Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

من أسفل إلى أعلى وبندقية البروتيوميات من التعرف على القوقعة بروتيوم الشامل

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

تحليل بروتيوم من الظهارة الحسية قوقعة يمكن أن يكون تحديا نظرا لصغر حجمها ولأن البروتينات الغشاء يصعب عزل والتعرف عليها. ويمكن تحديد كل من الغشاء وبروتينات قابلة للذوبان عن طريق الجمع بين أساليب وتقنيات متعددة إعدادي فصل جنبا إلى جنب مع عالية الدقة قياس الطيف الكتلي.

Abstract

البروتيوميات هو نهج شائعة الاستخدام التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة النظم البيولوجية المعقدة. الظهارة الحسية قوقعة يحتوي على المستقبلات التي تنبيغ الطاقة الميكانيكية الصوتية إلى طاقة الكهربائية والكيميائية التي تتم معالجتها بواسطة الجهاز العصبي المحيطي والمركزي. وقد تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة البروتين في الأذن الداخلية القوقعة، مثل ثنائية الأبعاد الكهربائي الفرق هلام (2D-DIGE)، الأجسام المضادة ميكروأري، ومطياف الكتلة (MS). MS هو الأداة الأكثر شمولا وتنوعا في البروتينات وبالتزامن مع أساليب الانفصال يمكن أن توفر بروتيوم متعمق لعينات بيولوجية. طرق الفصل جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد لديه القدرة على تخصيب عينات البروتين، والكشف عن منخفض الوزن الجزيئي والبروتينات مسعور، وتحديد البروتينات وفرة منخفضة من خلال تقليل النطاق الديناميكي بروتيوم. استراتيجيات الهضم مختلفة يمكن تطبيقها على المحللة كله أو مجزأ إلى البروتين المحللة لتعزيز الببتيد والبروتيناتتغطية التسلسل. يمكن تطبيق استخدام تقنيات الفصل المختلفة، بما في ذلك تبادل قوي الموجبة (SCX)، عكس المرحلة (RP)، ومزال هلام السائل الكهربائي جزء فخ (GELFrEE) للحد من تعقيد العينة قبل التحليل MS لتحديد البروتين.

Introduction

البروتينات هي دراسة النظم البيولوجية المعقدة من خلال تحليل التعبير البروتين، وظيفة، والتعديلات، والتفاعلات 1. وقد تم استخدام عدة طرق للتحليل بروتيوم في الأذن الداخلية، بما في ذلك الأجسام المضادة ميكروأري 2، ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام 3-5، وDIGE 6. ومع ذلك، فقد تم التعرف فقط على عدد محدود من البروتينات وتتميز 2،7-10، مقارنة مع أكثر من 10،000 الجينات والعلامات تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا) التي تم تحديدها في الأذن الداخلية 11،12، MS هو الأسلوب الأكثر شيوعا شاملة و في البروتيوميات لتوصيف البروتين. تحليل عينات البروتين المعقدة، مثل القوقعة، يمكن أن يكون تحديا. ومع ذلك، فإن الجمع بين تقنيات فصل متعددة مع MS تمكن من تحديد عدد أكبر من الببتيدات والبروتينات، ويرجع ذلك إلى زيادة تركيز مجموعة ديناميكية وقدرة الذروة 13. chromatogra متعددة الأبعادفيز البروتين يقلل من مخاليط معقدة للغاية من خلال السماح للاستخدام آليات امتصاص مختلفة. هناك نوعان من يشيع استخدام MS نهج تحليل بروتيوم، بندقية والبروتينات من أسفل إلى أعلى. في البروتيوميات بندقية، وهي مزيج من البروتينات سليمة يتم هضم إنزيمي وفصلها باستخدام اللوني المتعدد الأبعاد مع القوي الموجبة لتبادل اللوني (SCX)، يليه اللوني السائل عكس المرحلة (RPLC) 14،15. تخضع الببتيدات فصلها لبالترادف MS وقاعدة بيانات البحث 15. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن الآلاف من البروتينات يمكن تحديدها في تحليل واحد والأسلوب هو أكثر ملاءمة للبروتينات الغشاء.

في نهج من أسفل إلى أعلى، ويتم فصل خليط من البروتين، وعادة عن طريق واحد أو الكهربائي ثنائي الأبعاد، والعصابات البروتين الفردية أو بقع قطع ويتفاعل مع انزيم مثل التربسين، مما أدى عادة في الببتيدات المتعددة. ومع ذلك، وآخر أكثر حداثةوضعت لاي نهج الكهربي، وتستخدم في تحليل البروتينات من أسفل إلى أعلى، هو GELFrEE. هذه التقنية fractionates عينات البروتين في السائل المرحلة ويجعلها أقل تعقيدا قبل التحليل. هذا الأسلوب هو استنساخه، ويوفر الانتعاش عالية من البروتين، ويقلل من توزيع البروتينات وفرة عالية في عينات البروتين المعقدة 16. الببتيدات الناتجة عن البروتينات فصل، يتم تحليلها من قبل MS، باستخدام الببتيد البصمات الشامل أو بالترادف MS (MS / MS)، لإنشاء علامات تسلسل لقاعدة البيانات بالبحث 17-19. بعض من أهم مزايا استخدام نهج من أسفل إلى أعلى هي القدرة على الحصول على فصل عالية الدقة والتغطية واسعة النطاق البروتين. البروتينات من أسفل إلى أعلى هو الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع في تحليل البروتينات 20، وبالتالي، تتوفر العديد من الأدوات المعلوماتية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل البروتينات في خليط معقد قبل الهضم، وحتى لا يكون هناك فرصة أكبر لتحديد الهوية.

واحدة من التحديات الرئيسيةفي استخدام الأذن الداخلية لتحليل البروتين هو صغر حجمها، وسهولة الوصول المقيدة، ونوع من الخلايا التنوع 21. بالإضافة إلى ذلك، البروتينات الرئيسية التي تميز وظائفه، مثل القنوات الأيونية، ونقل المستقبلات، هي بروتينات الغشاء، والتي يمكن أن يكون من الصعب عزل 22. وبالتالي، عينة إعداد بمساعدة فلتر (FASP) هو مفيد لتحليل البروتين من الأنسجة التي تقتصر لاستخراج البروتين والتي تتطلب المنظفات للذوبان الأغشية 23. هذه التصفية يسمح للتحليل MS من الغشاء والبروتينات القابلة للذوبان ونظرا لقدرته على عزل الببتيدات من الملوثات منخفضة الوزن الجزيئي 23،24.

يصف هذا البروتوكول النهج البروتين شائعة الاستخدام التي يتم الجمع بين وتعديلها لتحليل البروتينات على حد سواء للذوبان والغشاء وزيادة عدد معرفات البروتين من الظهارة الحسية قوقعة. سنقوم بشرح استخدام البروتينات بندقية مع FASP متعددة هضم-ايون، وتبادل اللوني أيون، وارتفاع القرار MS، وتحليل البيانات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف البروتينات من أسفل إلى أعلى مع GELFrEE، FASP متعددة الهضم، وارتفاع القرار MS، وتحليل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق

تمت الموافقة على التجارب باستخدام الفئران الأنسجة من جامعة جنوب فلوريدا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (بروتوكولات 3931R، 3482R) على النحو المبين في إطار المبادئ التوجيهية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. استخراج البروتين

  1. عزل ظهارة الحسية قوقعة من 16 عاما لمدة 30 يوما (P30) الفئران CBA / J وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. في يوم من التجربة، وغسل الأنسجة مع 500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 XG، وإزالة طاف. تكرار لما مجموعه ثلاثة يغسل.
  3. الأنسجة يصوتن لمدة 30 ثانية على الجليد في 100 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 120 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي ناف، 5 ملي EDTA، و 500 ميكروغرام / مل AEBSF، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، و 100 ميكروغرام / مل pepstatin، 2 ميكروغرام / مل أبروتينين، و 0.5 ميكروغرام / مل microcystin باستخدام dismembrator الصوتية (نموذج 100؛ الحرارية فيشر). المحللة باردة على الجليدلمدة 1 دقيقة بين كل صوتنة. يصوتن ما مجموعه 3X.
  4. أجهزة الطرد المركزي في استخراج 750 XG في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف لmicrotube جديدة. استخراج بيليه في 50 ميكرولتر من العازلة تحلل بواسطة sonicating لمدة 30 ثانية على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في استخراج 750 XG في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. الجمع بين كلا لست] والطرد المركزي في 28،600 XG في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. إزالة طاف لmicrotube جديدة وإضافة 20 ميكرولتر تحلل العازلة التي تحتوي على 0.1٪ ASB-14 لبيليه. دوامة لمدة 1 دقيقة واحتضان لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. تسخين العينة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبرد في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. متابعة مع الطرد المركزي في 16،000 XG في درجة حرارة 25 مئوية لمدة 10 دقيقة. جمع طاف ونقل إلى أنبوب جديد.
  6. الطرد المركزي تعليق على 16،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والاحتفاظ طاف لعملية الهضم.

2. ضعف الهضم البروتين زيتية من المحللة الجامعة عن طريق FASP

  1. إضافة 30 μل قسامة (≤ 400 ميكروغرام) من قوقعة استخراج البروتين وتحتوي على 4٪ من الصوديوم كبريتات دوديسيل (SDS)، و 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6 و 0.1 M dithiothreitol (DTT) مباشرة إلى تدور مرشح 30K وتخلط مع 200 ميكرولتر من 8 M اليوريا في تريس، حمض الهيدروكلوريك. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  2. تمييع التركيز مع 200 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 10X iodoacetamide (IAA) في 8 حل M اليوريا إلى التركيز في تصفية ودوامة لمدة 1 دقيقة. احتضان مرشح تدور لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام تليها الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 M إلى التركيز على وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X. إضافة 100 ميكرولتر من 50 ملي بيكربونات الأمونيوم (ABC) الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X.
  5. إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 (ث / ث) انزيم لنسبة البروتين واحتضان بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية.
  6. بعد الحضانة، وإضافة 40 ميكرولتر من 50 ملي ABC حل لتصفية وحدة والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل للمرشح تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية لmicrotube الطازجة وتحمض مع حمض الفورميك (FA) إلى 1.0٪ لوقف عملية الهضم.
  8. غسل وحدة التصفية مع 40 ميكرولتر من 8 M اليوريا، ثم يغسل 2X مع 40 ميكرولتر 18 MΩ المياه.
  9. غسل تصفية وحدة 3X مع 100 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل. بعد غسل النهائي إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. أزل الببتيدات زيتية من الثانية هضم بإضافة 40 ميكرولتر من حل 50 ملي ABC إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  11. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل لوحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية لmicrotube الطازجة وتحمض مع FA إلى 1.0٪.
  12. عينات يمكن قياسها كميا باستخدام صفيحة ميكروسكوبية مقايسة اللونية باستخدام BSA كمعيار.

3. Endoproteinase LysC وزيتية هضم البروتين المحللة من الجامعة عن طريق FASP

  1. إضافة قسامة 30 ميكرولتر (≤ 400 ميكروغرام) من قوقعة استخراج البروتين يحتوي على 4٪ SDS، 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6 و 0.1 M DTT مباشرة تدور مرشح 30K وتخلط مع 200 ميكرولتر من 8 M اليوريا في تريس، حمض الهيدروكلوريك . أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  2. تمييع التركيز مع 200 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 10X IAA في 8 حل M اليوريا إلى التركيز في تصفية ودوامة لمدة 1 دقيقة. احتضان مرشح تدور لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام ثم الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من 8 M اليوريا سولution إلى التركيز على وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X. إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملي ABC الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X.
  5. إضافة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر من endoproteinase LysC في 1:50 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين واحتضان O / N عند 30 درجة مئوية.
  6. بعد الحضانة، وإضافة 40 ميكرولتر من 100 ملي ABC الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل للمرشح تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات LysC إلى microtube الطازجة وتحمض مع FA إلى 1.0٪ لوقف عملية الهضم.
  8. غسل وحدة التصفية مع 40 ميكرولتر من 8 M اليوريا، ثم يغسل 2X مع 40 ميكرولتر 18 MΩ المياه.
  9. غسل تصفية وحدة 3X مع 100 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل. بعد غسل النهائي إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 انزيم إلى المواليةنسبة TEIN واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. أزل الببتيدات زيتية بإضافة 40 ميكرولتر من حل 50 ملي ABC إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  11. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية لmicrotube الطازجة وتحمض مع 1.0٪ FA.
  12. يمكن قياس العينة باستخدام صفيحة ميكروسكوبية مقايسة اللونية مع جيش صرب البوسنة كمعيار.

4. الببتيدات عن طريق تحلية أعمدة سبين

  1. تفعيل عمود MacroSpin C 18 عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من أسيتونتريل (ACN) وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال الطرد المركزي بعد.
  2. يوازن العمود مع 500 ميكرولتر من 0.1٪ FA وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال وكرر هذه الخطوة 1X.
  3. تضيف ما يصل الى 500 ميكرولتر من الببتيد هضم للعمودد الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. وإذا كان حجم العينة أكبر من 500 ميكرولتر ثم كرر هذه الخطوة.
  4. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من 0.1٪ FA وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة 1X.
  5. إضافة 250 ميكرولتر من نسبة 90:10 ACN إلى المياه إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. جمع شاطف تحتوي على الببتيدات المحلاة ونقلها إلى microtube الطازجة. كرر هذه الخطوة 1X.
  6. تجفيف عينة الببتيد المحلاة في جهاز للطرد المركزي فراغ وتجنب السماح للعينة جافة تماما.

5. التبادل الأيوني اللوني

  1. حقن 50-100 ميكروغرام من البروتين المهضوم عينة الصعود إلى 200 × 2.1 مم، 5 ميكرون العمود SCX (Polysulfoethyl A) لفصل الببتيدات.
  2. استخدام التدرج من 2-40٪ B أكثر من 50 دقيقة مع معدل تدفق 250 ميكرولتر / دقيقة. المذيبات (أ) هو فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 3.0 في أسيتونتريل 25٪ و 75٪ [ده 2 O. المذيبات B فورمات الأمونيوم هو 500 ملم، ودرجة الحموضة6.0 في ACN 25٪ و 75٪ [ده 2 O.
  3. رصد الكسور الببتيد في 280 نانومتر وجمع الكسور في فترات 2 دقيقة باستخدام أحد هواة جمع الكسر.
  4. الكسور الجافة في فراغ المكثف وresuspend في 500 ميكرولتر من 50٪ أسيتونتريل في DDH 2 O تحتوي على 5٪ FA للمساعدة في إزالة الملح.
  5. الكسور Redry وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام لتحليل نانو LC-MS/MS.

6. الأسيتون الهطول

قبل الانفصال GELFrEE البروتين طاف قوقعة لابد المحلاة. الأسيتون هطول يمكن استخدامها لdesalt والتركيز البروتينات.

  1. إضافة ثلاثة مجلدات من الأسيتون الجليد البارد لطاف القوقعة. دوامة بلطف واحتضان عند -20 درجة CO / N.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخليط في عينة 15،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
  3. غسل بيليه البروتين 3X مع الأسيتون المبردة وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4° C.
  4. الهواء الجاف بيليه وتذوب في 112 ميكرولتر من 18 MΩ المياه.
  5. تحديد تركيز البروتين باستخدام صفيحة ميكروسكوبية مقايسة اللونية.

7. GELFrEE تجزئة من القوقعة الحسية الظهارة

  1. إضافة 30 ميكرولتر من 5X العازلة عينة (0.25 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10٪ (ث / ت) SDS، الجلسرين 50٪، و 0.5٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق) إلى البروتين المحلاة علقت في 112 ميكرولتر من 18 MΩ الماء.
  2. إضافة 8 ميكرولتر من 1M DTT والحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للحد من السندات ثاني كبريتيد البروتين. بعد تسخين تسمح التبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 8 مل من تشغيل المخزن المؤقت إلى الخزان الأنود، 150 ميكرولتر من العازلة على التوالي لأخذ عينات جمع غرفة، و 6 مل من تشغيل المخزن المؤقت إلى الخزان الكاثود.
  4. إزالة أي العازلة التي قد تدفقت إلى حجرة العينة التحميل باستخدام ماصة.
  5. تحميل 150 ميكرولتر (≤ 1 ملغ) من خليط من البروتين قوقعة، في حجرة العينة التحميل باستخدام آر 8٪هو خلات خرطوشة مع مجموعة كتلة من 3،5 حتي 150 كيلو دالتون.
  6. أقطاب الدنيا وثيقة غطاء أداة لبدء التشغيل.
  7. في المرة الأولى التي تم إيقافها مؤقتا على صك إضافة 2 مل من تشغيل المخزن المؤقت إلى الخزان الكاثود واستئناف التشغيل.
  8. عند كل فاصل مؤقتا على الصك، وجمع عينة من غرفة جمع العينات باستخدام ماصة وإضافة إلى microtube المسمى حديثا. غسل 2X غرفة جمع مع 150 ميكرولتر من العازلة على التوالي وتجاهل.
  9. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة الطازجة التوالي إلى غرفة جمع العينات واستئناف التشغيل. جمع الكسور البروتين على مدى فترة زمنية من 2.6 ساعة في إجمالي حجم 150 ميكرولتر / الكسر.

8. 1D جل الكهربائي من GELFrEE الكسور

1D الكهربائي للهلام يمكن استخدامها لتصور النتائج من GELFrEE تجزئة قبل الهضم الأنزيمي وتحليل MS. يمكن فصل GELFrEE الكسور البروتين على 4-15٪ هلام تريس، حمض الهيدروكلوريك.

  • مزيج قسامة 5 ميكرولتر من كل جزء GELFrEE مع 5 ميكرولتر من عينة تمييع العازلة (350 ملي DTT في المخزن عينة).
  • تسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  • عينات بارد لRT.
  • تحميل 10 ميكرولتر من كل جزء GELFrEE في الممرات هلام الفردية وتحميل 5 ميكرولتر من الجزيئية القياسية الوزن في حارة غير المستخدمة الماضي.
  • تشغيل هلام في 125 V 1.5 ساعة أو حتى تصل الجبهة صبغ الجزء السفلي من هلام.
  • إزالة بعناية الجل وصمة عار وصمة عار مع فضة بلس لتصور فصل البروتين.

    • 9. هضم البروتين من الكسور GELFrEE طريق FASP

    ويستخدم الإجراء FASP تعديل لإزالة المنظفات والهضم من الكسور GELFrEE.

    1. إضافة كل جزء الفردية مباشرة إلى وحدة التصفية 30K؛ المزيج مع 200 ميكرولتر من 8 M اليوريا في تريس، حمض الهيدروكلوريك وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 25 دقيقة.
    2. تمييع التركيز مع 200 ميكرولتر من محلول اليورياوأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 12 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من 10X IAA في محلول اليوريا إلى التركيز في كل وحدة التصفية، دوامة لمدة 1 دقيقة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من محلول اليوريا إلى التركيز على وحدات التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X. إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملي ABC الحل إلى وحدات التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X.
    5. إضافة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر من LysC ل1:50 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين إلى وحدات التصفية واحتضان O / N عند 30 درجة مئوية.
    6. بعد الحضانة، وإضافة 40 ميكرولتر من 100 ملي ABC حل للمرشحات تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
    7. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل للمرشحات تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات LysC من كل مرشح تدور إلى microtube الطازجة وتحمض مع trifluoroacحمض ETIC (TFA).
    8. غسل الفلاتر تدور مع 40 ميكرولتر من 8 M اليوريا، ثم غسل 2X مع 40 ميكرولتر 18 MΩ المياه.
    9. غسل الفلاتر تدور 3x أخرى مع 100 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل. بعد غسل النهائي إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
    10. أزل الببتيدات زيتية من كل وحدة التصفية من خلال إضافة 40 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
    11. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم الحل إلى وحدات التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية من كل وحدة تصفية على microtube الطازجة وتحمض مع TFA.
    12. تجف جميع الملخصات في فراغ المكثف.

    10. إعداد نموذج لLC-MS/MS

    1. LysC إعادة المجففة والببتيد زيتية هضم الكسور في 20 ميكرولتر من 0.1٪ FA ودوامة.
    2. عينات الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 10دقيقة وإزالة الجزء العلوي 95٪ من عينة لعينة قارورة جديدة.
    3. حقن 5 ميكرولتر من كل جزء الببتيد على مصيدة 100 ميكرون × 25 مم عينة لإزالة الأملاح والملوثات وتنفيذ الفصل الكروماتوغرافي على 75 ميكرومتر × 10 سم C 18 عمود.
    4. استخدام التدرج من 2-40٪ B أكثر من 100 دقيقة مع معدل تدفق 200 NL / دقيقة. المذيبات (أ) هو 95٪ و 5٪ ddH2O أسيتونتريل تحتوي على 0.1٪ FA. المذيبات B هو 80٪ و 20٪ ACN ddH2O تحتوي على 0.1٪ FA.
    5. جمع عشرة جنبا إلى جنب أطياف الشامل لكل MS مسح على مطياف الكتلة عالية الدقة. تم استخدام مطياف الكتلة LTQ Orbitrap في هذه التجربة.

    11. تحديد البروتين

    1. تحديد البروتينات باستخدام قاعدة بيانات تحتوي على كل UniProt الماوس إلى الأمام وعكس تسلسل البروتين والملوثات المشتركة. يستخدم برنامج MaxQuant مع محرك البحث التميمة للبحث في قاعدة بيانات البروتين.
    2. وتشمل معلمات البحث التي يمكن استخدامها؛ modific الثابتةأوجه من carbamidomethyl من السيستين، والتعديلات متغير من أكسدة ميثيونين، البروتين N محطة أستلة، والحد الأقصى من 2 غاب الانقسام. الحد الأدنى لطول الببتيد للنظر في تحديد 6 الأحماض الأمينية. إدخال الشامل الخطأ تركيز الببتيد من ± 8 جزء في المليون والتسامح جزء من كتلة 1.2 دا (خطأ الشامل يعتمد على مطياف الكتلة المستخدمة).
    3. في البرنامج MaxQuant، واستخدام 1٪ معدل اكتشاف كاذبة (روزفلت) لالببتيد والبروتينات تحديد الهوية. يتم سرد تحديد البروتين مع عدد من الببتيدات المتطابقة، والتغطية تسلسل المئة من البروتين، وتسلسل الببتيد.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    للحصول على بروتيوم الأكثر شمولا من الظهارة الحسية قوقعة، مطلوب تشريح الأنسجة سريعة قبل استخراج البروتين وإعداد العينات. اثنين من التقنيات البروتين يمكن استخدامها، وبندقية من أسفل إلى أعلى البروتينات. لتحضير عينات للتحليل البروتينات طلقات نارية، تم استخدام الإجراء FASP الهضم كما هو موضح في الشكل 1. يسمح أسلوب FASP للتركيز البروتينات وإزالة المنظفات، وهضم البروتينات باستخدام أنزيمات متعددة. كان هناك اثنين من الإجراءات الهضم مزدوجة المستخدمة، تمثلت الأولى في عملية الهضم زيتية تليها الثانية الهضم مع التربسين، والتي كان يتم تجميع، مجزأة على عمود SCX في 18 الكسور وتحليلها بواسطة نانو LC-MS/MS. وقد تم تحديد ما مجموعه 1،485 البروتينات مع روزفلت 1٪ عند إجراء LC-MS/MS تشغيل واحد باستخدام هذا المنهج التجريبي. بين البروتينات التي تم تحديدها، وصنفت 329 و 258 البروتينات في الحبيبات الخيطية والبلازما الغشاء، على التوالي (الشكل2A). وتألفت الإجراء الهضم مزدوجة الثاني من LysC الهضم تليها التربسين الهضم. وخلاصة كل على حدة وتحميل فصل على العمود SCX في 18 الكسور وتحليلها بواسطة نانو LC-MS/MS. أنتج نتائج LysC والهضم التربسين ما مجموعه 3،503 البروتينات مع 1٪ روزفلت. الشكل 2B يبين أن 605 و 617 البروتينات صنفت في الحبيبات الخيطية وغشاء البلازما، على التوالي. قدم هذا النهج على أكبر عدد من معرفات المرتبطة غشاء البروتين. وأظهر تحليل مكررة من LysC والكسور والتربسين المشتركة أكثر من 65٪ من البروتينات التي تم تحديدها بين التجارب. ومع ذلك، كانت هناك أيضا البروتينات التي تم تشخيصها حديثا في تحليل تكرار. تم التعرف على الببتيدات والبروتينات إضافية بسبب التغيرات الصغيرة في اللوني، وبالتالي يؤدي إلى الببتيدات مختلفة لتجزئة 25.

    تم تطبيق البروتينات أسفل إلى أعلى باستخدام GELFrEE تجزئةقبل LC-MS/MS كما هو موضح في الشكل 3. كان هناك 12 GELFrEE الكسور التي تم جمعها. قبل الهضم والتحليل LC-MS/MS، وكان جل الملطخة الفضة مستعدة لتصور النتائج من GELFrEE تجزئة كما هو موضح في الشكل (4). أظهر الجل فصل البروتين عن طريق زيادة الوزن الجزيئي لكل جزء متتالية. وبالتالي، تم هضمها 12 GELFrEE الكسور السائل باستخدام اثنين من مختلف النهج الهضم متعددة FASP وتحليلها من قبل LC-MS/MS. تم إجراء أول عملية الهضم النهج باستخدام الهضم التربسين مزدوج، الأمر الذي أدى إلى التعرف على 2،165 البروتينات مع روزفلت 1٪ عند إجراء LC-MS/MS التي تديرها واحد. ويبين الشكل 5A أن هناك 516 و 399 البروتينات المصنفة في الحبيبات الخيطية وغشاء البلازما، على التوالي. تم تنفيذ النهج الهضم الثانية باستخدام endoproteinase LysC تليها التربسين الهضم. حدد تحليل LC-MS/MS أحادية ل2،211 البروتينات مع روزفلت 1٪. هذاأظهر النهج عدد مماثل من البروتينات المرتبطة الغشاء كما هو الحال عندما باستخدام نهج التربسين / التربسين (الشكل 5B). وقد تم إيداع البيانات البروتيوميات قياس الطيف الكتلي لاتحاد ProteomeXchange 26 مع معرف مجموعة البيانات PXD000231 25. الجمع بين أسفرت النتائج من التقنيات المختلفة في عدد كبير من الغشاء وبروتينات قابلة للذوبان من الماوس القوقعة ظهارة الحسية (الشكل 6).

    الشكل 1
    الشكل 1. تخطيطي للتجربة البروتين باستخدام بندقية FASP، والتبادل الأيوني اللوني، وعالية الدقة MS. يتم استخراج البروتينات، solubilized، وهضمها باستخدام FASP مع LysC وendoproteinases التربسين. وLysC (أنبوب الأخضر) والببتيدات زيتية (الأرجواني أنبوب) يتم فصل إلى أجزاء أقل تعقيدا باستخدام SCX اللوني وتحليلها باستخدام نانو LC-MS/MS. تم استخدام محرك البحث التميمة لمعالجة البيانات MS لتحديد البروتين. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    الرقم 2
    الشكل 2. GO المكونات الخلوية الشخصى معرفات البروتين عند تنفيذ (A) الأولى والثانية الهضم مع التربسين تليها SCX الانفصال و(B) الهضم الأولى مع LysC تليها الهضم الثاني مع التربسين تليها SCX الانفصال. تحسب جميع الفئات nonexclusively، عندما البروتين لديها أكثر من فئة واحدة عن المكونات الخلوية.es.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    الرقم 3
    البروتينات الرقم 3. تخطيطي من أسفل إلى أعلى التجربة البروتين باستخدام GELFrEE، FASP، وعالية الدقة MS. المستخلصة هي solubilized وعجلت البروتينات باستخدام الأسيتون (أنبوب الأزرق) لإزالة الأملاح والملوثات غير المرغوب فيها من المحللة. بيليه البروتين هو solubilized ومجزأة البروتينات باستخدام GELFrEE. تم هضمها كل جزء باستخدام FASP مع LysC وendoproteinases التربسين. وLysC (الأنابيب الخضراء) والببتيدات زيتية (أنابيب الأرجواني) من يتم تحليلها باستخدام LC-MS/MS نانو والبروتينات التي تم تحديدها من خلال البحث باستخدام البيانات MS التميمة كل جزء. اضغط هنا لمشاهدة كبيرة ص الصورة.

    الرقم 4
    الشكل 4. ملطخة الفضة هلام من قوقعة الحسية الكسور ظهارة GELFrEE، لتصور فصل البروتين في كل جزء قبل التحليل MS. (M) البروتين علامة، (1) جزء 1، (3) جزء 2، (5) جزء 5، (7) جزء 7، (8) جزء 8، (9) جزء 9، (10) جزء 10، (11) جزء 11، (12) جزء 12. طبع (مقتبس) بإذن من دارفيل وSokolowski 24. حقوق الطبع والنشر 2013 من قبل الجمعية الكيميائية الأمريكية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    / files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    الرقم 5. GO المكونات الخلوية الشخصى معرفات البروتين عند تنفيذ (أ) الأول والثاني الهضم مع التربسين بعد الانفصال GELFrEE و (ب) الهضم الأولى مع LysC تليها الثانية الهضم مع التربسين بعد الانفصال GELFrEE. تحسب جميع الفئات nonexclusively، عندما البروتين لديها أكثر من فئة واحدة عن المكونات الخلوية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    الرقم 6
    الرقم 6. GO المكونات الخلوية الملف الشخصي لجميع البروتينات التي تم تحديدها باستخدام SCX، الشمع، أو الانفصال GELFrEE. عندما كان بروتين أكثر من فئة واحدة عن المكونات الخلوية، وكلها فئات لهااحصي ق nonexclusively. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    الخطوات الرئيسية لتحقيق أقصى قدر من تحديد البروتين من ظهارة حسية القوقعة هي: 1) استخدام endoproteinases متعددة لعملية الهضم، 2) استخدام تقنيات فصل متعددة، و 3) استخدام مطياف الكتلة عالية الدقة. تطبيق الانزيمات متعددة يزيد من عدد من الببتيدات ويحسن التغطية تسلسل البروتين، وبالتالي تحسين عدد من البروتينات التي تم تحديدها من الأنسجة القوقعة. التربسين، والبروتيني الأكثر استخداما يوفر الانقسام فعالة ومحددة من البروتينات والببتيدات توليد التي هي جيدة للMS التأين والتفكك. ومع ذلك، باستخدام انزيم آخر قبل التربسين، مثل LysC، والتي أيضا يشق على بقايا يسين، ويوفر أكثر كفاءة الانقسام الببتيد. لوحظ أن التغطية تسلسل من البروتينات الناتجة عن عملية الهضم LysC / التربسين أظهرت زيادة في البروتين تغطية التسلسل النسبي للتغطية تسلسل البروتين من التربسين / التربسين هضم.

    ove_content "> تنفيذ الانفصال متعددة الأبعاد قبل MS تخفيض عالية التعقيد عينة قوقعة في نهج البروتين بندقية، وهذا يسمح لتحديد المزيد من البروتينات، بما في ذلك البروتينات الغشاء، التي يصعب عادة التعرف عليها. وقد تم تحديد عدد أكبر من البروتينات الغشاء باستخدام نهج بندقية خلافا لنهج من أسفل إلى أعلى. ومع ذلك، فإن نهج من أسفل إلى أعلى باستخدام GELFrEE يسمح لتحديد المزيد من البروتين وفيرة منخفضة. ويرجع ذلك إلى عزل البروتينات العالي وفيرة، مثل cochlin من القوقعة، إلى الفردية الكسور.

    البيانات ذات جودة عالية المحرز في هذا البروتوكول عن طريق مطياف الكتلة عالية الدقة، مثل LTQ-Orbitrap، ويحسن ويزيد من عدد من البروتينات التي يمكن تحديدها في القوقعة. يقدم LTQ-Orbitrap ارتفاع القرار، ودقة عالية الشامل، وحساسية عالية لتحليل الببتيدات. وبالتالي، وتطبيق هذا الصك العنبليه تحديد البروتينات من العينات البيولوجية المعقدة، مثل الظهارة الحسية قوقعة ويعزز تحديد الببتيدات وفرة منخفضة. الاستفادة من هذه المناهج التجريبية جنبا إلى جنب مع أداة قوية من مايكروسوفت يساعد على زيادة كبيرة في البروتين قوقعة مجموعة البيانات، وبالتالي تحسين فرصة لتحديد المؤشرات الحيوية البروتين الرواية تشارك في السمع والصمم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب تعلن أي تضارب مصالح.

    Acknowledgments

    المؤلفين أشكر الدكتور كينت سيلي، مدير مركز ديسكفري المخدرات والابتكار (CDDI) مرفق البروتيوميات الأساسية في جامعة جنوب فلوريدا لاستخدام هذا المرفق. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح / NIDCD R01 DC004295 إلى BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    الكيمياء الحيوية، العدد 85، القوقعة، اللوني، LC-MS/MS، مطياف الكتلة، البروتيوميات، ظهارة حسية
    من أسفل إلى أعلى وبندقية البروتيوميات من التعرف على القوقعة بروتيوم الشامل
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter