Agrobacteria (तंबाकू मोज़ेक वायरस आधारित) टीका एंटीजन और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और आर्थिक दृष्टिकोण है लांच वैक्टर ले जाने के साथ वैक्यूम घुसपैठ पर आधारित निकोटियाना पौधों में क्षणिक प्रोटीन उत्पादन. हम प्रक्रिया सरल और, बैक्टीरिया की खेती की शर्तों के अनुकूलन मेजबान प्रजातियों का चयन, और आरएनए मुंह बंद दमन सह शुरू करने से लक्ष्य संचय सुधार हुआ.
पौधों में Agrobacterium की मध्यस्थता क्षणिक प्रोटीन उत्पादन समय की एक छोटी अवधि के भीतर टीका एंटीजन और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है. हालांकि, इस तकनीक केवल अभी उबरने की जा रही हैं पैमाने पर करने के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादन के रूप में कई तकनीकी बाधाओं को लागू करने के लिए शुरुआत है. यहाँ, हम Agrobacteria लांच वैक्टर ले जाने के साथ निकोटियाना पौधों की वैक्यूम घुसपैठ पर आधारित औद्योगिक पैमाने पर क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का प्रदर्शन. अटल बिहारी माध्यम में Agrobacterium खेती का अनुकूलन घुसपैठ की प्रक्रिया को सरल बनाने, मिल्ली क्यू पानी में जीवाणु संस्कृति का प्रत्यक्ष कमजोर पड़ने की अनुमति देता है. निकोटियाना, एन के तीन परीक्षण किया प्रजातियों में excelsiana (एन एक्सेलसियर × एन benthamiana) की वजह से घुसपैठ की आसानी के लिए सबसे होनहार मेजबान के रूप में चयनित किया गया था, उच्च संवाददाता प्रोटीन के उत्पादन का स्तर, और के बारे में दो चनियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत पुराने उच्च बायोमास उत्पादन. Agrobacterium ऐसे acetosyringone और मोनोसैकराइड के रूप में रसायनों का उपयोग pBID4-GFP (तंबाकू मोज़ेक वायरस आधारित) को शरण देने की प्रेरण प्रोटीन के उत्पादन स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. 30 या 60 सेकंड के लिए 50 से 100 एम्बार तहत घुसपैठ संयंत्र संयंत्र पत्ता ऊतकों के बारे में 95% घुसपैठ में हुई. Agrobacterium प्रयोगशाला तनाव GV3101 साथ घुसपैठ Agrobacteria प्रयोगशाला उपभेदों LBA4404 और C58C1 और जंगली प्रकार Agrobacteria at77 और ए 4, at10, at6 उपभेदों की तुलना में सबसे अधिक प्रोटीन उत्पादन दिखाया. एन में एक विषाणु आरएनए मुंह बंद शमन, P23 या p19, सह अभिव्यक्ति benthamiana लक्ष्य प्रोटीन (इन्फ्लूएंजा वायरस hemagglutinin) के पूर्व संचय और उत्पादन में वृद्धि (15-25%) में हुई.
पौधों अब heterologous पुनः संयोजक biopharmaceuticals और औद्योगिक प्रोटीन 1-3 उत्पादन के लिए एक सुरक्षित, विश्वसनीय, स्केलेबल और सस्ती मंच के रूप में मान्यता प्राप्त है और माइक्रोबियल और पशु सेल अभिव्यक्ति सिस्टम पर 4 महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं. संयंत्रों इकट्ठे multimeric एंटीबॉडी 5-7 सहित बाद translational संशोधनों के साथ सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन व्यक्त करने में सक्षम हैं. कई संयंत्र व्युत्पन्न पुनः संयोजक दवा प्रोटीन नैदानिक मूल्यांकन 8 दौर से गुजर रहे हैं. ये गैर Hodgkin लिंफोमा 9, hemagglutinin आधारित महामारी और मौसमी फ्लू के टीके के उम्मीदवारों 10,11 (कमिंग्स एट अल., वैक्सीन के लिए प्रस्तुत), विरोधी स्ट्रेप्टोकोकस सतह प्रतिजन मैं के इलाज के लिए रोगी विशेष पुनः संयोजक idiotype टीके (scFv) शामिल / दंत क्षय 12 के उपचार, और मधुमेह 13 के उपचार के लिए मानव इंसुलिन के लिए द्वितीय एंटीबॉडी. इसके अलावा, मानव सिफारिशGaucher रोग के साथ रोगियों में एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए mbinant glucocerebrosidase इजरायल और अमेरिका में अनुमोदित किया गया है और अमेरिका 14,15 के बाहर विस्तारित प्रवेश कार्यक्रम के तहत प्रदान की जाती है.
Heterologous प्रोटीन stably तब्दील (ट्रांसजेनिक या transplastomic) या क्षणिक तब्दील संयंत्रों में उत्पादन किया जा सकता है. क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन अभिव्यक्ति और संचय 16 को प्राप्त करने के लिए कम समय सीमा सहित ट्रांसजेनिक पौधों में उत्पादन पर कई लाभ प्रदान करता है, और संयंत्र के ऊतकों 4 में बैक्टीरियल द्विआधारी वैक्टर या पुनः संयोजक संयंत्र वायरल वैक्टर शुरू करने से प्राप्त किया जा सकता है. सबसे उन्नत क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली संयंत्र वायरस और बाइनरी plasmids के घटक गठबंधन, और agroinfiltration 17,18 द्वारा वितरित कर रहे हैं कि 'लांच वैक्टर' के उपयोग पर आधारित है. तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) पर आधारित एक लांच वेक्टर के Agroinfiltration सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में लागू किया गया हैइस तरह के मानव पैपिलोमा वायरस 19, Yersinia pestis के रूप में 20 रोगजनकों के खिलाफ टीका एंटीजन का उत्पादन करने के लिए पैमाने, इन्फ्लूएंजा ए 21,22, बेसिलस anthracis 23 वायरस, और एन में चेचक वायरस 24 benthamiana छोड़ देता है. Agrobacterium की मध्यस्थता क्षणिक अभिव्यक्ति भी कई प्रोटीन 2,25-27 के एक साथ उत्पादन के लिए एक आशाजनक तरीका है. उदाहरण के लिए, संयंत्र क्षणिक अभिव्यक्ति सिस्टम ट्यूमर विशेष पुनः संयोजक एंटीबॉडी 28,29, epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 30 के खिलाफ एक ग्लाइकोसिलेटेड पुनः संयोजक एंटीबॉडी, और एंथ्रेक्स सुरक्षात्मक प्रतिजन 31,32 के लिए विशिष्ट एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक लक्ष्य जीन और बढ़ाया लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति 33,34 में जीन मुंह बंद परिणामों की एक शमन के साथ निकोटियाना benthamiana पौधों की सह घुसपैठ.
Agroinfiltration समान रूप से introdu के लिए एक आम तरीका हैसंयंत्र में ब्याज की एक जीन को शरण देने cing बैक्टीरिया 35-37 ऊतकों. बरकरार संयंत्र में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के पत्तों के लिए Agrobacterium का वैक्यूम घुसपैठ ट्रांसजेनिक पौधों 38-41 उत्पन्न करने के लिए आवश्यकता के बिना विदेशी प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक तेजी से स्केलेबल, और उपयोगी तरीका है. वैक्यूम agroinfiltration के दौरान, पौधों उल्टा रूप से फ़्लिप हैं और हवाई भागों Agrobacterium निलंबन में डूबे हुए. तो वैक्यूम गैसों रंध्र के माध्यम से पत्ती कहनेवाला रिक्त स्थान से खाली करने के कारण लागू की गई है. पत्ती में Agrobacterium निलंबन के निषेचन में वैक्यूम परिणाम की तेजी से फिर से दबाव निम्न रिलीज. Agrobacteria के निर्वात घुसपैठ के बाद, पौधों आगे खेती की जाती है और लक्ष्य अभिव्यक्ति नजर रखी है. लक्ष्य अभिव्यक्ति के उच्चतम स्तर आम तौर पर 2-3 दिनों के बाद जो अभिव्यक्ति के स्तर आम तौर पर decrea एक लांच वेक्टर साथ एक द्विआधारी वेक्टर और 4-7 डीपीआई, साथ घुसपैठ (डीपीआई) पोस्ट मनाया जाता हैSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक संयंत्र में ब्याज की एक जीन पहुंचाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल वाहन है. Agroinfiltration एन में असाधारण अच्छी तरह से काम करता है benthamiana लेकिन अपेक्षाकृत खराब Arabidopsis thaliana 46 सहित अन्य अधिकांश पौधों में.
इस अध्ययन में, हम 5-6 सप्ताह पुराने एन में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल, और किफायती तरीका विकसित benthamiana ए का उपयोग घुसपैठ tumefaciens. agroinfiltration तकनीक के औद्योगिक स्केलिंग की बड़ी खामी 'काटा बैक्टीरिया और 4'-हाइड्रोक्सी 3 युक्त मध्यम में बैक्टीरिया गोली के मेजबान के centrifugation है, 5'-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), मोनोसैक्राइडों, और 2 – (एन morpholino) -ethanesulfonic एसिड (एमईएस) वीर जीन की प्रेरण के लिए बफर. हम Agrobacterium अनुकूलन द्वारा इन समस्याओं को दूर करने में सक्षम है </उन्हें> एबी मध्यम (कम से कम मध्यम) में वृद्धि सीधे मिल्ली क्यू पानी में और घुसपैठ की अवधि और शर्तों को नियंत्रित करने से गिराए द्वारा पीछा किया. हम यह भी जंगली प्रकार के तम्बाकू मेजबान प्रजातियों एन में लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन की तुलना में है benthamiana और एन एक्सेलसियर, साथ ही संकर एन में excelsiana.
इस अध्ययन में, हम लांच वेक्टर ले जाने Agrobacterium उपभेदों का उपयोग कर चयनित Nicotiana प्रजातियों में नियमित क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल agroinfiltration प्रोटोकॉल विकसित किया है. इसके अलावा, हम अपने क्षणिक संयंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली में उच्चतम पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन स्तर को प्राप्त करने के इष्टतम स्थितियों की पहचान की है.
पतला ए के वैक्यूम घुसपैठ एन में लांच वेक्टर pBID4 शरण तनाव GV3101 tumefaciens benthamiana, एन excelsiana और एन एक्सेलसियर ऐसे अल्फला मोज़ेक वायरस शरण GV3101 के साथ घुसपैठ की मटर के रूप में अन्य प्रजातियों के पौधे की तुलना में 7 डीपीआई के भीतर लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन के उच्च स्तर में हुई है – या ककड़ी मोज़ेक 35S प्रमोटर के तहत GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त वायरस आधारित वैक्टर 41, या Lactuca Sativa, सोलेनम lycoए के C58C1 तनाव के साथ घुसपैठ persicum और Arabidopsis thaliana बीटा glucuronidase रिपोर्टर जीन 57. एन ले जाने tumefaciens benthamiana और एन excelsiana 90-95% घुसपैठ दक्षता के साथ, 30-60 सेकंड के लिए 50 एम्बार में घुसपैठ वैक्यूम करने के लिए आसान थे. पत्ती क्षेत्र की शेष 5-10% क्योंकि निर्वात के आवेदन के दौरान Agrobacterium निलंबन की सतह पर पत्तों के कुछ चल की घुसपैठ नहीं किया गया था. लांच वेक्टर सेल करने वाली सेल आंदोलन 18 के लिए क्षमता है के बाद से, क्षणिक प्रोटीन संचय 7 डीपीआई पर पूरे पत्ते के साथ ही petioles में होता है. PBID4 अभिव्यक्ति वेक्टर सेल से सेल को स्थानांतरित करने में सक्षम है लेकिन प्रणालीबद्ध 18 स्थानांतरित करने के लिए नहीं है क्योंकि 10 डीपीआई पर, अनुमानित GFP उत्पादन थोड़ा कम था; इसलिए, नव विकसित पत्तियों वेक्टर शामिल नहीं है और लक्ष्य के उत्पादन में योगदान नहीं है. इसके अलावा, पुनः संयोजक प्रोटीन की गिरावट से अधिक समय Mप्र 10 डीपीआई पर कम प्रोटीन के स्तर में योगदान. हमारे परिणाम बताते हैं ए की कि घुसपैठ से पता चला एन में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के tumefaciens तनाव GV3101 मध्यस्थता उच्च स्तर benthamiana. इसके अलावा, लक्ष्य प्रोटीन lichenase को एन टर्मिनल, सी टर्मिनल या आंतरिक fusions (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, क्लोस्ट्रीडियम thermocellum से एक थर्मास्टाइबल एंजाइम है और कई लक्ष्य को thermostability प्रदान के रूप में जो इंजीनियर हो सकता है प्रोटीन संलयन 18. एन की घुसपैठ ए के साथ benthamiana पत्ती कर्लिंग, डंठल बढ़ाव, और कर्लिंग: हल्के या गंभीर लक्षण हासिल ब्याज की जीन को शरण जंगली प्रकार उपभेदों (at6, at10 और at77) tumefaciens. कोई रोग लक्षण एन में मनाया गया कुछ जीन GV3101 उपभेदों pBID4 में डाला और प्रयोगशाला में तब्दील करते हुए benthamiana, खाली pBID4 वेक्टर शरण प्रयोगशाला तनाव GV3101 साथ घुसपैठ, C58C1 या LBA4404 हल्के परिगलित प्रतिक्रियाओं और पत्ती हासिलहरिद्रोग / पत्तों की घुसपैठ क्षेत्रों में लक्षण पीली. जंगली प्रकार Agrobacterium या solanaceous पौधों में निरस्त्र उपभेदों के कारण परिगलित लक्षण पहले से 56,57 सूचित किया गया है. परिगलित प्रतिक्रिया प्रकार III स्राव प्रणाली, प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली द्वारा संयंत्र सेल को हस्तांतरित बैक्टीरियल प्रोटीन, और / या flagellin 58-60 के प्रति संवेदनशीलता का विषैलापन कारकों से परिणाम सकता है. हम heterologous प्रोटीन की क्षणिक उत्पादन भी pathogenicity बटोर सकते हैं और घुसपैठ संयंत्र में एक अत्यंत अनुभुत प्रतिक्रिया छोड़ देता है कि मिल गया है. कई शोधकर्ताओं stably तब्दील पौधों 28,57 की तुलना में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के 5-20 गुना ज्यादा के स्तर तक का उत्पादन संयंत्र द्विआधारी वैक्टर के साथ विभिन्न प्रजातियों के पौधे की कि agroinfiltration की सूचना दी. हमारे डेटा से पता चलता है कि एन benthamiana GV3101 के लिए सूचना दी GFP उपज के समान है जो GFP, के pBID4-GFP transiently व्यक्त उच्च स्तर को शरण देने के साथ घुसपैठएन benthamiana Agrobacteria Pich-GFPSYS वायरल वेक्टर (कुल घुलनशील प्रोटीन के ऊपर से 80%) 44 ले जाने के साथ घुसपैठ की. अपने लांच के सदिश का उपयोग Agroinfiltration थर्मास्टाइबल प्रोटीन LicKM के उच्च उत्पादन के परिणामस्वरूप, एक मानक बाइनरी प्लाज्मिड 18 का उपयोग करते हुए कहा कि अधिक से अधिक 50 गुना.
ए की संक्रामकता परीक्षण करने के लिए tumefaciens और प्रक्षेपण वेक्टर की स्थिरता, हम एन के एक फ्लैट में घुसपैठ benthamiana pBID4-GFP प्लाज्मिड शरण GV3101 का एक ही मिल्ली क्यू पानी में पतला संस्कृति का उपयोग करने के लिए 8 घंटे के लिए हर घंटे. हमारे आंकड़े GV3101 तनाव कुशलता से कम से कम 8 घंटे और pBID4 (लांच सदिश) के लिए संक्रामक पता चला है कि 8 घंटा भर की घुसपैठ के दौरान बहुत स्थिर है.
-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लांच वेक्टर pBID4-HAC1 (सेल बैंक) को शरण देने GV3101 तनाव की ग्लिसरॉल स्टॉक क्षणिक prote में बदलाव के बिना तीन साल के लिए बहुत स्थिर होना दिखाया गया हैघुसपैठ संयंत्रों में उत्पादन में.
इष्टतम स्थितियों और 35 के बीच और 42 दिनों के बाद बुआई के तहत हो एन benthamiana पौधों वैक्यूम घुसपैठ की मध्यस्थता क्षणिक जीन अभिव्यक्ति 40 के इष्टतम थे. (3-4 सप्ताह पुराने) युवा पौधों क्योंकि सेल निलंबन सतह और एक निर्वात लागू करने की यांत्रिक प्रभाव से ऊतकों को नुकसान पर चल पत्तियों की पूरी तरह से घुसपैठ नहीं किया जा सकता. 45 दिन, एन से अधिक पुराने संयंत्रों में benthamiana इस्तेमाल किया इष्टतम प्रकाश परिस्थितियों में, मंच पेंच, क्षणिक अभिव्यक्ति का स्तर कम है.
कम आणविक भार phenolic यौगिकों (acetosyringone) और monosaccharaides (ग्लूकोज) 55,61 tumefaciens ए में वीर जीन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है. इसके अलावा, एन की घुसपैठ 50-600 माइक्रोन की सांद्रता में acetosyringone की उपस्थिति में द्विआधारी वेक्टर pCAMBIA (GFP) के साथ benthamiana थोड़ा क्षणिक वृद्धि दिखाया गयाजीन अभिव्यक्ति 40. हम 3 घंटे के लिए एमएमए में pBID4-GFP शरण GV3101 संस्कृतियों के लिए इन यौगिकों जोड़कर हमारे सिस्टम में acetosyringone और ग्लूकोज के विभिन्न सांद्रता के प्रभाव का अध्ययन किया, और GFP अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं पाया. दिलचस्प है, pBID4-GFP शरण देने और 0.5 का एक ए 600 को मिल्ली क्यू पानी में पतला और वीर जीन प्रेरण बिना घुसपैठ GV3101 संस्कृतियों प्रेरित संस्कृतियों के साथ घुसपैठ की उन के रूप में GFP की एक ही मात्रा में व्यक्त किया. ए tumefaciens वीर जीन (ओं) संभावित संयंत्र phenolic यौगिकों (acetosyringone और sinapinic एसिड) और पत्ता ऊतक में उपस्थित संयंत्र monosaccharaides (ग्लूकोज और फ्रुक्टोज) द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इसलिए, हम एक्सोजेनस वीर जीन inducers की उपस्थिति या अनुपस्थिति में GFP अभिव्यक्ति के समान स्तर संयंत्र कोशिकाओं में GFP-व्यक्त लांच वेक्टर की प्रतिकृति के दौरान उपस्थित cytoplasmic वीर जीन inducers के प्रभाव की वजह से हो सकता है कि अटकलें.
<p class= "Jove_content"> जंगली प्रकार एन benthamiana क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन में 49 के लिए एक मॉडल के मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, एन benthamiana की अपेक्षाकृत कम बायोमास उपज पुनः संयोजक प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अपने आवेदन hinders. इष्टतम मेजबान क्षणिक अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तरीय, एक ग्रीन हाउस में आसान वृद्धि गठबंधन, और Agrobacterium घुसपैठ 2 के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए. एक विकल्प के मेजबान का चयन करने के लिए, हम एक संकर एन निकोटियाना (एन benthamiana और एन छीलन) की दो अलग अलग प्रकार के जंगली प्रजातियों में घुसपैठ की और ए के साथ excelsiana (एन एक्सेलसियर × एन benthamiana) pBID4-GFP प्लाज्मिड शरण तनाव GV3101 tumefaciens. इन तीन प्रजातियों के बीच, GFP अभिव्यक्ति के स्तर एन में थोड़ा अधिक था benthamiana. एन ऊँचे पौधों की वजह से उनकी चमड़े के पत्तों को वैक्यूम agroinfiltration में कठिनाई से पता चला है, और एन excelsianaउत्पादन लगभग एक ही विकास शर्तों के तहत अधिक बायोमास दो गुना. 7 डीपीआई पर GFP की क्षणिक उत्पादन एन में अपेक्षाकृत समान है benthamiana और एन excelsiana. इसलिए, एन excelsiana पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक अधिक उपयुक्त मेजबान हो सकता है.Agrobacterium की मध्यस्थता क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन जीन संयंत्र वायरस की उत्पत्ति 62 का दमन मुंह बंद के सह अभिव्यक्ति से दूर किया जा सकता है, जो PTGS 26, द्वारा सीमित है. क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन पहले से घुसपैठ ऊतकों 34 में PTGS रोकता है जो TBSV की p19 प्रोटीन, की उपस्थिति में 50 गुना बढ़ाया जा दिखाया गया है. हमारे अध्ययन में, हम अलग से लांच वेक्टर pBID4-HAC1 साथ सह घुसपैठ की दो वायरल मुंह बंद दमन (p19 और p23) के प्रभाव का आकलन किया. इन मुंह बंद दमन के सह घुसपैठ HAC1 में केवल एक मामूली वृद्धि के साथ, HAC1 की क्षणिक अभिव्यक्ति पर थोड़ा प्रभाव है प्रतीत होता हैसह घुसपैठ P23 या p19 की उपस्थिति में प्रोटीन संचय (15-25%). सकारात्मक प्रोटीन के उत्पादन को प्रभावित करने के लिए, मुंह बंद दमन विशेष रूप से लक्षित प्रजातियों के पौधे और वायरल वेक्टर 63 के लिए प्रभावी होने के लिए चयनित किए जाने की आवश्यकता हो सकती है. TMV helicase आरएनए मुंह बंद गतिविधि 64,65 के एक शमन है. PBID4-HAC1 साथ P23 या p19 के सह घुसपैठ GFP में कोई वृद्धि या क्षणिक HAC1 प्रोटीन के उत्पादन में मामूली वृद्धि के परिणामस्वरूप के रूप में हमारे आंकड़े इस अवलोकन की पुष्टि करें.
अंत में, हम संशोधित और अनुकूलित संयंत्र और Agrobacterium विकास की स्थिति और वैक्यूम घुसपैठ की दक्षता में सुधार हुआ है. यह तकनीक कुछ ही घंटों में संयंत्र सामग्री के किलोग्राम के सैकड़ों बढ़ने और घुसपैठ करने के लिए सक्षम होना चाहिए. हम सफलतापूर्वक वर्तमान अच्छा विनिर्माण पद्धतियों (cGMP) की शर्तों के तहत औद्योगिक तराजू पर उच्च throughput वैक्सीन उत्पादन के लिए संयंत्र क्षणिक अभिव्यक्ति तकनीक स्वचालित. ABO अधिक जानकारी के लिएकेन्द्र शासित प्रदेशों के स्वचालन और cGMP परिस्थितियों में सबयूनिट वैक्सीन उम्मीदवारों सहित पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए संयंत्र क्षणिक प्रोटीन उत्पादन प्रणाली, का उपयोग, पाठकों वेबसाइट में भेजा जाता है www.fhcmb.org/ .
The authors have nothing to disclose.
इस काम आण्विक जैव प्रौद्योगिकी, iBio, इंक और रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (अनुदान # HDTRA1-07-C-0054) के लिए Fraunhofer अमरीका केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों डीआरएस द्वारा उदार उपहार को स्वीकार करते हैं. जैव विज्ञान विभाग, पर्ड्यू विश्वविद्यालय (Agrobacterium उपभेदों tumefaciens) और बड़े पैमाने पर जीवविज्ञान कार्पोरेशन की वेन Fitzmaurice (एन excelsiana बीज), और साथ ही अमेरिका निकोटियाना संग्रह, उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय (एन एक्सेलसियर बीज की जेनिफर निकोल्सन के स्टैंटन Gelvin ). लेखकों पौधों और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए मार्गरेट शिलिंगफोर्ड और क्रिस्टोफर हल धन्यवाद. लेखकों को भी डीआरएस धन्यवाद. संपादकीय सहायता के लिए स्टीफन Streatfield और नताशा Kushnir.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |