Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Proteoom analyse van de cochleaire sensorische epitheel kan een uitdaging vanwege zijn kleine formaat en omdat membraaneiwitten zijn moeilijk te isoleren en te identificeren. Zowel membraan en oplosbare eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door meerdere preparatieve methoden en scheidingstechnieken gecombineerd met hoge-resolutie massaspectrometrie.

Abstract

Proteomics is een veel gebruikte aanpak die inzicht kan geven in complexe biologische systemen. De cochleaire sensorische epitheel bevat receptoren die de mechanische energie van het geluid transduceren in een elektro-chemische energie verwerkt door de perifere en centrale zenuwstelsel. Verschillende proteomische technieken ontwikkeld om het cochleair binnenoor, zoals twee-dimensionale differentiële gel elektroforese (2D-DIGE), antilichaam microarray en massaspectrometrie (MS) te bestuderen. MS is de meest uitgebreide en veelzijdige tool in proteomics en in combinatie met scheidingsmethoden kan een diepgaand proteoom van biologische monsters. Scheidingsmethoden gecombineerd met MS heeft de mogelijkheid te verrijken eiwitmonsters, detecteren lage molecuulgewicht en hydrofobe eiwitten en identificatie lage overvloedige eiwitten doordat het proteoom dynamisch bereik. Verschillende digestie strategieën kunnen worden toegepast op hele lysaat of gefractioneerd eiwit lysaat peptide en eiwitten verbeterensequence dekking. Gebruik van verschillende scheidingstechnieken, zoals sterke kationenwisselaar (SCX), omgekeerde fase (RP), en geëlueerd vloeibare fractie entrapment elektroforese (GELFrEE) kan worden toegepast om de complexiteit monster verminderen voorafgaand aan MS analyse voor proteïne-identificatie.

Introduction

Proteomics is de studie van complexe biologische systemen door analyse van eiwitexpressie functie modificaties en interacties 1. Verscheidene werkwijzen zijn gebruikt voor proteoomanalyse van het binnenoor, waaronder antilichaam microarray 2, tweedimensionale gelelektroforese 3-5 en DIGE 6. Echter, slechts een beperkt aantal eiwitten geïdentificeerd en gekarakteriseerd 2,7-10, vergeleken met de meer dan 10.000 genen uitgedrukt sequence tags (EST's) die in het binnenoor 11,12, MS is de meest gebruikte techniek en uitgebreide in proteomics voor eiwitkarakterisering. Analyse van complexe proteomics monsters, zoals het slakkenhuis, kan een uitdaging zijn. De combinatie van verschillende scheidingstechnieken MS maakt de identificatie van een groter aantal peptiden en eiwitten, vanwege een verhoogd dynamisch concentratiebereik en piekvermogen 13. Multidimensionale chromatogPHY vermindert zeer complexe eiwitmengsels door het gebruik van verschillende adsorptie mechanismen. Er zijn twee veelgebruikte MS proteoom analyse benadering, shotgun en bottom-up proteomics. In shotgun proteomics, is een mengsel van intacte eiwitten enzymatisch gedigereerd en gescheiden onder toepassing multidimensionale chromatografie met sterke kation-uitwisselingschromatografie (SCX) gevolgd door omgekeerde fase vloeistofchromatografie (RPLC) 14,15. De afgescheiden peptiden worden onderworpen aan tandem MS en gegevensverzamelingzoeken 15. Een groot voordeel van deze techniek is dat duizenden proteïnen kunnen worden geïdentificeerd in een enkele analyse en de techniek beter geschikt voor membraaneiwitten.

In de bottom-up benadering wordt het eiwit mengsel gescheiden, meestal door een-of tweedimensionale elektroforese, en het individuele eiwit banden of vlekken uitgesneden en geknipt met een enzym zoals trypsine, meestal resulterend in meerdere peptiden. Echter, andere recenterly ontwikkeld elektroforetische benadering, gebruikt in een bottom-up proteomics, is GELFrEE. Deze techniek fractioneert eiwitmonsters in vloeibare fase en maakt ze minder complex vóór de analyse. Deze techniek is reproduceerbaar, uitgerust met eiwitterugwinning en vermindert de distributie van high overvloedige proteïnen in complexe eiwitmonsters 16. Peptiden, als gevolg van gescheiden eiwitten, worden geanalyseerd door MS, door gebruik te maken peptidemassa fingerprinting of tandem MS (MS / MS), om sequence tags te creëren voor de database zoeken 17-19. Enkele van de belangrijkste voordelen van het gebruik van de bottom-up benadering zijn de mogelijkheid om hoge-resolutie scheidingen en uitgebreide eiwit dekking te verkrijgen. Bottom-up proteomics is de meest gebruikte techniek proteomics 20 derhalve verscheidene bioinformatica hulpmiddelen beschikbaar. Daarnaast kunnen eiwitten worden gescheiden in een complex mengsel vóór vertering, zodat er een grotere kans op identificatie.

Een van de grote uitdagingenin het gebruik van het binnenoor voor proteomics analyse is het kleine formaat, beperkte toegankelijkheid en celtype diversiteit 21. Bovendien belangrijkste eiwitten die de functionaliteit onderscheiden, zoals ionkanalen, transporters en receptoren, zijn membraaneiwitten, die moeilijk zijn te isoleren 22. Dus kan het filter-aided monstervoorbereiding (FASP) is voordelig voor proteomics analyses van weefsels die zijn beperkt voor eiwitextractie en dat wasmiddelen vereisen om membranen 23 oplosbaar te maken. Deze filtering maakt het MS analyse van membraan en oplosbare eiwitten en op het vermogen om peptiden te isoleren uit laagmoleculaire verontreinigingen 23,24.

Het onderhavige protocol beschrijft gebruikte proteomische benaderingswijzen die worden gecombineerd en aangepast aan zowel oplosbare als membraaneiwitten analyseren en het aantal eiwit ID van cochleaire sensorische epitheel maximaliseren. We zullen beschrijven met behulp shotgun proteomics met FASP multi-verterenion, ionenuitwisselingschromatografie, hoge resolutie MS en gegevensanalyse. Daarnaast zullen we bottom-up proteomics met GELFrEE, FASP multi-spijsvertering, hoge resolutie MS, en data-analyse te beschrijven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring

Experimenten met muizen weefsel werden goedgekeurd door de Universiteit van Zuid-Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite (Protocollen 3931R, 3482R) zoals uiteengezet onder de richtlijnen van de National Institutes of Health.

1. Protein Extraction

  1. Isoleer cochleair sensorische epitheel van 16 30 dagen oude (P30) CBA / J muizen en bewaar bij -80 ° C.
  2. Op de dag van het experiment, was weefsel met 500 ui 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer gedurende 3 min bij 1000 xg en verwijder het supernatant. Herhaal voor een totaal van drie wassingen.
  3. Sonificeer weefsel voor 30 seconden op ijs in 100 pl lysisbuffer bevattende 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / ml AEBSF, 10 ug / ml leupeptine, 100 ug / ml pepstatine, 2 ug / ml aprotinine en 0,5 ug / ml microcystine met een sonische dismembrator (Model 100, Thermo Fisher). Cool lysaat op ijsgedurende 1 minuut tussen elke sonicatie. Ultrasone trillingen in totaal 3x.
  4. Centrifugeer het extract bij 750 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant naar een nieuwe microbuisjes. Extraheer de pellet in 50 ul lysisbuffer door sonicatie gedurende 30 seconden op ijs. Centrifugeer het extract bij 750 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten. Combineer lysaten en centrifugeer bij 28.600 xg bij 4 ° C gedurende 60 minuten. Verwijder het supernatant naar een nieuwe microbuisjes en voeg 20 ul lysisbuffer die 0,1% ASB-14 aan de pellet. Vortex gedurende 1 min en incubeer gedurende 60 minuten bij 4 ° C.
  5. Verwarm het monster bij 95 ° C gedurende 5 min, daarna afkoelen bij 4 ° C gedurende 60 minuten. Volgen met centrifugatie bij 16.000 xg bij 25 ° C gedurende 10 minuten. Gebruik de bovenstaande vloeistof en over te dragen aan een nieuwe buis.
  6. Centrifugeer de suspensie bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 min en bewaar het supernatant voor de spijsvertering.

2. Dubbele Tryptic eiwitvertering van Whole Lysate behulp FASP

  1. Voeg een 30 μl aliquot (≤ 400 ug) van cochleaire eiwitextracten, bevattende 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 en 0,1 M dithiothreitol (DTT) rechtstreeks naar een 30K centrifugefilter en meng met 200 gl 8 M ureum in Tris-HCl. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten.
  2. Verdun het concentraat met 200 pi 8 M ureumoplossing en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten.
  3. Voeg 10 ul van 10x joodacetamide (IAA) in 8 M ureumoplossing aan het concentraat in het filter en vortex gedurende 1 minuut. Incubeer de spin filter gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) in het donker, gevolgd door centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 10 minuten.
  4. Voeg 100 ul van 8 M ureumoplossing aan het concentraat op de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten. Herhaal deze stap 2x. Voeg 100 ul van 50 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) oplossing van de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 2x.
  5. Voeg 0,4 ug / ul trypsine in 1:100 (w / w) enzym naar-Eiwitverhouding en incubeer overnacht (O / N) bij 37 ° C.
  6. Na incubatie, voeg 40 ul van 50 mM ABC oplossing eenheid en centrifugeer bij 14.000 xg filter gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 1x.
  7. Voeg 50 ul van 0,5 M NaCl-oplossing aan de spin filter en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Breng het filtraat dat de tryptische peptiden een nieuwe microbuisjes en zuur aan met mierezuur (FA) tot 1,0% om de destructie te stoppen.
  8. Was het filter unit met 40 ul van 8 M ureum, en dan was 2x met 40 pl 18 MQ water.
  9. Was de filtereenheid 3x met 100 ul van 50 mM ABC oplossing. Na de laatste wasbeurt voeg 0,4 ug / ul trypsine in 1:100 (w / w) enzym naar eiwitverhouding en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
  10. Elueer tryptische peptiden van het tweede digest door toevoeging van 40 ui 50 mM ABC oplossing van de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 1x.
  11. Voeg 50 ul van 0,5 M NaCl-oplossing aan defiltereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Breng het filtraat dat de tryptische peptiden een nieuwe microbuisjes en zuur met FA tot 1,0%.
  12. De monsters kunnen worden gekwantificeerd met behulp van de microplaat colorimetrische test met BSA als standaard.

3. Endoproteïnease LysC en Tryptic eiwitvertering van Whole Lysate behulp FASP

  1. Voeg 30 pi aliquot (≤ 400 ug) van cochleaire eiwit extract bevattende 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 en 0,1 M DTT direct een 30K centrifugefilter en meng met 200 pi 8 M ureum in Tris-HCl . Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten.
  2. Verdun het concentraat met 200 pi 8 M ureumoplossing en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten.
  3. Voeg 10 ul van 10x IAA in 8 M ureumoplossing aan het concentraat in het filter en vortex gedurende 1 minuut. Incubeer de spin filter gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten.
  4. Voeg 100 ul van 8 M ureum solution aan het concentraat op de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten. Herhaal deze stap 2x. Voeg 100 ul van 100 mM ABC oplossing van de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 2x.
  5. Voeg 0,1 ug / ul endoproteinase LysC in een 1:50 (w / w) enzym naar eiwitverhouding en geïncubeerd O / N bij 30 ° C.
  6. Na incubatie, voeg 40 ul van 100 mM ABC oplossing van de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 1x.
  7. Voeg 50 ul van 0,5 M NaCl-oplossing aan de spin filter en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Breng het filtraat dat de LysC peptiden een nieuwe microbuisjes en zuur met FA tot 1,0% om de destructie te stoppen.
  8. Was het filter unit met 40 ul van 8 M ureum, en dan was 2x met 40 pl 18 MQ water.
  9. Was de filtereenheid 3x met 100 ul van 50 mM ABC oplossing. Na de laatste wasbeurt toe 0,4 ug / ul trypsine in 1:100 enzym-to-proeiwit verhouding en incubeer O / N bij 37 ° C.
  10. Elueer tryptische peptiden door toevoeging van 40 ui 50 mM ABC oplossing van de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 1x.
  11. Voeg 50 ul van 0,5 M NaCl-oplossing aan de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Breng het filtraat dat de tryptische peptiden een nieuwe microbuisjes en zuur met 1,0% FA.
  12. Het monster kan worden gekwantificeerd met de microplaat colorimetrische test met BSA als standaard.

4. Ontzouten Peptiden Met behulp van Spin Columns

  1. Activeer een MacroSpin kolom C 18 door het toevoegen van 500 pi acetonitril (ACN) en centrifugeer bij 1100 xg gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom na centrifugeren.
  2. Equilibreren van de kolom met 500 ui 0,1% FA en centrifugeer bij 1100 xg gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom en herhaal deze stap 1x.
  3. Voeg tot 500 ul van het peptide verteren naar de kolom eend centrifuge bij 1100 xg gedurende 1 minuut. Als het monster volume groter is dan 500 pi herhaalt u deze stap.
  4. Was de kolom met 500 ui 0,1% FA en centrifugeer bij 1100 xg gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom. Herhaal deze stap 1x.
  5. Voeg 250 ul van een 90:10 ACN water-verhouding aan de kolom en centrifugeer bij 1100 xg gedurende 1 minuut. Verzamel het eluaat met de peptiden ontzout en breng een nieuwe microbuisjes. Herhaal deze stap 1x.
  6. Droog de ontzoute peptide monster in een vacuüm centrifuge en vermijd volledig laten het monster droog.

5. Ionenuitwisselingschromatografie

  1. Injecteren 50-100 ug verteerd eiwit monster op een 200 x 2,1 mm, 5 micrometer SCX kolom (Polysulfoethyl A) om peptiden te scheiden.
  2. Met een gradiënt van 2-40% B over 50 minuten met een stroomsnelheid van 250 pl / min. Oplosmiddel A 5 mM ammoniumformiaat, pH 3,0 in 25% acetonitril en 75% DDH 2 O. Oplosmiddel B 500 mM ammoniumformiaat, pH6.0 in 25% ACN en 75% DDH 2 O.
  3. Monitor de peptidenfracties bij 280 nm en het verzamelen van de fracties in 2 min intervallen met behulp van een fractie verzamelaar.
  4. Droog fracties onder vacuüm concentrator en resuspendeer in 500 ui 50% acetonitril in DDH 2 O met 5% FA te helpen met zout verwijderd.
  5. Redry fracties en bewaar bij -80 ° C tot klaar om te gebruiken voor nano LC-MS/MS analyse.

6. Aceton Neerslag

Voorafgaand aan GELFrEE scheiding het cochleair eiwit supernatant moet worden ontzout. Aceton precipitatie kunnen worden gebruikt om eiwitten te ontzouten en concentreren.

  1. Voeg drie volumes ijskoude aceton om het cochleair supernatant. Voorzichtig vortex en incubeer bij -20 ° CO / N.
  2. Centrifugeer het monster mengsel bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant.
  3. Was de pellet eiwit 3x met gekoelde aceton en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij 4° C.
  4. Air-droog de pellet en los op in 112 ul van 18 MQ water.
  5. Bepaal de eiwitconcentratie met de microplaat colorimetrische assay.

7. GELFrEE Fractionering van Cochlear zintuigepitheel

  1. Voeg 30 pl 5x monsterbuffer (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% glycerol, 0,5% (w / v) broomfenolblauw) aan de ontzoute eiwit gesuspendeerd in 112 ui 18 MQ water.
  2. Voeg 8 pi 1 M DTT en verwarm bij 95 ° C gedurende 5 min eiwit disulfidebindingen verminderen. Na verhitting laat afkoelen tot kamertemperatuur.
  3. Voeg 8 ml loopbuffer anode reservoir, 150 gl loopbuffer om verzamelkamer proeven en 6 ml loopbuffer kathode reservoir.
  4. Verwijder eventuele buffer die mogelijk stroomde in de monster-laadruimte met een pipet.
  5. Belasting 150 pl (≤ 1 mg) van de cochleaire eiwitmengsel, in het monster-laadruimte met een 8% Tris-acetaat cartridge met een massa bereik van 3,5-150 kDa.
  6. Onderste elektroden en dicht instrument deksel om de run te starten.
  7. Bij de eerste gepauzeerde tijd op het instrument voeg 2 ml van het runnen van buffer naar de kathode reservoir en hervat run.
  8. Bij elke onderbroken interval op het instrument, verzamel het monster uit de monsterkamer met een pipet aan een vers gemerkte microbuisjes. Was de opvangruimte 2x met 150 ul van lopende buffer en gooi.
  9. Voeg 150 ul van vers stromend buffer om de monsterkamer en hervatten run. Verzamel de eiwitfracties over een periode van 2,6 uur in een totaal volume van 150 ul / fractie.

8. 1D Gelelektroforese van GELFrEE Fracties

1D gelelektroforese kunnen worden gebruikt om de resultaten van GELFrEE fractionering vóór enzymatische digestie en MS analyse visualiseren. GELFrEE eiwitfracties kunnen worden gescheiden op een 4-15% Tris-HCl gel.

  • Meng een 5 ul monster van iedere GELFrEE fractie met 5 pl monster verdunnen buffer (350 mM DTT in monsterbuffer).
  • Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 3 minuten.
  • Koel monsters RT.
  • Belasting 10 pi van elke GELFrEE fractie in individuele gel lanen en belasting 5 pl molecuulgewichtsstandaard in de laatste ongebruikte rijstrook.
  • Laat de gel bij 125 V gedurende 1,5 uur of totdat het kleurstoffront de onderkant van de gel bereikt.
  • Verwijder voorzichtig de gel en vlekken met zilver Stain Plus aan de scheiding van eiwitten te visualiseren.

    • 9. Eiwitvertering van GELFrEE Fracties behulp FASP

    Een gewijzigde FASP procedure wordt gebruikt voor detergensverwijdering en de spijsvertering van de GELFrEE fracties.

    1. Voeg elke afzonderlijke fractie direct een 30K filtereenheid, mengen met 200 pi 8 M ureum in Tris-HCl en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 25 minuten.
    2. Verdun het concentraat met 200 ul ureumoplossingen centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 12 minuten. Herhaal deze stap 1x.
    3. Voeg 10 ul van 10x IAA in ureumoplossing aan het concentraat in elke filtereenheid, vortex gedurende 1 minuut, en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    4. Voeg 100 ul van ureumoplossing aan het concentraat van de filtereenheden en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten. Herhaal deze stap 2x. Voeg 100 ul van 100 mM ABC oplossing van de filtereenheden en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 2x.
    5. Voeg 0,1 ug / ul van LysC een 1:50 (w / w) enzym naar eiwitverhouding de filtereenheden en geïncubeerd O / N bij 30 ° C.
    6. Na incubatie, voeg 40 ul van 100 mM ABC oplossing van de spin filters en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 1x.
    7. Voeg 50 ul van 0,5 M NaCl-oplossing aan de spin filters en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Breng het filtraat dat de LysC peptiden uit elke draai filter om een ​​frisse microtube en zuur aan met trifluoroacetic zuur (TFA).
    8. Was de spin-filters met 40 ul van 8 M ureum, daarna wassen 2x met 40 pl 18 MQ water.
    9. Was de rotatie filters 3x met 100 ul van 50 mM ABC oplossing. Na de laatste wasbeurt voeg 0,4 ug / ul trypsine in een 1:100 (w / w) enzym naar eiwitverhouding en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
    10. Elueer tryptische peptiden uit elke filtereenheid door toevoeging van 40 ui 50 mM ABC oplossing en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap 1x.
    11. Voeg 50 ul van 0,5 M NaCl-oplossing aan de filtereenheden en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Breng het filtraat dat de tryptische peptiden uit elke filter unit om een ​​frisse microtube en zuur aan met TFA.
    12. Droog alle verteert in een vacuüm concentrator.

    10. Monstervoorbereiding voor LC-MS/MS

    1. Reconstrueren gedroogd LysC en tryptisch peptide verteert fracties in 20 pi van 0,1% FA en vortex.
    2. Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 10min en verwijder de top 95% van de steekproef is om een ​​nieuwe flacon.
    3. Injecteer 5 pi van elke peptidefractie op een 100 urn x 25 mm monster val zouten en verontreinigingen te verwijderen en uitvoeren chromatografische scheiding op een 75 micrometer x 10 cm C18 kolom.
    4. Met een gradiënt van 2-40% B gedurende 100 minuten met een stroomsnelheid van 200 nl / min. Oplosmiddel A is 95% ddH2O en 5% acetonitril dat 0,1% FA. Oplosmiddel B is 80% ACN en 20% ddH2O die 0,1% FA.
    5. Verzamel tien tandemmassaspectra voor elke MS-scan op een hoge resolutie massaspectrometer. Een LTQ Orbitrap massaspectrometer werd gebruikt in dit experiment.

    11. Eiwit Identificatie

    1. Identificeer eiwitten met behulp van de muis UniProt database met zowel vooruit als achteruit proteïnesequenties en gemeenschappelijke verontreinigingen. MaxQuant software met MASCOT zoekmachine wordt gebruikt om te zoeken van de eiwit-database.
    2. De zoekopdracht parameters die gebruikt kunnen worden zijn onder andere; vaste modificatie van carbamidomethyl cysteïne, variabele modificaties van oxidatie van methionine, eiwit N-terminale acetylering, maximaal 2 gemiste splitsing. De minimale lengte peptide te overwegen voor identificatie 6 aminozuren. Voer een peptide massaconcentratie van ± 8 ppm en een fragment massatolerantie van 1,2 Da (massa fout is afhankelijk van de massaspectrometer wordt gebruikt).
    3. In de MaxQuant software, gebruik dan een 1% valse ontdekking tarief (FDR) voor peptide en proteïne-identificatie. Eiwit identificatie wordt weergegeven met het aantal van overeenkomende peptiden, het percentage eiwitsequentie dekking en de peptidesequenties.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Om de meest uitgebreide proteoom van het cochleair sensorische epitheel te verkrijgen, wordt snel weefsel dissectie nodig voorafgaand aan eiwitextractie en monstervoorbereiding. Twee proteomics technieken kunnen worden gebruikt, shotgun en bottom-up proteomics. Om monsters voor shotgun proteomics bereiden werd FASP digestie procedure als geïllustreerd in figuur 1. De FASP werkwijze maakt concentratie van eiwitten, verwijdering van detergentia en vertering van eiwitten met meerdere enzymen. Er waren twee dubbele digestie procedures, de eerste was een tryptische digestie gevolgd door een tweede digestie met trypsine, die zijn samengevoegd, gefractioneerd op een SCX kolom in fracties 18 en nano LC-MS/MS geanalyseerd. Een totaal van 1485 eiwitten werden geïdentificeerd met een 1% FDR bij het uitvoeren van een single-run LC-MS/MS met deze experimentele aanpak. Onder de geïdentificeerde eiwitten, werden 329 en 258 eiwitten ingedeeld in mitochondrion en plasmamembraan, respectievelijk (figuur2A). De tweede dubbele spijsvertering procedure bestond uit LysC vertering gevolgd door trypsinedigestie. Elke digest werd individueel geladen en gescheiden op de kolom SCX in 18 fracties en door nano LC-MS/MS geanalyseerd. De resultaten van de LysC en trypsine vertering produceerde in totaal 3,503 eiwitten met een 1% FDR. Figuur 2B toont dat 605 en 617 eiwitten werden ingedeeld in mitochondrion en plasmamembraan, respectievelijk. Deze werkwijze zorgde voor het grootste aantal membraan-geassocieerd eiwit id. Dubbel analyse van de LysC en trypsine fracties toonden meer dan 65% van de eiwitten die werden gedeeld tussen de experimenten. Er waren echter ook nieuw geïdentificeerde eiwitten in de herhaalde analyse. De extra peptiden en eiwitten werden geïdentificeerd door kleine veranderingen in chromatografie, wat tot gevolg heeft verschillende peptiden voor fragmentatie 25.

    Bottom-up proteomics werd toegepast met behulp GELFrEE fractioneringvoor LC-MS/MS zoals geïllustreerd in figuur 3. Er waren 12 GELFrEE fracties verzameld. Voordat digestie en LC-MS/MS analyse, een zilver gekleurde gel bereid was het resultaat visualiseren van GELFrEE fractionering zoals weergegeven in figuur 4. De gel toonde eiwit scheiding door toenemend molecuulgewicht voor elke volgende fractie. Daarom werden de 12 GELFrEE vloeibare fracties verteerd met behulp van twee verschillende multi-FASP spijsvertering benaderingen en door LC-MS/MS geanalyseerd. De eerste benadering digestie werd uitgevoerd met een dubbel trypsine digestie, wat leidde tot de identificatie van 2165 eiwit met een 1% FDR bij het ​​uitvoeren van een-run LC-MS/MS. Figuur 5A toont dat er 516 en 399 eiwitten ingedeeld in mitochondrion en plasmamembraan, respectievelijk. De tweede benadering digestie werd uitgevoerd met endoproteinase LysC gevolgd door trypsine digestie. Single-run LC-MS/MS analyse identificeerde 2211 eiwitten met een 1% FDR. Dezebenadering vertoonden een vergelijkbaar aantal membraan-geassocieerde eiwitten bij gebruik van trypsine / trypsine benadering (figuur 5B). De massaspectrometrie proteomics data zijn gedeponeerd bij de ProteomeXchange Consortium 26 met de data-id PXD000231 25. De combinatie van de resultaten van de verschillende technieken tot een groot aantal membraan en oplosbare eiwitten van de muis slakkenhuis sensorische epitheel (figuur 6).

    Figuur 1
    Figuur 1. Schematische voorstelling van een shotgun proteomics experiment met behulp FASP, ionenuitwisselingschromatografie, en hoge-resolutie MS. Eiwitten worden gewonnen, oplosbaar, en verteerd met behulp FASP met LysC en trypsine endoproteïnases. De LysC (groene buis) en tryptische peptiden (paars buis) worden gescheiden in fracties met minder complexe SCX chromatografie en met nano LC-MS/MS geanalyseerd. De MASCOT zoekmachine werd gebruikt om de MS-gegevens voor eiwitidentificatie verwerken. Klik hier voor grotere afbeelding.

    Figuur 2
    Figuur 2. GO cellulaire componenten profiel van eiwitten ID bij het ​​uitvoeren van een (A) eerste en tweede digestie met trypsine gevolgd door SCX scheiding en (B) Eerst digestie met LysC gevolgd door een tweede digestie met trypsine gevolgd door SCX scheiding. Alle categorieën geteld niet exclusief, wanneer een eiwit heeft meer dan een categorie voor cellulaire componenten.es.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

    Figuur 3
    Figuur 3. Schematische voorstelling van een bottom-up proteomics experiment met behulp GELFrEE, FASP, en hoge-resolutie MS. Gehaald eiwitten zijn oplosbaar en eiwitten worden neergeslagen met behulp van aceton (blauwe buis) aan zouten en ongewenste verontreinigingen uit het lysaat te verwijderen. Het eiwit is oplosbaar pellet en eiwitten gefractioneerd met GELFrEE. Elke fractie werd gedigereerd met FASP met LysC en trypsine endoproteïnases. De LysC (groene buizen) en tryptische peptiden (paarse buizen) van elke fractie worden geanalyseerd met behulp van nano LC-MS/MS en eiwitten geïdentificeerd door te zoeken op MS-gegevens met behulp van MASCOT. Klik hier om groot te bekijken afbeelding r.

    Figuur 4
    Figuur 4. Zilver-gekleurde gel van cochleair sensorische epitheel GELFrEE fracties, eiwit scheiding visualiseren in elke fractie voor MS analyse. (M) eiwit marker (1) Fractie 1, (3) Fractie 2, (5) fractie 5 (7) fractie 7 (8) Fraction 8 (9) Fraction 9, (10) Fraction 10, (11) Fraction 11, (12) Fraction 12. Herdrukt (aangepast) met toestemming van Darville en Sokolowski 24. Copyright 2013 door de American Chemical Society. Klik hier voor grotere afbeelding.

    / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    Figuur 5. GO cellulaire componenten profiel van eiwitten ID bij het ​​uitvoeren van een (A) eerste en tweede digestie met trypsine na GELFrEE scheiding en (B) Eerst digestie met LysC gevolgd door een tweede digestie met trypsine na GELFrEE scheiding. Alle categorieën niet exclusief geteld, wanneer een eiwit heeft meer dan een categorie voor cellulaire componenten. Klik hier voor grotere afbeelding.

    Figuur 6
    Figuur 6. GO cellulaire componenten profiel voor alle eiwitten geïdentificeerd met behulp van SCX, WAX, of GELFrEE scheiding. Wanneer een eiwit meer dan een categorie voor cellulaire componenten, al zijn categorie hads werden niet exclusief geteld. Klik hier voor grotere afbeelding.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De belangrijkste te maximaliseren eiwit identificatie van de cochleaire sensorische epitheel zijn: 1) gebruik van meerdere endoproteïnases voor de spijsvertering, 2) gebruik van verschillende scheidingstechnieken, en 3) het gebruik van een hoge-resolutie massaspectrometer. De toepassing van verschillende enzymen verhoogt het aantal peptiden en verbetert eiwitsequentie dekking, vandaar verbetering van het aantal geïdentificeerde eiwitten van de cochleaire weefsel. Trypsine, de meest gebruikte protease biedt efficiënte en specifieke klieving van eiwitten, het genereren van peptiden die goed voor MS ionisatie en fragmentatie zijn. Het gebruik van een ander enzym voor trypsine, zoals LysC, die splitst ook op lysinerest, efficiëntere-splitsingsplaats verschaft. Waargenomen werd dat de sequentie dekking van de eiwitten gegenereerd uit de LysC / trypsine digestie werd een toename in eiwitsequentie dekking ten opzichte van de eiwitsequentie dekking van trypsine / trypsine digestie.

    ove_content "> Uitvoering van multidimensionale scheiding vóór MS verminderde de hoge cochleaire complexiteit monster in de shotgun proteomische benadering. Dit gaf identificatie van meer eiwitten, zoals membraaneiwitten, die doorgaans moeilijk te identificeren zijn. Een groter aantal membraaneiwitten werden geïdentificeerd met de shotgun benadering in tegenstelling tot de bottom-up benadering. Maar de bottom-up benadering, waarbij GELFrEE toegestaan ​​voor de identificatie van meer lage overvloedige eiwitten. Dit is te wijten aan de isolatie van hogere overvloedige eiwitten, zoals cochlin van het slakkenhuis, in individuele fracties.

    De hoge kwaliteit van de gegevens in het huidige protocol bereikt door een hoge-resolutie massaspectrometer, zoals een LTQ-Orbitrap, verbetert en verhoogt het aantal eiwitten die kunnen worden geïdentificeerd in het slakkenhuis. De LTQ-Orbitrap biedt een hoge resolutie, hoge nauwkeurigheid massa, en een hoge gevoeligheid voor de analyse van peptiden. Vandaar dat de toepassing van dit instrument enables identificatie van eiwitten uit complexe biologische monsters, zoals de cochleaire sensorische epitheel en verbetert identificatie van lage overvloedige peptiden. Gebruik van deze gecombineerde experimentele benaderingen met de krachtige tool van MS helpt om aanzienlijke verhoging van de cochleaire eiwit dataset, dus het verbeteren van de mogelijkheid om nieuwe eiwit biomerkers die betrokken zijn bij het gehoor en doofheid identificeren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

    Acknowledgments

    De auteurs danken dr. Kent Seeley, directeur van het Center for Drug Discovery en Innovatie (CDDI) Proteomics Core Facility aan de Universiteit van Zuid-Florida voor het gebruik van deze faciliteit. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD subsidie ​​R01 DC004295 om BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    Biochemie Cochlear chromatografie LC-MS/MS massaspectrometrie Proteomics sensorische epitheel
    Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter