Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אופטימיזציה וניצול Published: April 19, 2014 doi: 10.3791/51204
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

Summary

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

Abstract

ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium בצמחים הוא גישה מבטיחה לייצר אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים בתוך תקופה קצרה של זמן. עם זאת, טכנולוגיה זו היא רק מתחילה להיות מיושמת על מכשולים טכנולוגיים רבים ייצור בקנה מידה גדולה בהיקף של עד הם עתה להתגבר עליו. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה ולשעתק לייצור חלבון חולף בקנה מידה תעשייתית המבוססים על חדירת אבק של צמחי Nicotiana עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה. אופטימיזציה של טיפוח Agrobacterium במדיום AB מאפשרת דילול ישיר של תרבות החיידקים במים מילי-Q, לפשט את תהליך החדירה. בין שלושה מינים שנבדקו של Nicotiana, נ ' excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) נבחר כמארח המבטיח ביותר בשל הקלות של חדירה, רמה גבוהה של ייצור חלבון כתב, ועל שני-fייצור ישן גבוה יותר ביומסה בתנאים סביבתיים מבוקרים. אינדוקציה של Agrobacterium מחסה pBID4-GFP (מבוסס נגיף פסיפס טבק) שימוש בכימיקלים כגון acetosyringone וmonosaccharide לא הייתה השפעה על רמת ייצור החלבון. צמח שחדר מתחת 50-100 mbar ל30 או 60 שניות הביא לחדירת% על 95 של רקמות עלים צמח. הסתננות עם GV3101 זן המעבדה Agrobacterium הראתה ייצור החלבון הגבוה ביותר בהשוואה לזני Agrobacteria מעבדה LBA4404 וC58C1 ופראי מהסוג Agrobacteria זני at6, at10, at77 וA4. שיתוף ביטוי של השתקת RNA נגיפי מדכא, p23 או p19, בנ benthamiana הביא להצטברות מוקדם יותר וייצור מוגבר (15-25%) חלבון המטרה (hemagglutinin וירוס שפעת) של.

Introduction

צמחי החברה מוכרים כפלטפורמה בטוחה, אמינה, ניתן להרחבה וזולה לייצור תרופות הביולוגיים רקומביננטי Heterologous וחלבונים תעשייתיים 1-3 ויש לי יתרונות חשובים על פני מערכות ביטוי תא של חיידקים ובעלי חי 4. צמחים מסוגלים לבטא חלבונים מקופלים בצורה נכונה עם שלאחר translational שינויים, כולל נוגדנים Multimeric התאספו 5-7. חלבונים רקומביננטיים תרופות צמחיות כמה עוברים הערכה קלינית 8. אלה כוללים חיסוני מטופל ספציפי רקומביננטי אזוטיפ (scFv) לטיפול בלימפומה שאינה הודג'קין 9, מגיפה מבוססת hemagglutinin ומועמדים חיסון שפעת עונתיים 10,11 (קאמינגס et al., שהוגש לחיסון), אני אנטיגן פני השטח נגד סטרפטוקוקוס / נוגדן השני לטיפול בעששת 12, והאינסולין אנושי לטיפול בסוכרת 13. יתר על כן, reco אדםglucocerebrosidase mbinant לטיפול בתחליפי אנזים בחולים עם מחלת גושה כבר אושר בישראל ובארצות הברית, והוא ניתן במסגרת תכנית הגישה המורחבת מחוץ לארה"ב 14,15.

ניתן לייצר חלבוני Heterologous בהפכו ביציבות (מהונדס או transplastomic) או צמחים הפכו transiently. ייצור חלבון חולף מציע מספר יתרונות על פני ייצור בצמחים הטרנסגניים, כוללים פרק זמן קצר כדי להשיג ביטוי והצטברות 16, ויכול להיות מושגת על ידי החדרת וקטורים בינאריים חיידקים או וקטורים ויראליים צמח רקומביננטי לתוך רקמות צמח 4. מערכת הביטוי חולפת המתקדמת ביותר מבוססת על השימוש ב'וקטורי השקה 'המשלבים רכיבים של וירוסי צמחים ופלסמידים בינארי, ומועברים על ידי agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration של וקטור השקה המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) יושם בהצלחה במעבדהאת קנה המידה כדי לייצר אנטיגנים חיסון נגד פתוגנים כגון וירוס הפפילומה אנושי 19, Yersinia pestis 20, שפעת וירוסים, anthracis Bacillus 21,22 23, ונגיף אבעבועות שחורות 24 בנ benthamiana עוזב. ביטוי חולף בתיווך Agrobacterium הוא גם שיטה מבטיחה לייצור בו זמני של חלבונים רבים 2,25-27. לדוגמא, מערכות ביטוי חולפות צמח היו בשימוש כדי לייצר נוגדני גידול ספציפי רקומביננטי 28,29, נוגדן מסוכר רקומביננטי כנגד הקולטן לגורם גדילה באפידרמיס 30, ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים לאנטיגן מגן האנתרקס 31,32. שיתוף חדירה של צמחי benthamiana Nicotiana עם גן מטרה ומדכא של תוצאות להשתקת גנים בביטוי חלבון המטרה משופרת 33,34.

Agroinfiltration היא שיטה נפוצה לintrodu אחידחיידקי cing מחסה גן של עניין למפעל רקמות 35-37. חדירת אבק של Agrobacterium לביטוי גנים חולף בצמח שלם משאיר היא שיטה מהירה, ניתן להרחבה, ושימושית לייצור של חלבונים זרים ללא הצורך לייצר צמחים מהונדסים 38-41. במהלך agroinfiltration ואקום, צמחים התהפך במהופך וחלקי אוויר שקוע בהשעית Agrobacterium. אז ואקום מיושם גורם גזים לפינוי מחללים אינטר עלה דרך הפיוניות. השחרור מחדש על לחץ הבא מהיר של תוצאות הוואקום בעירוי של ההשעיה Agrobacterium לעלה. בעקבות חדירת אבק של Agrobacteria, צמחי מעובדות נוספות וביטוי היעד הוא תחת פיקוח. הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי היעד הם נצפו בדרך כלל 2-3 ימים שלאחר חדירה (dpi) עם וקטור בינארי ו4-7 dpi עם וקטור השקה, לאחר שרמת הביטוי בדרך כלל decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens הוא הרכב הנפוץ ביותר להעברת גן של עניין למפעל לייצור חלבון. Agroinfiltration עובד מצוין בנ benthamiana אבל יחסית גרוע ברוב הצמחים אחרים, כולל thaliana ארבידופסיס 46.

במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית לייצור חלבון חולף בנ 'בן השבוע 5-6 benthamiana באמצעות א tumefaciens הסתננות. החסרון העיקרי של קנה מידה תעשייתית של טכניקת agroinfiltration הוא צנטריפוגה של חיידקים וresuspension של גלולה החיידקים במצע המכילה 4'-hydroxy-3 שנקטפו ", 5'-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), מונוסכרידים, ו 2 - (N-morpholino) -Ethanesulfonic חומצה (MES) חיץ לאינדוקציה של גנים vir. אנחנו כבר מסוגלים להתגבר על בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של Agrobacterium בנ 'מיני מארח טבק wild-type benthamiana ונ ' נסורת, כמו גם בנ ההיברידי excelsiana.

Protocol

1. צמח גידול

לagroinfiltration לאחר מכן הערכנו שני מיני Nicotiana wild-type (נ benthamiana ונ 'אקסלסיור) והיברידי (excelsiana נ) גדל hydroponically על צמר סלעים במתקנים מקורה.

  1. משרים לוחות צמר סלעים בתמיסת דשן צמח.
  2. לזרוע זרעים של נ 'wild-type benthamiana, נ ' נסורת ונ ' excelsiana (היברידי של נ benthamiana × נ הנסורת) על החומרים המזינים ספוג משטח צמר סלעים.
  3. לגדל צמחים מהזרעים בתנאים מבוקרים (24 מעלות צלזיוס ו40-65% לחות יחסית) וphotoperiod ארוכות היום (14 אור משאבי האנוש ו10 חשוכות שעות, עם תאורה של 130-150 מ 'μE -2 שניות -1) עבור 4-5 שבועות לנ benthamiana ונ ' excelsiana, ו5-6 שבועות לנ נסורת.

2. בנייה של וקטורים עבור Agroinfiltratיון

  1. הכנס גן כתב סינטטי (חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), hemagglutinin באורך מלא (HA) מזן A/California/04/2009 של נגיף שפעת (HAC1), ואנזים lichenase מחדש מהונדס (LicKM) 18 בנפרד לתוך וקטור השקת pBID4 18 (וקטור מבוסס TMV) כדי להשיג pBID4-GFP, pBID4-HAC1 וpBID4-LicKM, בהתאמה 18,32,41,47.
  2. להציג 10-50 ng של pBID4 ביצוע GFP או HAC1 לתוך תאי electrocompetent של א ' tumefaciens GV3101 המתח וLicKM לתוך תאי electrocompetent של א ' tumefaciens זני GV3101, C58C1, GLA4404, At06, at10, At77 וA4 עם electroporator MicroPulser הגן.
  3. השתמש Agrobacteria הפך לניסויי הסתננות אלא אם צוין אחרת.

3. אבק ההסתננות של Agrobacterium לצמחי Nicotiana

  1. לגדול א tumefaciens זני לילה (O / N) במדיום LB, הרפואה ייבium או בינוני AB בתוספת 50 מ"ג / ליטר של Kanamycin ב28 ° C עם הרועד בסל"ד 200-250.
  2. לדלל Agrobacteria במים מילי-Q לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (600) של 0.5 או Agrobacterium צנטריפוגה תאים שגודלה בLB או ייב או AB ב4,000 × גרם ל10 דקות ב 4 ° C, מחדש להשעות במדיום אינדוקציה (מלח 1x MS, MES 10 מ"מ, 200 acetosyringone מיקרומטר, סוכרוז 2% [MMA]) ל600 של 0.5, ומערבבים בטמפרטורת חדר למשך 1-3 שעות, אלא אם צוין אחרת.
  3. לחדור צמחים בתא ואקום על ידי השריית רקמות אוויריות צמח Nicotiana בהשעית Agrobacterium והחלת ואקום 50-400 mbar ל30 או 60 שניות. החדירה האופטימלית מיושמת באופן שיגרתי ב50-100 mbar ל60 שניות.
  4. ברגע שהוואקום שבור, להסיר צמחים מתא הוואקום, לשטוף במים, ולגדול במשך 5-7 ימים באותם תנאי גידול המשמשים לגידול טרום הסתננות.
  5. כדי לבדוק את היעילותשל כימיקלים גרימת גן vir Agrobacterium, ריכוזים שונים של acetosyringone (0, 100, 200 או 400 מיקרומטר) נוספו לAgrobacteria המושעה במאגר הסתננות (1x MS, MES 10 מ"מ, גלוקוז 2%). להשפעת monosaccharide באינדוקציה של גני vir, באחוזים השונים של גלוקוז (0, 1, 2 או 4%) נוספו לAgrobacteria מושעה במאגר ההסתננות (1x MS, MES 10 מ"מ, 200 acetosyringone מיקרומטר). נ צמחי benthamiana הסתננו כאמור לעיל בצעדים 3.3 ו3.4).
  6. המעבדה Agrobacterium זני GV3101, C58C1 וLBA4404 וזנים פראי מסוג A4, At06, at10, וAt77 מחסה וקטור pBID4-LicKM היו מדוללת במים מילי-Q ל600 של 0.5. נ צמחי benthamiana הסתננו עם כל זן מסוים כאמור לעיל בצעדים 3.3 ו3.4.

4. נוהל שיתוף agroinfiltration למדכאי השתקת ויראלי

  1. Mix התרבויות מילי-Q-מדולל במי Agrobacterium GV3101 נושאות את גן ה-GFP ו p19 המדכא ההשתקה הנגיפי של וירוס פעלולים סבוכים עגבניות (TBSV) בשעה 1:1, 2:1, 3:01 ו04:01 יחסים. לחדור נ צמחי benthamiana כפי שתואר לעיל.
  2. לחדור נ צמחי benthamiana בתערובת של שתי תרבויות בדילול מים מילי-Q Agrobacterium GV3101: הראשון נושא את הפלסמיד pBID4-HAC1 והשני נושא את אחד ממדכאי ההשתקה - P19 של TBSV או p23 של וירוס טריסטזה הדר, בפלסמיד pCassp ( pCassp19) ובפלסמיד בינארי PGR תחת אמרגן 35S (PGR-P23), בהתאמה, ב04:01 היחס.

5. מערב ניתוח הכתם

  1. לאסוף דגימות עלים אקראיות מנ benthamiana, נ נסורת או נ צמחי excelsiana ב4-7 dpi ולכתוש בחנקן נוזלי לאבקה דקה.
  2. הוסף שלושה כרכים של חיץ PBS 1x מכילים 0.5% טריטוןX-100 מדגם זה.
  3. נער בעדינות את הדגימות שחולצו ל15 דקות ב 4 ° C.
  4. ספין התמצית במשך 5 דקות ולאסוף חלבון מסיס בסך הכל לתוך צינור Eppendorf נקי.
  5. לדלל את תמציות לדילול מתאים (1:50 1:100) במאגר חילוץ 1x PBS, ולהוסיף 5 × חיץ מדגם (250 מ"מ טריס-HCl [pH 6.8], 10% SDS, bromophenol 0.5% הכחולים, גליצרול 50% V / V, ו500 מ"מ DTT) לריכוז 1 × סופי.
  6. דגימות מרתיחים במשך 5 דקות.
  7. חלבונים נפרדים על ידי 10% SDS-PAGE, להעביר על גבי קרום העברת Immobilon-P, ולחסום עם 0.5% I-בלוק.
  8. זיהוי ה-GFP באמצעות נסיוב אנטי-GFP ארנב polyclonal ב1:5,000 וHAC1 באמצעות נוגדן חד שבטי נגד פולי היסטידין עכבר ב1:1,000 בחסימת פתרון במשך שעה 1.
  9. לאחר תיוג נוגדן ראשוני, לשטוף את הקרומים שלוש פעמים 10 דקות כל אחד עם 1 × 20-PBST ודגירה עם חזרת peroxidase (HRP) מצומדות נוגדנים נגד ארנב ב1:5,000 או HRP-המצומדנוגדן ד אנטי עכבר ב1:10,000 עבור שעה 1, עבור ה-GFP וזיהוי HAC1, בהתאמה.
  10. לעבד כתמים מערביים באמצעות מצע SuperSignal מערב פיקו Chemiluminescent.
  11. השתמש בתוכנת GeneTools לנתח עוצמת להקה של החלבון ולקבל את הכמות מכוילת הלהקה.

ייצור חלבון: (דילול מכויל כמות x של מדגם) / כמות המדגם הטעון) x 4 = מ"ג / קילוגרם.
משוואה: ייצור חלבון (P), כמות מכוילת (C), דילול של המדגם (ד ') וכמות לדוגמא טעונה (S).

6. Zymogram Assay

  1. נ לאסוף pBID4-הסתנן-LicKM דגימות רקמה אקראית benthamiana.
  2. לחלץ חלבונים משתמשים באותן השיטות שתוארו לעיל לניתוח כתם מערבי ולאחר מכן לנתח ידי 10% SDS-PAGE עם lichenan 0.1% נכלל בג'לים.
  3. לאחר אלקטרופורזה, לשטוף את הג'לים פעמיים 10 דקות כל אחד בלשטוף חיץ (100 מ"מ טריס-HCl [pH 8.0] ו0.1% טריטון X-100) ולאחר מכן לדגור בחיץ לשטוף ב65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. לאחר דגירה, לבטל את החיץ לשטוף ולהכתים את ג'לי עם 0.5% אדומים קונגו למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. יש לשטוף את ג'לי במים מילי-Q שלוש פעמים 10 דקות כל אחד, ולהוסיף 1 M NaCl לדמיין פעילות lichenase. חלבון lichenase חיידקים המטוהרים שימש כביקורת חיובית לפעילות אנזים.

7. הדמיה GFP

  1. לבצע זיהוי ויזואלי של הקרינה ה-GFP בצמחים הפכו transiently כל שימוש במנורת UV באורך גל ארוך החזיק ביד.
  2. צילום transiently הפך צמחים עם מצלמה דיגיטלית דרך צהוב 8, ES 52 מסנן (זמן חשיפה, 15 שניות).
  3. להשיג תמונות מכתם מערבי מנתח באמצעות תוכנת GeneSnap על GeneGnome ולכמת את התוצאות באמצעות תוכנת GeneTools, עם עקומת כיול המבוססת על תקן ה-GFP מטוהר.
  4. לכמת חלבון HAC1 באמצעות עקומת כיול המבוסס על purifiסטנדרטי חלבון ed HAC מזן A/Indonesia/05/05 של נגיף שפעת.
  5. חישוב ערכים ממוצעים 3-4 משכפל לכל הניסויים.

Representative Results

דרישות תזונתיים לגידול צמחים. השימוש במדיום גידול צמחים הידרופוני (Rockwool) ופתרון תזונתי מבטיח אחידות של נ ' צמיחת benthamiana ומבטל מורכבויות (מכאני, רגולציה ויעילות) הקשורים לשימוש בקרקע לגידול צמחים. אנחנו גדלנו נ benthamiana בלוחות צמר סלעים ספוגים בדשנים זמינים מסחרי כדי לקבוע את התנאים אופטימליים לגידול צמחים והצטברות ביומסה. אנו הבחנו 95-100% נביטת זרעים. יש לציין, שביניהם זרחן הוא קריטי כדי להשיג נביטה, כי מצאנו כי הפתרון תזונתי חסר זרחן לא הצליח לתמוך בנביטה וצמיחה של נ ' זרעי benthamiana (איור 1 א).

השפעות של צמיחת Agrobacterium ותקשורת הסתננות על ייצור בריאות וחלבון צמחי. בדקנו כמה תנאי תקשורת כדי לייעל את היעילות של tהוא טכניקת agroinfiltration לייצור בקנה מידה גדולה. חיידקים (א tumefaciens מתח GV3101) מחסה מבנה pBID4-GFP עובדו O / N בתנאי מדיה שונים (ייב, LB או AB), וכן גם centrifuged ומחדש תלויים במדיום אינדוקציה (MMA) (המכיל 1 × Murashige & Skoog [טרשת נפוצה] תערובת בסל מלח, 10 מ"מ MES-pH 5.6, 20 גרם / סוכרוז L ו200 acetosyringone מיקרומטר) או מדולל במים מילי-Q ל600 של 0.5 לפני השימוש לחדירת צמח. הבחנו כי חדירת אבק של צמחים עם חיידקים מדוללים במים הביאה לייצור חלבון דומה לאלה שהושגו עם כל מדיה הסתננות בדוחות קודמים 42,48. לעומת זאת, חדירה עם Agrobacteria חי גדל בייב או מדיה LB הביאה נבול של נ 'שלם benthamiana משאיר בפחות מ 24 הודעה שעה חדירה, בעוד Agrobacteria חי גדל במדיום AB לא הייתה השפעה על בריאותם של צמחים הסתננו (datלא מוצג). כפי שמודגם באיור 1 ב, צמחים הסתננו עם תרבויות Agrobacterium גדלו בייב, תקשורת LB או AB ומדולל במים מילי-Q (1:5, 600 של 0.6-0.8 או 1:10, 600 של 0.3-0.4) הראה אין סימפטומים והציגו ייצור ה-GFP ממוצע של 1645, 1520 ו 1839, בהתאמה. Agrobacteria centrifuged ומחדש תלוי במדיום אינדוקציה (MMA) לא הראה כל תסמינים ואין הבדל משמעותי בייצור חלבון בהשוואה לAgrobacteria דילול ישירות במים מילי-Q ( 131 מ"ג / קילוגרם 1671 ± 102 ו 1667 ±, בהתאמה). לכן, מים מילי-Q מומלץ לדילול תרבויות Agrobacterium לחדירת צמח והיה בשימוש באופן שגרתי בניסויים הבאים שלנו כדי להשיג 600 של 0.5.

השפעות של צפיפות תאי ההשעיה Agrobacterium וכמובן זמן על ביטוי היעד. בשלב הבא אנו בדקנו אם צפיפות תא חיידקמשפיע על היעילות של חדירה ורמות ביטוי היעד. לצורך כך, אנו הערכנו ארבע צפיפויות השעיה תא שונות של Agrobacterium ביצוע pBID4-GFP, 600 של 1.0, 0.5, 0.1 ו0.05. החדירה הבאה, נ ' צמחי benthamiana היו במעקב להתפתחות סימפטום גלוי וכמובן ביטוי יעד זמן על ידי איסוף דגימות בשעה 4, 7 ו 10 dpi. ב 4 dpi, ראו הבדלים בולטים בקרינת ה-GFP בין צמחים הסתננו עם צפיפויות השעיה תא שונות של Agrobacterium (אין ביטוי של GFP נצפה ב 600 של 0.05). בשעת 7 dpi, GFP הקרינה הייתה דומה בצמחים הסתננו בצפיפויות השעיה תא של 600 1.0, 0.5 ו0.1, אך הייתה נמוך יותר בצמחים הסתננו ב600 של 0.05. כפי שניתן לראות באיור 1 ג, נתונים אלה אושרו על ידי כתם מערבי ניתוחים של דגימות שנאספו ב 4 dpi, מראים ייצור חלבון נמוך מאוד ב600 ב600 של 1.0 (1739 מ"ג / קילוגרם). בשעת 7 dpi, צמחים לא הראו הבדלים משמעותיים בייצור ה-GFP מוערך ב600 של 1.0, 0.5 ו0.1 (1,662, 1,870 ו 1,890, בהתאמה), ואילו 600 של 0.05 הראו ייצור נמוך יותר GFP (1,199 מ"ג / קילוגרם). לעומת זאת, ב10 dpi אין הבדלים בייצור ה-GFP נצפו בקרב צמחים שחדר עם אחד מארבע צפיפויות ההשעיה תא (1,218, 1,181, 1,197 ו 1,304).

הסתננות עם זנים חלופיים של Agrobacterium. כדי להגדיל את המגוון של זני Agrobacterium זמין לייצור חלבון חולף, בדקנו פראי מהסוג מבודד. זנים אלה, מבודדים מכתר כיס של מארחים טבעיים, סופקו באדיבות על ידי ד"ר Gelvin (אוניברסיטת Purdue, המערב לאפייט, אינדיאנה). כדי לבחון את השירות שלהם בייצור חלבון חולף, אנו הסתננו נ benthamiana עם הזנים הבאים קאריינג pBID4-LicKM 18: א rhizogenes (A4) וא ' tumefaciens פראי מהסוג Nester זני A348, A208, וA281 (בשם At6, at10, וAt77, בהתאמה), כמו גם זני מעבדה מהונדסות של א ' tumefaciens GV3101, C58C1, וLBA4404. העלים הסתננו נאספו ב7 dpi ורמת ביטוי LicKM נאמדה על ידי assay כתם המערבי. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הרמה הגבוהה ביותר של ייצור LicKM ניתן להשיג עם זני GV3101, A4 וLBA4404 (~ 1,750 ± 163, 1,650 ± 26 ו1,450 ± 117 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה), עם הבדלים קלים; הרמה הנמוכה ביותר של ביטוי (~ 900 ± 102 מ"ג / קילוגרם) עם C58C1; וייצור ביניים עם At6, at10 וAt77 (~ 1,250 ± 19, 1,100 ± 42 ו -1,200 ± 111 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה). הפעילות האנזימטית lichenase הודגמה באמצעות assay Zymogram. איור 2 מראה כי lichenase מיוצרים ברקמות צמח חדרו באמצעות כל אחדזני Agrobacterium היו אנזימים פעילים. כדאי גם לציין כי צמחי נ benthamiana הסתננו עם זני A4 וAt77 הראה תסמינים פתולוגיים (מגבילה, התארכות פטוטרת ומסתלסל, ומסתלסל עלה), ואילו עם at10 להתאמץ התסמינים היו קלים. אין תסמינים נצפו בצמחי נ benthamiana הסתננו עם GV3101 זן מעבדה (איור 2 ג).

חדירה של מיני Nicotiana חלופיים. השווינו את השיעורים של דור ביומסה וייצור חלבונים בשני מינים בטבע מהסוג של סוג Nicotiana (נ benthamiana ונ 'נסורת) ובמינים היברידיים, נ' excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת). של מינים שנבדקו, נ ' benthamiana, מארח בשימוש נרחב לייצור חלבון חולף באמצעות מערכות ביטוי מבוססות Agrobacterium או מבוססות נגיפי 2,34,49, מגיע למוכנות חדירה בתוך 4-5 שבועות של נביטה. תקופת הצמיחה הדרושה כדי ליצור את הרמה האופטימלית של ביומסה היא גם 4-5 שבועות לנ excelsiana אבל ארוך יותר (6-7 שבועות) לנ נסורת. בנוסף, internodes הצמח הוא קצר יחסית לנ נסורת בהשוואה למינים Nicotiana אחרים.

יתר על כן, אנו ציינו כי חדירת אבק של נ ' benthamiana ונ ' excelsiana ב50-250 mbar ל60 שניות הוא יעיל ביותר לagroinfiltration של כל עלים, בעוד שנ ' הנסורת קשה לחדור בשל העלים החופה ועור נמוכים יותר שלהם, גם כאשר ואקום יושם שלוש פעמים במשך 1 דקות כל אחד בנוכחות של חומרים פעילי שטח לא יוני כגון Sillwet-77 או S240. כמו כן, שיעור הנביטה של נ ' excelsiana ונ ' זרעי נסורת היו ~ 40-50%; על מנת להגביר את קצב הנביטה 90-100%, יש להתייחס אליהם עם זרעי blea 10%ch עבור שעה 1 לפני הזריעה. באותם תנאי גידול, ביומסה העלה הגבוהה ביותר שניתן להפיק מן נ ' excelsiana הוא כשני גבוהים פי השוואה לנ benthamiana (טבלה 1).

ייצור חלבון נבדק בנ benthamiana, נ ' נסורת ונ ' excelsiana הסתנן עם GV3101 מתח Agrobacterium מחסה pBID4-GFP. הצטברות ה-GFP הוערכה בשעה 7 בdpi העלים הסתננו כל שימוש באור UV ואחרי ניתוח כתם מערבי. איור 3 א מציג חלוקה שווה של ה-GFP בנ excelsiana benthamiana ונ 'והפצה אחידה בנ נסורת (בשל קושי בחדירת אזור כל עלה של נ נסורת). איור 3 ב מציג את רמת ייצור ה-GFP שהוערך על ידי תאורת אור UV בעלים הסתננו נאספו משלושה מיני Nicotiana ב7 dpi. Accumu GFPרמת lation הייתה גבוהה יותר בנ benthamiana (~ 2.23 גר '/ קילוגרם) מאשר בנ excelsiana ונ ' נסורת (~ 1.89 ו1.54 גר '/ קילוגרם, בהתאמה). הרמה הנמוכה של ייצור חלבון בנ הנסורת היא עקב חדירה והפצה של ה-GFP שנצברה בעלה נאסף לא אחידות.

הבחנו כי עלים העליונים חשופים ישירות לאור מפגינים לעתים קרובות הרמות המוקדמות ביותר והגבוהות ביותר של הצטברות חולפת GFP (ב2-4 dpi) מאשר עלים מתחת לחופה. עם זאת, במחקרים שלנו, ההצטברות של GFP הייתה הגבוהה ביותר ב7 dpi והופצה באופן שווה על פני רוב העלים, אלא בuninfiltrated עלים צומחים זה עתה שלא מראים הצטברות ה-GFP.

השפעות של לחץ ואקום ומשך בחדירת אבק ייצור חלבון חולף. מגבירה באופן משמעותי את רמות ביטוי חולפות בהשוואה ללחץ המופעל על ידי יד הזרקה עם מזרק מחטים 42. היישום שלואקום גורם לגזים להתפנות ממפעל שקוע יוצא דרך הפיוניות. כאשר הוואקום הוא שבור ולחץ מגדיל במהירות, על השעיית Agrobacterium מונעת לעלים כדי להחליף את הגזים פונו 50.

כדי לבדוק את ההשפעה של לחץ ואקום על העלים של נ ' benthamiana, אנו הסתננו צמחים עם GV3101 מתח Agrobacterium מחסה pBID4-GFP תחת לחצים שונים ואקום (50-400 mbar) ל30 או 60 שניות. זה היה הוכיח כי הוואקום החזק (להלן 50 mbar) הגיש בקשה ל30 או 60 תוצאות שניות בנזק מכאני של עלים שחדר, מה שמוביל לכמישת רקמות ומוות צמח זמן קצר לאחר החדירה (24-48 hr). מצד השני, היישום של הוואקום מתון יותר (400 mbar) תוצאות בחדירת 50% בלבד מהאזור עלה וירד ברמה של ייצור ה-GFP (303 ± 90 מ"ג / קילוגרם) (איור 4 א). חשוב לציין, שלא הבחינו בהבדלים בייצור ה-GFP תחת 50, 100 ו200 mbar (1,651 ± 107, 1,688 ± 40, 1,594 ± 26 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה) (איור 4 א) וקל עד לא, השפעות מזיקות על בריאות צמח, כאשר לחצי ואקום 50-200 mbar יושמו עבור 30 או 60 שניות. לכן, 50-100 mbar לחץ ואקום מומלץ לניסויי הסתננות.

ההשפעה של משך זמן של הוואקום בביטוי היעד הוערכה על ידי חדירה שטוחה אחד נ צמחי benthamiana כל שעה עם 600 של 0.5 של GV3101 מחסה pBID4 -. GFP במשך 8 שעות באותה התרבות Agrobacterium איור 4 מראה כי רמת ייצור ה-GFP הייתה דומים בכל זמנים מצביעים עד 8 ​​שעות, מה שמרמז שעל זה פרק הזמן Agrobacterium שומר יכולתה להשיק גדילי דנ"א יחיד.

השפעה של אינדוקציה כימית בייצור חלבון. מטבוליטים פנוליות צמח מסוימים וסוכרים יכולים indגנים ארסיות uce של א ' tumefaciens 1,52. כתוצאה מכך, כימיקלים וmonosaccharaides רבים כבר דיווחו על מנת לשפר את ייצור חלבון חולף במינים צמחים שונים. Acetosyringone מתווסף בדרך כלל לתרבויות של א ' tumefaciens לגרום אופרון vir לפני agroinfiltration 40,53-57.

יש לנו להעריך את ההשפעה של ריכוזים שונים של acetosyringone (0, 100, 200 ו400 מיקרומטר) וגלוקוז (0-4%) על ייצור חלבון ה-GFP החולף בנ benthamiana הסתנן עם GV3101 Agrobacterium זן מחסה pBID4 - ה-GFP. לצורך כך, אנו מחדש תלויים תאי Agrobacterium בתקשורת האינדוקציה MMA המכילים ריכוז של acetosyringone וגלוקוז שונה עבור 1-3 שעות לפני החדירה. על פי התוצאות של שתי תצפית ויזואלית (מידע לא מוצג) וניתוח כתם המערבי (איור 4C), אף אחד מהריכוז נבדקשל תרכובות אלו הנגרם על גידול משמעותי בקרינת ה-GFP או ייצור חלבון בהשוואה לשליטה בה תקשורת אינדוקציה לא הכילה acetosyringone או גלוקוז.

השפעה של שיתוף הסתננות של מדכאי השתקה על ייצור חולף של גנים ה-GFP וHAC1 בנ benthamiana עוזב. זה כבר הוכיח בעבר כי שיתוף ביטוי של מדכאי השתקה (P19 של נגיף פעלולים סבוך עגבניות [TBSV]) מפריע להשתקת גן לאחר תעתיק (PTGS), וכתוצאה מכך הייצור מוגבר של חלבוני כתב 34.

הערכנו את ההשפעה של שיתוף חדירה של נ ' benthamiana עם וקטור ההשקה נושא את גן ה-GFP כתב (pBID4-GFP) ו p19. לפני החדירה, דילולים 600 של 0.5 של א ' תרבויות tumefaciens GV3101 מחסה pBID4-GFP וp19 היו מעורבות בהתאמה ביחסים של 1:1, 2:1, 3:1 ו4:1. אקספרסיון של מדכאי ההשתקה נשלט על ידי האמרגן 35S וירוס פסיפס כרובית. כפי שצוין על ידי התוצאות של ניתוח כתם מערבי ב7 dpi (איור 5 א), הנוכחות של p19 לא להגדיל או להקטין את ייצור ה-GFP בנ benthamiana, בכל יחס של שתי השעיות Agrobacterium.

יש לנו גם השוו את ההשפעות של שני מדכאי נגיפיים השתקת גנים - p19 p23and - על מניעת PTGS לHAC1. תרבויות של Agrobacterium נושאות את וקטור השקת pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) ואחד משני פלסמידים המדכאים השתקה הנגיפי היו מדוללים ל600 של 0.5, מעורבת ביחס של 4:1, בהתאמה, ו שיתוף חדר לנ 4-5-בן שבוע benthamiana. השעיה של א ' tumefaciens ביצוע pBID4 - HAC1 לבד היה הסתנן כביקורת. דגימות העלים הסתננו נאספו 3-8 dpi. הניסוי היה repeרמות ממוצעת פעמים ated שלוש ושל ביטוי HAC1 נקבעו על ידי ניתוח כתם מערבי.

כפי שמודגם באיור 5, שיתוף חדירה של נ ' benthamiana עם p23 או p19 הביא (642 ± 157 ו764 ± 108 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה) לעלייה בייצור HAC1 לעומת אי שימוש במדכאי השתקה (כ 15-25% בהתאמה) בשעה 6 dpi. הדבר מצביע על כך p23 p19 והם יעילים במערכת שלנו. עם זאת, יש לציין כי הצטברות של HAC1 התרחשה יום קודם לכן, כאשר pBID4-HAC1 הייתה שיתוף הסתנן עם p19. לכן, התוצאות שלנו מראות כי ההשפעות של p19 ההשתקה המדכא על HAC1 והצטברות ה-GFP שונות, המצביעות על שיפור סלקטיבית של ביטוי ו / או יציבות של חלבונים מסוימים בנ החולף benthamiana.

אנחנו גם ציינו כי גם בנוכחות ובהעדר של מדכאי השתקת רמת לדרבן חלבון HAC1 uction החל ירידה ב7 dpi. זה מצביע על כך העיתוי של הירידה בייצור החלבון החולף בנ benthamiana הסתנן עם וקטור ההשקה הוא היעד ספציפי.

בנק התא של Agrobacterium מחסה וקטור ההשקה הוערך בכל שנה ליציבות יעד גן, כדאיות Agrobacterium ורמת הצטברות חלבון. מניית גליצרול של בנק התא של מתח GV3101 הפך עם pBID4-HAC1 שאוחסן ב -80 ° C הוכח להיות מאוד יציב במשך יותר משלוש שנים ללא שינוי ברמה של ייצור חלבון החולף בנ הסתנן צמחי benthamiana. איור 5 ג מוכיחים כי ייצור חלבון HAC1 המוערך על ידי מערבי סופג בשנים של 2010 2011, 2012 ו 2013 היה 670, 685, 566 ו683 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה. ייצור HAC1 הממוצע בנ צמחי benthamiana היה 651 ± 49.4 מ"ג / קילוגרם.

= "Jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> טבלת 1
טבלה 1. השוואה של נ ' ייצור ביומסה צמח excelsiana benthamiana ונ '.

איור 1
איור 1. ניתוח כתם המערבי של ביטוי גנים החולף בנ benthamiana. () נ 'שישה שבועות בן צמחי 1 benthamiana) גדל בתמיסת דשן המכילה זרחן 4.8% ו2) גידול צמחים בתמיסת דשן המכילה זרחן 0%. עשרים וחמישה מיקרוגרם שווה ערך למשקל עלים הטרי היה טעון לכל נתיב. (ב) השוואה של ייצור ה-GFP בצמחי ואקום הסתנן עם pBID4-מחסה-GFP תרבויות Agrobacterium GV3101 גדלו בשלושה כלי תקשורת שונות: ייב, AB ו LB. תרבויות GV3101 גדלו O / N בייב או מדיה LB היו centrifuged במהירות נמוכה ומחדש תלויות במדיום אינדוקציה (MMA) (נתיבים: MMA-1 ו-MMA-2, בהתאמה), או גדלו O / N בייב, LB או תקשורת AB ו ישירות בדילול מלא ל01:05 או 1:10 עם מים מילי-Q (נתיבים: ייב / 5 וYEB/10; א.ב. / 5 וAB/10; LB / 5 וLB/10) (ג) השוואה. ביטוי ה-GFP ב 4, 7 ו 10 dpi הבא הסתננות ואקום עם ריכוזים שונים (600 של 1.0, 0.5, 0.1 ו0.05) של א ' tumefaciens מתח GV3101 ביצוע pBID4-GFP.

איור 2
חדירת אבק איור 2. השוואה של ייצור lichenase החולף ופעילות הבאה של נ ' צמחי benthamiana עם diffeלשכור זנים של Agrobacteria. תרבויות של זני Agrobacteria (GV3101, A4, At77, C58C1, At6, at10 וLBA4404) מחסה וקטור השקת pBID4-LicKM הסתנן בנפרד לתוך עלים של נ ' benthamiana. עלים הסתננו נאספו ב7 dpi. () Lichenase ייצור לכמת ידי מערבי סופג. (ב) assay Zymogram הוכחת ייצור lichenase באמצעות פעילות האנזימטית. (C) השפעת Agrobacterium (wild-type A4, at10, At77 וזן המעבדה GV3101) חדירה בנ בריאות צמח benthamiana ב7 dpi. עשרים וחמישה מיקרוגרם שווה ערך למשקל עלים הטרי היה טעון לכל נתיב.

איור 3
איור 3. חלוף הביטוי של GFP בעלים של נ ' benthamiaנה, excelsiana נ 'ונ' בנסורת 7 dpi לאחר חדירת אבק עם א ' tumefaciens מחסה pBID4 וקטור ההשקה - ה-GFP. (א) בדיקה חזותית של ביטוי ה-GFP תחת אור UV. (ב ') ניתוח כתם מערבי של הצטברות ה-GFP.

איור 4
איור 4. אפקטים (א) ללחץ ואקום על ביטוי של GFP חולף ובריאות צמח. נ צמחי benthamiana הסתננו עם pBID4 -. ה-GFP תחת לחצים ואקום של 400, 200, 100 או 50 mbar, בזמן ואקום החזק של 30 או 60 שניות יציבות (B) והדבקה של א ' tumefaciens בנ benthamiana הסתנן עם Agrobacterium GV3101 מחסה pBID4-GFP גדל במדיום AB ומדולל ל600 של 0.5. Agroinfiltration בוצע על ידי מסתנן שטוח אחד נ צמחי benthamiana כל שעה באותה התרבות מדוללת Agrobacterium (נתיבי 0-8). (ג) השפעה של ריכוזים שונים של acetosyringone וגלוקוז על ביטוי חולף של ה-GFP. GV3101 מתח Agrobacterium מחסה pBID4 - GFP היה גדל O / N בתקשורת ייב, centrifuged וresuspended ל600 של 0.5 או בMMA המכיל גלוקוז 2% עם acetosyringone ב 0, 100, 200 או 400 מיקרומטר, או בMMA מכיל 200 acetosyringone מיקרומטר עם גלוקוז ב 0, 1, 2 או 4%. השעיות Agrobacterium הוחזקו במשך 3 שעות בטמפרטורת חדר לפני החדירה.

איור 5
איור 5. השפעות של מדכאי השתקה על ייצור חלבון חולף בנ benthamiana עוזב. () ניתוח מערבי כתם של חלבון ה-GFP הבא שיתוף חדירת pBID4-GFP ו p19 ביחסים שונים. דגימות שנאספו ב7 dpi (25 מיקרוגרם שווה ערך למשקל עלים הטרי היו טעונים לכל נתיב). (ב) תרבות של Agrobacterium ביצוע pBID4-HAC1 הייתה מעורבות באופן אישי בכל יחס של 04:01 עם תרבות נושאת את מדכאי p19 או השתקת p23 פלסמידים. שילובים של תרבויות Agrobacterium כתוצאה מואקום, שחדרו לצמחים. רקמות שחדר של HAC1 נאספו מדי יום עד 8 ​​dpi לכימות חלבון רקומביננטי. (C) יציבות של בנק תא Agrobacterium. צמחים שחדר עם אותה הקבוצה של בנק תא Agrobacterium מדי שנה כדי להעריך את הצטברות חלבון. חמישים מיקרוגרם שווה ערך למשקל עלים הטרי היה טעון לכל נתיב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ההוא דמות.

Discussion

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול agroinfiltration פשוט לייצור חלבון חולף שיגרתי במינים Nicotiana נבחרו באמצעות זני Agrobacterium נושאים את וקטור השיגור. בנוסף, יש לנו זיהינו את התנאים האופטימליים כדי להשיג את רמת ייצור חלבון הגבוהה ביותר רקומביננטי במערכת הביטוי שלנו חולפת צמח.

חדירת אבק של א 'בדילול tumefaciens GV3101 זן מחסה pBID4 וקטור ההשקה לנ benthamiana, נ ' excelsiana ונ 'הנסורת הביאו לרמות גבוהות יותר של ייצור חלבון המטרה תוך 7 dpi בהשוואה למינים צמחים אחרים, כגון Pisum sativum הסתנן עם GV3101 מחסה וירוס פסיפס אספסת - או פסיפס מלפפון וקטורים מבוסס וירוס המבטאים את הגן המדווח GFP תחת אמרגן 35S סאטיבה 41, או lactuca, Solanum lycothaliana persicum וארבידופסיס הסתנן עם זן C58C1 של א ' tumefaciens נושא את גן הכתב בטא glucuronidase 57. נ benthamiana ונ ' excelsiana היו קל לואקום לחדור ב50 mbar עבור 30-60 שניות, עם 90-95% יעילות הסתננות. 5-10% הנותרים של אזור עלה לא הסתננו בגלל כמה צף של עלים על פני השטח של ההשעיה Agrobacterium במהלך היישום של הוואקום. מאז יש לו את וקטור השקת יכולת לתנועת תא אל התא 18, הצטברות חלבון חולפת מתרחשת בעלים שלמים, כמו גם פטוטרות ב7 dpi. ב10 dpi, ייצור ה-GFP המוערך היה נמוך במקצת בגלל וקטור ביטוי pBID4 הוא מסוגל לעבור מתא לתא, אך לא לעבור מערכתי 18; לכן, עלים גדלו חדש אינם מכילים את הווקטור ואינו תורמים לייצור של היעד. בנוסף, מ 'לאורך זמן פירוקו של חלבון רקומביננטיאיי לתרום לרמת חלבון מופחתת ב10 dpi. התוצאות שלנו הראו כי חדירה של א ' רמות גבוהות GV3101 מתח tumefaciens תיווך של ייצור חלבון החולף בנ benthamiana. יתר על כן, חלבון המטרה יכול להיות מהונדס כהתכת N-מסוף, טרמינל C-או פנימית לlichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, שהוא אנזים חום מthermocellum Clostridium ומקנה thermostability רבים יעד היתוך חלבון 18. הסתננות של נ ' benthamiana עם א ' tumefaciens wild-type זנים (at6, at10 וat77) מחסה הגן של עניין שהושרו על תסמינים מתונים או חמורים: סלסול עלים, התארכות פטוטרת, ומסתלסל. אין תסמינים פתולוגיים נצפו בנ benthamiana הסתנן עם GV3101 זן המעבדה מחסה וקטור pBID4 ריק, בעוד כמה גנים מוכנסים לתוך pBID4 והפכו למעבדת זני GV3101, C58C1 או LBA4404 עורר תגובות נמקים קלות ועלהירקון / מצהיבים סימפטומים באזורי שחדר של עלים. סימפטומים הנגרמים על ידי נימקי Agrobacterium wild-type או זני מנשקו בצמחי הסולניים כבר דיווחו בעבר 56,57. תגובת נמקים יכולה לנבוע מגורמים ארסי של מערכת הפרשת סוג III, חלבוני חיידקים מועברים לתא הצמח על ידי מערכת הפרשת סוג ד ', ו / או רגישות לflagellin 58-60. מצאנו כי ייצור חולף של חלבוני Heterologous עשוי גם לעורר פתוגניות ותגובת רגישות יתר בצמח חדר עוזבת. חוקרים רבים דיווחו agroinfiltration זה של מיני צמחים שונים עם וקטורים בינאריים מפעל מיוצרים עד לרמות גבוהות יותר 5-20 זמנים של ייצור חלבון חולף בהשוואה לצמחים הפכו ביציבות 28,57. הנתונים שלנו מראה שנ ' benthamiana הסתנן עם GV3101 מחסה רמות גבוהות של ה-GFP, שהיא דומה לתשואת ה-GFP דיווחה להביעו transiently pBID4-GFPנ benthamiana הסתנן עם Agrobacteria נושא את וקטור Pich-GFPSYS הנגיפי (עד 80% מחלבון מסיס בסך הכל) 44. Agroinfiltration באמצעות וקטור ההשקה שלנו הביא לייצור גבוה של חלבון LicKM החום, 50 לקפל גבוה יותר מזה שנצפה באמצעות פלסמיד בינארי סטנדרטי 18.

כדי לבדוק את ההדבקה של א ' tumefaciens והיציבות של וקטור ההשקה, אנחנו הסתננו שטוחים אחד נ benthamiana כל שעה עד 8 ​​שעות שימוש באותה התרבות בדילול מים מילי-Q של GV3101 מחסה פלסמיד pBID4-GFP. הנתונים שלנו הראו כי מתח GV3101 הוא יעילות התולעת לפחות 8 שעות וpBID4 (וקטור ההשקה) הוא מאוד יציב במהלך החדירה ארוכת שעות 8.

מניית גליצרול של מתח GV3101 מחסה וקטור השקת pBID4-HAC1 (בנק תא) מאוחסן ב -80 C ° הוכח להיות מאוד יציב במשך שלוש שנים ללא שינויים בהגנה של מחזור חולףבייצור במפעלים שחדר.

צמחי נ benthamiana גדלו בתנאים אופטימליים ובין 35 42 הודעה ימי זריעה היו אופטימליים לביטוי ואקום בתיווך החדירה חולף גן 40. צמחים צעירים יותר (3-4 שבועות) לא יכולים להיות שחדר כולו בגלל עלים צפים על פני ההשעיה תא ונזק לרקמות מפני ההשפעות מכאניות של החלת ואקום. בצמחים מבוגרים יותר מ45 ימים, נ ' benthamiana הנעילה במה, בתנאי האור האופטימלי בשימוש, ברמה של ביטוי החולף היא נמוכה.

תרכובות פנוליות נמוכה מולקולריות משקל (acetosyringone) וmonosaccharaides (גלוקוז) ידועים כדי לגרום לגני vir בא tumefaciens 55,61. יתר על כן, חדירה של נ ' benthamiana עם pCAMBIA ינארי הווקטור (GFP) בנוכחות acetosyringone בריכוזים של 50-600 מיקרומטר הוצג כדי להגדיל מעט חולף ביטוי גנים 40. אנחנו בחנו את ההשפעה של ריכוזים שונים של acetosyringone וגלוקוז במערכת שלנו על ידי הוספת תרכובות אלה לתרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP בMMA למשך 3 שעות, ולא מצאנו הבדל בביטוי של GFP. מעניין, תרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP ומדולל במים מילי-Q ל600 של 0.5 והסתננו ללא האינדוקציה גן vir הביעו אותן כמויות של ה-GFP כמו אלה הסתננו עם תרבויות מושרה. א גן tumefaciens vir (ים) שעלול להיגרם על ידי תרכובות פנוליות צמח (acetosyringone וחומצת sinapinic) וmonosaccharaides צמח (גלוקוז ופרוקטוז) הנמצא ברקמת עלה. לכן, אנו משערים כי רמות דומות של ביטוי ה-GFP בנוכחותו או היעדריו של מעוררי גן vir אקסוגני עשויות להיות תוצאה של השפעת מעוררי גן vir cytoplasmic הנוכחים במהלך השכפול של וקטור ההשקה-GFP-לבטא בתאי צמח.

= "Jove_content"> נ Wild-type benthamiana שמש כמארח מודל לייצור חלבון חולף 49. עם זאת, תשואה ביומסה נמוכה יחסית נ 'של benthamiana מעכבת את בקשתה לייצור בקנה מידה גדולה של חלבונים רקומביננטיים. המארח האופטימלי צריך לשלב רמה גבוהה של ביטוי חולף, צמיחה קלה בחממה, ולהיות רגיש לAgrobacterium חדירה 2. כדי לבחור מארח חלופי, אנו הסתננו שני מינים בטבע מהסוג שונים של Nicotiana (נ benthamiana ונ 'אקסלסיור) ונ' היברידי excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) עם א ' tumefaciens GV3101 זן מחסה פלסמיד pBID4-GFP. בין שלושת המינים הללו, רמת הביטוי של GFP הייתה מעט גבוהה יותר בנ benthamiana. נ צמחי נסורת הראו קושי בagroinfiltration ואקום בשל העלים העור שלהם, ונ ' excelsianaמיוצר כשני לקפל יותר ביומסה באותם תנאי גידול. הייצור הארעי של ה-GFP ב7 dpi הוא יחסית דומה בנ benthamiana ונ ' excelsiana. לכן, נ ' excelsiana עשוי להיות מארח מתאים יותר לייצור חלבון רקומביננטי.

ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium מוגבל על ידי 26 PTGS, שניתן להתגבר על ידי שיתוף ביטוי של השתקת גני מדכאי ממוצא וירוס צמח 62. ייצור חלבון חולף כבר הראה בעבר להיות משופר פי 50 בנוכחותו של חלבון p19 של TBSV, אשר מעכב PTGS ברקמות הסתננו 34. במחקר שלנו, העריך את ההשפעה של שני מדכאי נגיפיים השתקה (p19 ו p23) בנפרד שיתוף הסתננו עם וקטור השקת pBID4-HAC1. שיתוף ההסתננות של מדכאי השתקה אלה נראית שיש השפעה מועטת על ביטוי חולף של HAC1, עם עלייה קלה בלבד בHAC1הצטברות חלבון (15-25%) בנוכחות של p23 או p19 שיתוף הסתנן. כדי להשפיע על ייצור חלבון באופן חיובי, מדכאי השתקה ייתכן שיהיו הצורך שנבחרו במיוחד כדי להיות יעיל עבור מיני צמחים הממוקדים ווקטור ויראלי 63. יש helicase TMV מדכאי פעילות השתקת RNA 64,65. הנתונים שלנו לאשר תצפית זו כמו שיתוף ההסתננות של p23 או p19 עם pBID4-HAC1 לא גרמה לעלייה בGFP או עלייה קלה בייצור חלבון HAC1 החולף.

לסיכום, יש לנו שונה ומותאם צמח ותנאי גידול Agrobacterium ושיפרו את היעילות של חדירת אבק. טכנולוגיה זו אפשרה לנו לגדול ולחדור מאות קילוגרמים של חומר צמחי בכמה שעות. אנחנו אוטומטיים בהצלחה טכניקת הביטוי חולפת המפעל לייצור חיסון תפוקה גבוהה בקני מידה תעשייתיות בשיטות ייצור טוב הנוכחיות תנאים (cGMP). לקבלת מידע נוסף אבוהאוטומציה ut וניצול של מערכת הצמח חולפת חלבון הייצור לייצור חלבונים רקומביננטיים, כולל מועמדי חיסון למקטע, תחת תנאי cGMP, קוראים מופנים לאתר www.fhcmb.org/.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Fraunhofer מרכז ארה"ב למולקולרית וביוטכנולוגיה, iBio, Inc וביטחון מחקר מתקדם פרויקטים סוכנות (# מענק HDTRA1-07-C-0054). המחברים מודים מתנות הנדיבות על ידי בני הזוג. סטנטון Gelvin של מדע ביולוגי חוג, אוניברסיטת פרדו (Agrobacterium tumefaciens זנים) וויין פיצמוריס לביולוגיה קורפ בקנה מידה גדולה (זרעי excelsiana נ '), כמו גם ג'ניפר ניקולסון של ארה"ב Nicotiana אוסף, צפון קרוליינה סטייט (זרעי נסורת נ ). המחברים מודים מרגרט Shillingford וכריסטופר האל על מתן צמחים וסיוע טכני מעולה. המחברים מודים גם בני הזוג. סטיבן Streatfield ונטשה קושניר למערכת סיוע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Tags

ביולוגיה צמח גיליון 86 Agroinfiltration, ייצור חולף חלבון ביטוי על בסיס צמחי וקטור ויראלי,
אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V.,… More

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter