Summary
Målinger af nerveledningen egenskaber in vivo eksemplificere et kraftfuldt værktøj til at karakterisere forskellige dyremodeller for neuromuskulære sygdomme. Her præsenterer vi en nem og pålidelig protokol, som kan udføres elektrofysiologiske analyser om ischiadicus nerver af bedøvede mus.
Abstract
Elektrofysiologiske undersøgelser tillader en rationel klassificering af forskellige neuromuskulære sygdomme og er af hjælp, sammen med neuropatologiske teknikker, i forståelsen af den underliggende patofysiologi 1.. Her beskriver vi en metode til at udføre elektrofysiologiske undersøgelser af mus iskiasnerver in vivo.
Dyrene bedøves med isofluran for at sikre analgesi for de testede mus og uforstyrret arbejdsmiljø under målingerne, der tager omkring 30 min / dyr. En konstant kropstemperatur på 37 ° C fastholdes af en varmeplade og kontinuerligt målt ved en rektal thermo føler 2. Derudover er et elektrokardiogram (EKG) rutinemæssigt registreres under målingerne med henblik på løbende at overvåge den fysiologiske tilstand af de undersøgte dyr.
Elektrofysiologiske optagelser udføres på iskiasnerven, den største nerve af the perifere nervesystem (PNS), der leverer musebagbenet med både motoriske og sensoriske fibre skrifter. I vores protokol, forblive iskiasnerver in situ og derfor ikke behøver at blive udtrukket eller udsættes, så målinger uden nogen negative nerve irritationer sammen med faktiske optagelser. Brug passende nåleelektroder 3 vi udfører både proksimale og distale nerve stimuleringer, registrere de transmitterede potentialer med følerelektroder på gastrocnemius muskler. Efter databehandling, pålidelig og yderst konsekvente værdier for nerveledningshastighed (NCV) og kompoundmotor handling potentiale (CMAP) de vigtigste parametre for kvantificering af grov perifer nerve funktion, der kan opnås.
Introduction
Elektrofysiologiske målinger er et uundværligt redskab til at undersøge den funktionelle integritet af perifere nerver i både kliniske og laboratoriemæssige miljøer. Hos mennesker, en lang række neuromuskulære lidelser og neuropatier diagnostisk afhængige elektrofysiologiske målinger. Ved at måle nerve egenskaber ledningshastighed eller potentielle amplituder af signalet, er det muligt at karakterisere den ru oprindelse perifere nervesygdomme.
Den nerveledningshastighed er meget afhængig af hurtig signaludbredelse aktiveret af myelinering. Derfor demyeliniserende processer generelt viser nedsat ledningshastigheder 4. Den kompoundmotor handling potentiale (CMAP) - korrelerer med antallet af funktionelle axoner - er en indikator for axonal skade, når væsentligt reduceret 5.
Således ved hjælp af elektrofysiologiske metoder ætiologien af perifer nerveskadekan diskrimineres, såsom arvelige neuropatier 6,7, diabetisk neuropati 8,9, kroniske inflammatoriske demyeliniserende polyneuropatier (CIDP) 10 eller metaboliske neuropatier 11.
Normalt i den menneskelige ansøgning invasive optagelser på sural eller albueregionen foretrækkes. Hos mus er det ligetil at analysere nerve egenskaber iskiasnerver, den største nerve det perifere nervesystem (PNS), der indeholder både store - og små kaliber axoner af motorisk og sensorisk system.
Proceduren som påvist her er en hurtig, nem og pålidelig metode til at måle alle standard værdier er relevante for elektrofysiologi på perifere nerver i intakte mus. Ved at tage optagelser fra en konserveret organisme, er fysiologiske betingelser for nerven miljø sikres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nærværende undersøgelse blev udført i overensstemmelse med beskyttelse af dyr Act Forbundsrepublikken Tyskland (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) og blev godkendt af Thüringer State kontor for fødevaresikkerhed og forbrugerbeskyttelse (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1.. Opsætning Målinger
- Bedøve musene med isofluran / O 2 indånding - til indledning af anæstesi 3%, for vedligeholdelse 2% isofluran i 100% oxygen (fig. 1). Bekræft tilstrækkelige anæstesi ved at teste simple reflekser såsom bevægelse reflekser og test af følsomhed for lav kvalitet smerter. Brug af salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi anbefales, men ikke påkrævet, da det tager typisk kun 30 min / dyr i alt. I tilfælde af overlevelse eksperimenter, administrere rettidig længere virkende analgetika til styring postoperative smerter.
- Barbere pelsen dækker bagbenene med en elektrisk barbermaskine og udføre hårfjerning med en kommercielt tilgængelig hårfjerning creme, mens dyrene er allerede under analgesi. For at opretholde patogen status under hele proceduren, slid aseptiske handsker og altid bruge instrumenter omhyggeligt rengøres med 70% ethanol.
- Kontrolorgan temperaturstabilitet ved en feedback varmeplade og rektal termo-probe (figur 2). Hvis det er nødvendigt, skal du bruge et sterilt afdækningsstykke til at dække varmepladen mellem dyrene for at holde et sterilt eksperimenterende miljø. Endvidere anbefales det at anvende en varmeplade, som styres elektronisk via en integreret sensor at begrænse opvarmningstemperaturen til ≤ 40 ° C for at undgå vævsbeskadigelse.
Figur 1 Exp.erimental setup viser en bedøvet mus med barberede bagben. - Tag elektrokardiografi (EKG) optagelser til at overvåge puls som en vital parameter. Installer tre elektroder til EKG-undersøgelser som følger: en elektrode under huden på hver forben og en elektrode under huden i nakken.
- Place ringelektroder hjælp kontakt gel for optimal modstand ledningsevne / overførsel. Måleelektroden (mærket med sort) er placeret ved den position, hvor musculus gastrocnemius har sin maksimale diameter. Henvisningen elektrode (angivet med rødt) er placeret lige under måleelektroden.
Bemærk: Se 'Material bord "for udstyr detaljer. - Marker de korrekte positioner til måling med forudbestemte men konsekvente afstande mellem proksimal og distal iskiasnerven stimulation og den ledende elektrode. Eksperimentel forslag: I en afstand på 4 mm fra den følende elektrode, vil den distale stimulation finde sted.I en afstand på 16 mm til måleelektroden, bliver den proximale stimulation skal udføres (figur 2).
Figur 2. Repræsentant billede, der viser den eksperimentelle situationen lige før begyndelsen af målingerne. Den hvide pil angiver positionen af følerelementet (sort) og reference (rød) elektrode i musculus gastrocnemius i venstre bagben. Stimulering af nåleelektroder vil blive udført på definerede positioner i forhold til det sorte sensorelektroden. Pointen med distal stimulation (sort mærke med "DS" i venstre bagben) har en afstand af 4 mm fra måleelektroden; stedet af proksimal stimulation (sort mærke med "ps") er 16 mm væk. Den røde linje på højre bagben viser ca Imate anatomisk løbet af iskiasnerven. Desuden de uslebne positioner relevante bagben muskler er vist, som vartegn. Stjernen angiver rektal termisk sonde.
2.. Måling
- Princip: Udfør en serie af nerve stimulationer med gentagne genererede enkelt firkantpulser 0,1 ms varighed ved monopolære engangs 28 g nåleelektroder (gentagelse sats 200 msek, se figur 3A). For off-line analyse af data, anbefales det samtidigt at erhverve stimulation signaler sammen med den neuromuskulære funktion respons kurve (figur 3B) på grund af nervestimulation. Gennemsn.forbrug en række maksimale responser ("repræsentant neuromuskulære funktion svar") for efterfølgende analyse af data. For at kunne producere pålidelige data, registrere og senere gennemsnit mindst 3 uafhængige, optimale respons kurver pr stimulation websted og dyr.
p_upload/51181/51181fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
Figur 3.. Procedure for dataopsamling og-analyse (skematisk præsentation). Er gentagne genererede impulser anvendes på iskiasnerven via nåleelektroder (øverste række i figur 3A). Samtidig er indspillet flere tilsvarende neuromuskulære respons kurver (nederste række i figur 3A). Når gennemsnit og forstørret, neuromuskulære respons-kurver skyldes stimulationsimpulser (øverste række i figur 3B) viser følgende karakteristiske egenskaber (nederste række i figur 3B): Latency af signalet respons samt varigheden og amplituden af signalet er angivet og kan opnås for efterfølgende beregninger og statistikker. Uregelmæssig signal varmeledning og / eller suboptimale optagelser normalt resultere i forskellige signal deformationer med mere end blot en positiv og en negativ afbøjning eller signal deformation(Bimodal form) med reduceret amplitude (figur 3C). - Udfør proximale stimulering med en nål elektrode bestemte position ("ps" i figur 2).
- For at opnå de bedste optageforhold med maksimale amplituder, visualisere den faktiske responskurver samtidige til stimulering proces. Ved at gøre dette, forsøgslederen er i stand til straks at vurdere formen af responskurver samt størrelsen af amplituden.
- Hvis det er nødvendigt, let og forsigtigt manipulere positionen og / eller vinklen af stimulering nål med hensyn til iskiasnerven. Denne milde optimering af stimulation betingelser tillader nå konstante amplituder med den størst mulige værdi og en respons kurve for typisk bifasisk form (figur 4).
- Udfør distale stimulering med en nål elektrode bestemte position ("ds" i figur 2).
- Efter completion måling, overføre den testede mus til et separat bur, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Efterlad ikke et dyr uden opsyn, og i selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi. Administreres rettidig længere virkende analgetika til styring postoperative smerter. Systemisk administration af non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) og opioider anbefales for 1-3 dage.
- Alternativt ofre stadig bedøvet mus på en hurtig og human måde uden yderligere smerte for dyret, fx ved hals uro.
Figur 4.. Illustration til at bestemme CMAP optagelser med maksimale amplituder. En komplet registrering serien præsenteres. (A (B) Let stimulation nål bevægelse resulterer i CMAP optagelser med maksimale amplituder. (C) Yderligere ændringer i nåleplacering producere CMAP optagelser med forskellige amplituder, herunder nær-maksimum amplituder. (D) fremme udskiftning af nål med serielle CMAP optagelser af nær-maksimale amplituder. Bemærk: Typisk decrement i CMAP amplituder kan opstå under gentagen stimulation ved optimal stimulation stedet 12, 13. Stjerner angiver CMAP optagelser med maksimale amplituder afbildet for gennemsnit.
3. Analyse
- Uddrag nerveledningen parametre baseret på repræsentative neuromuskulære funktion svar datasæt ved hjælp af en passende software-pakke (f.eks AtisaPro).
Bemærk: håndtere tid-relaterede data beslutsomhed med særlig omhu, fordi vendepunkt bestemmelse af kompoundmotor handling potential (CMAP) indtræden og ophør kan være svært. En procedure med verificerede reproducerbarhed er givet i figur 3B, hvor der anvendes tangenter på signal omlægninger efter starten og før opsigelsen. - Beregn 'signal latenstid "og" CMAP' værdier.
- Latency 'repræsenterer tidsforsinkelsen mellem stimulation og CMAP debut, mens tidsrummet mellem CAMP debut af første negativ afbøjning til indledende tilbagevenden til baseline hedder' CMAP varighed «. Brug forskellen mellem de distale og proximale latenstider at beregne ledningshastighed sammen med afstanden mellem de distale og proximale stimulation sites.
ledningshastighed = latency / afstanden mellem stimulation sites - CMAP '(kompoundmotor handling potentiale) amplitude repræsenterer størrelsesorden mellem maksimal positiv og negativ turnaround punkt i CMAP signalet (givet i mV).
CMAP = værdi 'positive turnaround point' - værdi "negativ turnaround point '
- Latency 'repræsenterer tidsforsinkelsen mellem stimulation og CMAP debut, mens tidsrummet mellem CAMP debut af første negativ afbøjning til indledende tilbagevenden til baseline hedder' CMAP varighed «. Brug forskellen mellem de distale og proximale latenstider at beregne ledningshastighed sammen med afstanden mellem de distale og proximale stimulation sites.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har foretaget en række in vivo elektrofysiologiske målinger på ischiadicus nerver af 12 mus i alt for denne undersøgelse: 6 dyr af hvert køn. Målingerne blev udført med den præsenterede protokol og leveret følgende resultater:
Både han-og hunmus vise en gennemsnitlig iskiasnerven ledningshastigheden på cirka 20 m / sek (figur 5). Dette er i overensstemmelse med andre målinger i litteraturen. Det viser desuden, at der ikke er nogen relevante forskelle i nerveledningen hastighed mellem mænd og kvinder i henhold til vores data.
Figur 5.. Nerve ledningshastigheder af iskiasnerven målt for han-og hunmus i vivo.
Figur 6. Cmap amplituder efter proximale (lilla) og en distal (rød) stimulation af iskiasnerven in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol giver en nem og pålidelig metode til at bestemme iskiasnerven ledningsforstyrrelser egenskaber på bedøvede mus uden at det er nødvendigt at udsætte nerve af interesse. Ikke desto mindre er denne eksperimentelle procedure forårsager vævsskade ved nålestik. Det er derfor en rimelig mulighed for at ofre dyr efter endt optagelserne. Men sammenlignet med andre mere invasive procedurer, som kræver eksponering af nerven før optagelser, vævsskade er sammenligneligt lille 3,14. Er derfor gentagne målinger muligt og afhænger af udformningen af den pågældende undersøgelse. Visse punkter har imidlertid anses for at sikre ensartede resultater.
For at udføre optimale optageforhold, er det vigtigt at reducere hudens modstand ved fuldstændig hårfjerning, omfattende hud rengøring og ved hjælp af kontakt-gel, som alle, der tillader en passende lavt støjniveau / kontaminering under measurements.
Desuden er det vigtigt at se for optimale, bifasiske kurveformer for de detekterede signaler som vist i figur 3B. Indimellem har vi også opdage kurver, der tydeligvis et produkt af uregelmæssig signal ledning gennem antidrome signal spredning eller af nogle nerve filialer. Dette scenario resulterer i forskellige signaltyper deformationer med mere end blot en positiv og en negativ afbøjning eller med en delt signal form, reduceret amplitude og / eller udvidet signal (figur 3C). For at sikre den klassiske orthodrome signaludbredelse fra punkt stimulering af muskler, bør kun de optagelser anvendes til kvantificering, der viser en klar form som vist i figur 3B.
Det skal tages i betragtning, at anæstesi kan påvirke elektrofysiologiske optagelser på perifere nerver. Tidligere rapporter viste, at anvendelse af isofluran tilnesthesia reducerer CMAP værdier markant i forhold til CMAP måling under nonanesthetized betingelser 14. Ikke desto mindre er det heri anvendte procedure har minimal indvirkning på NCV, leverer reproducerbare data i hele den eksperimentelle resultater og er den sikreste, mest effektive metode til bedøvelse for at vurdere perifere nerve funktioner i mus 15.
Endelig må man overveje at iskiasnerven indeholder både motoriske og sensoriske fibre skrifter. En separat analyse af hverken motor eller sensorisk komponenter er umulig på grund af de heri anvendte ekstern supra-maksimal nerve stimulation og induceret orthodrome signal formering. For at løse dette problem, vi også udført elektrofysiologiske optagelser fra sural nerve 16, en ren sensorisk nerve, der kan stimuleres på den laterale ankel af musens bagben. Men den lille størrelse af sural nerve fører til følgende problemer: For det første, typisk en temmelig small potentielle størrelse under optagelser kan opnås, som kræves sofistikerede dataanalyse. For det andet kan en række utilsigtede skader i sural nerve under undersøgelsen på grund af punktering ikke undgås, mens du prøver at udrette optagelser.
I modsætning til andre protokoller 17, er det ikke nødvendigt at ekstrahere nerven af interesse - i vores tilfælde iskiasnerven - forud for målingerne. Ved at tage optagelser fra et fredet organisme, er fysiologiske betingelser for intakte nerve miljø bevaret. Endvidere vævsskader musene er lille sammenlignet med mere invasive procedurer.
På den anden side manglen på nerve eksponering ved hjælp af denne teknik gør konsekvent gengivelse af stimulationer vanskeligere, da synlig bekræftelse af korrekt elektrodeplacering med hensyn til iskiasnerven er ikke mulig. Men samtidig overvågning af respons kurver under recordings er en nem måde at pålideligt definere ordentlig stimulation nål positionering.
Ved hjælp af denne metode kan forskellige eksisterende og nye musemodeller af neuromuskulære sygdomme ordentligt karakteriseres i form af nerveledningen egenskaber: Demyeliniserende fænotyper klart kan skelnes fra dyremodeller af primært muskuløs eller axonale sygdomme, fx som vist i et tidligere arbejde, hvor den beskrevne Metoden er blevet udført 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af SFB 604, DFG MO 1421/2-1 og Krebshilfe 107089 (HM). AS er modtager af en Young Investigator Award fra Børns Tumor Foundation (New York, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
References
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F. Electrophysiological studies in diabetic neuropathy. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 33, 442-452 (1970).
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M. Electromyography in disorders of neuromuscular transmission. Sem. Neurol. 10, 6-11 (1990).
- Stalberg, E., Falck, B. The role of electromyography in neurology. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 103, 579-598 (1997).
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
