionerna för relevanta bakbensmusklerna visad som landmärken. Asterisken anger det rektala termisk sond.
2. Mätning
- Princip: Utför en serie nervstimulering med repetitivt genererade enkla fyrkantpulser av 0,1 ms varaktighet av monopolära engångs 28 G nålelektroder (repetitionsfrekvens 200 ms, se figur 3A). För off-line analys av data, rekommenderas att samtidigt förvärva stimuleringssignaler tillsammans med den neuromuskulära funktionen responskurvan (Figur 3B) på grund av nervstimulering. Medelvärdet en serie maximala svar ("representativt neuromuskulär funktion svar") för efterföljande dataanalys. För att producera tillförlitliga data, spela in och senare genomsnitt minst 3 oberoende, optimal svarskurvor per stimulering webbplats och djur.
p_upload/51181/51181fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
Figur 3. Förfarande för datainsamling och-analys (schematisk presentation). Upprepat alstrade pulserna matas till ischiasnerven via nålelektroder (övre raden i figur 3A). Samtidigt är flera motsvarande neuromuskulär respons-kurvor registrerades (nedre raden i figur 3A). När i medeltal och förstoras, neuromuskulära responskurvor på grund av stimuleringspulser (övre raden i figur 3B) visar följande karakteristiska egenskaper (undre raden i fig. 3B): Latens av signalsvaret liksom varaktigheten och amplituden hos signalen indikeras och kan erhållas för efterföljande beräkningar och statistik. Oregelbunden signalledning och / eller suboptimala inspelningar brukar resultera i olika signal deformationer med mer än bara en positiv och en negativ nedböjning eller signal deformation(Bimodal form) med reducerad amplitud (figur 3C). - Utför proximala stimulering med en nål elektrod vid bestämda positionen ("PS" i figur 2).
- För att uppnå bästa inspelningsförhållanden med maximala amplituder, visualisera den verkliga responskurvorna samtidigt till att stimulera processen. Genom att göra så, är den som utför experimentet omedelbart kunna bedöma formen på svarskurvor liksom storleken på amplitud.
- Om det är nödvändigt, lätt och noggrant manipulera positionen och / eller vinkeln på stimulering nålen med avseende på ischiasnerven. Denna milda optimering av stimuleringsförhållanden tillåter nå ständiga amplituder med största möjliga värde och en svarskurva av typiska bifasisk form (Figur 4).
- Utför distala stimulering med en nål elektrod vid bestämda positionen ("ds" i figur 2).
- Efter completion av mätning, överföra testade musen till en separat bur tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Lämna inte ett djur utan tillsyn och i sällskap med andra djur tills den har återhämtat sig helt från anestesi. Administrera tid längre verkande analgetika för hantering av postoperativ smärta. Systemisk administrering av icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) och opioider rekommenderas för 1-3 dagar.
- Alternativt offra fortfarande sövda musen på ett snabbt och humant sätt utan ytterligare smärta för djuret, t.ex. genom hals störningen.
Figur 4. Illustration att bestämma CMAP inspelningar med maximala amplituder. En komplett registreringsserie presenteras. (A (B) Lätt stimulering nål rörelse resultat i CMAP inspelningar med maximala amplituder. (C) Ytterligare ändringar i nål placering producerar CMAP inspelningar med olika amplituder även nära-max amplituder. (D) Stimulering nål ersättning med serie CMAP inspelningar av nästan maximala amplituder. OBS: Typisk minskning i CMAP amplituder kan uppstå under repetitiv stimulering vid optimal stimulering plats 12, 13. Asterisker indikerar CMAP inspelningar med maximala amplituder avbildade för medelvärdesbildning.
3. Analys
- Utdrag nervledningsparametrar baserade på representativa neuromuskulär funktion svarsdatauppsättning med hjälp av en lämplig mjukvara (t.ex. AtisaPro).
Notera: Vänligen hantera tidsrelaterade data bestämning med särskild omsorg eftersom brytpunkt bestämning av förening motor åtgärder pottential (CMAP) debut och uppsägning kan vara svårt. Ett förfarande med verifierad reproducerbarhet ges i figur 3B, där tangenter på signal omläggning efter insjuknandet och innan uppsägning används. - Beräkna "signal latency" och "CMAP värderingar.
- Latency "representerar tidsfördröjningen mellan stimulans och CMAP debut, medan den tidsrymden mellan CAMP uppkomsten av det negativa omläggning till första återgång till baslinjen kallas" CMAP varaktighet ". Använd skillnaden mellan distala och proximala latenser att beräkna ledningshastighet tillsammans med avståndet mellan distala och proximala stimulerings webbplatser.
ledningshastighet = latens / avstånd mellan stimulerings platser - CMAP "(förening motor aktionspotential) amplituden representerar magnituden mellan maximal positiv och negativ vändning punkt i CMAP signalen (ges i mV).
CMAP = värde 'positiv vändning punkt "- värde" negativ vändning point '
- Latency "representerar tidsfördröjningen mellan stimulans och CMAP debut, medan den tidsrymden mellan CAMP uppkomsten av det negativa omläggning till första återgång till baslinjen kallas" CMAP varaktighet ". Använd skillnaden mellan distala och proximala latenser att beräkna ledningshastighet tillsammans med avståndet mellan distala och proximala stimulerings webbplatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har utfört en serie av in vivo-elektrofysiologiska mätningar på ischiasnerver av 12 möss totalt för denna studie: 6 djur av varje kön. Mätningarna utfördes med den presenterade protokollet och levereras följande resultat:
Både manliga och kvinnliga möss visar en medelischiasnervledningshastighet på cirka 20 m / sek (fig 5). Detta överensstämmer med andra mätningar i litteraturen. Dessutom visar det sig att det inte finns några relevanta skillnader i nervledningshastighet mellan män och kvinnor enligt våra uppgifter.
Figur 5. Nervledningshastigheter i ischiasnerven mättes för manliga och kvinnliga möss in vivo.
Figur 6. CMAP amplituder efter proximal (lila) och distala (röd) stimulering av ischiasnerven in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna protokollet ger en enkel och tillförlitlig metod för att bestämma ischiasnervledningsegenskaper på sövda möss utan att behöva utsätta nerven av intresse. Dock orsakar denna experimentella förfarande vävnadsskada genom nålstick. Det är därför en rimlig möjlighet att offra djuren efter att ha avslutat inspelningarna. Men jämfört med andra mer invasiva procedurer som kräver exponeringen av nerven innan inspelningarna, är vävnadsskada jämförelsevis liten 3,14. Därför upprepade mätningar är möjliga och beror på utformningen av respektive studie. Vissa punkter måste beaktas för att säkerställa konsekventa resultat.
För att kunna utföra optimala inspelningsförhållanden, är det viktigt att minska hudens motstånd från komplett hårborttagning, omfattande hud rengöring och genom att använda kontakt gel, som alla tillåter en lämpligt låg ljudnivå / förorening under meaarna.
Vidare är det viktigt att söka efter optimala, bifasiska kurvformer hos de detekterade signalerna, såsom visas i figur 3B. Ibland, vi upptäcker också kurvor som är uppenbarligen en produkt av oregelbunden signalledning genom antidrome signal spridning eller av vissa nervgrenar. Detta scenario leder till olika signal deformationer med mer än bara en positiv och en negativ nedböjning eller med en delad signalform, minskad amplitud och / eller breddat signal (figur 3C). För att säkerställa den klassiska orthodrome signalutbredning från punkten av stimulering till muskeln, bör endast de inspelningar användas för kvantifieringar som visar en tydlig form, såsom visas i figur 3B.
Det måste tas hänsyn till att narkos kan påverka elektrofysiologiska inspelningar på perifera nerver. Tidigare rapporter indikerade att användning av isofluran under ennesthesia minskar CMAP värden markant, jämfört med CMAP mätning under nonanesthetized förhållanden 14. Trots detta har det häri använda förfarandet minimal påverkan på NCV, ger reproducerbara data genom den experimentella resultat och är den säkraste, mest effektiva metoden för anestesi för att bedöma perifera nervfunktioner i möss 15.
Slutligen måste man överväga att ischiasnerven innehåller både motoriska och sensoriska fiberområden. En separat analys av vare sig motor eller sensoriska komponenter är omöjligt på grund av den här använda externa supra-maximal nervstimulering och inducerad orthodrome signalutbredning. För att åtgärda detta problem, vi också utfört elektrofysiologiska inspelningar från sural nerven 16, en ren sensorisk nerv som kan stimuleras vid den laterala ankeln av musens bakbenet. Men den lilla storleken på sural nerv leder till följande problem: För det första, vanligtvis en ganska small potentiell storlek under inspelningarna kan erhållas som krävs avancerad dataanalys. För det andra kan ett visst antal olycksfall i sural nerv i studien på grund av punktering inte undvikas samtidigt försöker åstadkomma inspelningar.
I motsats till andra protokoll 17, är det inte nödvändigt att extrahera nerven av intresse - i vårt fall ischiasnerven - före mätningarna. Genom att ta inspelningar från en bevarad organism, är fysiologiska förhållanden i den intakta nervmiljön bevaras. Vidare är vävnadsskador till mössen liten jämfört med mer invasiva procedurer.
Å andra sidan, gör bristen på nerv exponering med denna teknik konsekvent reproduktion av stimuleringar svårare eftersom synlig bekräftelse på korrekt placering av elektroderna med avseende på ischiasnerven är inte möjlig. Men samtidig övervakning av svarskurvorna under recorDings är ett enkelt sätt att på ett tillförlitligt sätt fastställa korrekt stimulering nål positionering.
Med denna metod kan olika befintliga och nya musmodeller av neuromuskulära sjukdomar ordentligt karaktäriseras i termer av nervledningsegenskaper: Demyeliniserande fenotyper klart kan särskiljas från djurmodeller av främst muskel eller axonal sjukdomar, t ex som visas i ett tidigare arbete där det beskrivs metod har utförts 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av SFB 604, DFG MO 1421/2-1 och Krebshilfe 107.089 (HM). AS är mottagare av en Young Investigator Award från Barnens Tumör Foundation (New York, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
References
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F.
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M.
- Stalberg, E., Falck, B.
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
