Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimalisering og utnyttelse av Published: April 19, 2014 doi: 10.3791/51204
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

Summary

Transient proteinproduksjon i Nicotiana anlegg basert på vakuum-infiltrering med Agrobacteria bærer utskytnings vektorer (tobakk mosaikkvirusbasert) er en rask og økonomisk metode for å produsere vaksineantigener og terapeutiske proteiner. Vi forenklet prosedyre og forbedret mål akkumulering ved å optimalisere forholdene for bakterier dyrking, valg av vertsarter, og co-introdusere RNA silencing dempere.

Abstract

Agrobacterium-formidlet transient proteinproduksjon i planter er en lovende metode for å produsere vaksineantigener og terapeutiske proteiner i løpet av en kort tidsperiode. Imidlertid er denne teknologien bare så vidt begynt å bli brukt til storskala produksjon så mange teknologiske hindringer for å skalere opp nå blir overvunnet. Her viser vi en enkel og reproduserbar metode for industriell skala forbigående proteinproduksjon basert på vakuum infiltrasjon av Nicotiana planter med Agrobacteria bærer lanseringen vektorer. Optimalisering av Agrobacterium dyrking i AB medium tillater direkte fortynning av bakteriekultur i Milli-Q vann, forenkle infiltrasjon prosessen. Blant tre testede arter av Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) ble valgt som den mest lovende vert på grunn av den enkle infiltrasjon, høyt nivå av reporter proteinproduksjon, og om to-fold høyere biomasseproduksjon under kontrollerte miljøforhold. Induksjon av Agrobacterium husing pBID4-GFP (Tobakk mosaikk virus-baserte) bruker kjemikalier som acetosyringone og monosakkarid hadde ingen effekt på protein produksjonsnivå. Infiltrere anlegg under 50 til 100 mbar til 30 eller 60 sek resulterte i omtrent 95% infiltrasjon av plante blad vev. Infiltrasjon med Agrobacterium laboratoriestammen GV3101 viste det høyeste proteinproduksjon i forhold til Agrobacteria laboratoriestammer LBA4404 og C58C1 og villtype Agrobacteria stammer AT6, at10, at77 og A4. Co-uttrykk for en viral RNA stanse demper, p23 eller p19, i N. benthamiana resulterte i tidligere akkumulering og økt produksjon (15-25%) av målprotein (influensavirus hemaglutinin).

Introduction

Planter er nå anerkjent som en sikker, pålitelig, skalerbar og rimelig plattform for å produsere heterologe rekombinante Biopharmaceuticals og industri proteiner 1-3 og har viktige fordeler fremfor mikrobielle og dyrecelle ekspresjonssystemer fire. Planter er i stand til å uttrykke riktig foldet proteiner med posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert sammensatte multimere antistoffer 5-7. Flere plante-avledet rekombinante farmasøytiske proteiner er under klinisk evaluering åtte. Disse inkluderer pasientspesifikke rekombinante idiotypiske vaksiner (scFv) for behandling av non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin-baserte pandemi-og sesonginfluensavaksinekandidater 10,11 (Cummings et al., Sendt til vaksine), anti-Streptococcus overflateantigen jeg / II-antistoff for behandling av dental caries 12, og human insulin for behandling av diabetes 13. Videre menneskelig Recombinant glucocerebrosidase for enzymerstatningsterapi hos pasienter med Gauchers sykdom har blitt godkjent i Israel og USA, og er gitt under det utvidete tilgangsprogrammet utenfor USA 14,15.

Heterologe proteiner kan produseres i stabilt transformerte (transgen eller transplastomic) eller transient transformerte planter. Transient protein produksjon tilbyr flere fordeler i forhold til produksjonen av transgene planter, herunder kort tidsrom for å oppnå ekspresjon og akkumulering 16, og kan oppnås ved å innføre bakterielle binære vektorer eller rekombinant plante-virale vektorer inn i plantevev 4. Den mest avanserte gående uttrykk system er basert på bruk av 'lansering vektorer' som kombinerer komponenter av plante virus og binære plasmider, og er levert av agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration av en lansering vektor basert på tobakk mosaikk virus (TMV) har blitt brukt på labskala for å produsere vaksineantigener mot patogener slik som human papilloma virus 19, Yersinia pestis 20, influensa A-virus 21,22, Bacillus anthracis 23, og koppevirus 24 i N. benthamiana blader. Agrobacterium-mediert gående uttrykk er også en lovende metode for samtidig produksjon av flere proteiner 2,25-27. For eksempel har anlegg transiente ekspresjonssystemer blitt brukt til å produsere tumor-spesifikke rekombinante antistoffer 28,29, et glykosylert rekombinant antistoff mot epidermal vekstfaktor-reseptor-30, og et monoklonalt antistoff som er spesifikt for anthrax beskyttende antigen 31,32. Co-infiltrasjon av Nicotiana benthamiana planter med et mål gen og en suppressor av genet stanse resulterer i forbedret målprotein uttrykk 33,34.

Agroinfiltration er en vanlig metode for jevnt innførtdistanse bakterier som inneholder et gen av interesse inn i plantevev 35-37. Vacuum infiltrasjon av Agrobacterium for forbigående genuttrykk i intakt plante blader er en rask, skalerbar, og nyttig metode for produksjon av fremmede proteiner uten å måtte generere transgene planter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, er planter snudd opp ned og antenne deler nedsenket i Agrobacterium suspensjon. Vakuum brukes deretter forårsaker gasser å evakuere fra blad mellomrom mellom gjennom stomata. Rapid gjentrykksetting etter frigjøring av vakuum resulterer i tilførsel av Agrobacterium suspensjonen inn i bladet. Etter vakuum infiltrasjon av Agrobacteria, er plantene dyrkes videre og målet uttrykk overvåkes. De høyeste nivåene av målet uttrykk er vanligvis observert 2-3 dager etter infiltrasjon (dpi) med en binær vektor og 4-7 dpi med en lansering vektor, hvoretter uttrykket nivået vanligvis avtarSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens er den mest brukte kjøretøy for å levere et gen av interesse til en plante for proteinproduksjon. Agroinfiltration fungerer usedvanlig godt i N. benthamiana men relativt dårlig i de fleste andre planter, blant annet Arabidopsis thaliana 46.

I denne studien, har vi utviklet en enkel, effektiv og økonomisk metode for forbigående proteinproduksjon i 5-6 uker gamle N. benthamiana hjelp A. tumefaciens infiltrasjon. Den store ulempen med industriell skalering av agroinfiltration teknikk er sentrifugering av høstet bakterier og resuspensjon av den bakterielle pellet i et medium inneholdende 4'-hydroksy-3 ', 5'-dimetoksyacetofenon (acetosyringone), monosakkarider, og 2 - (N-morfolino) -etansulfonsyre (MES) buffer for induksjon av de vir gener. Vi har vært i stand til å overvinne disse problemene ved å optimalisere Agrobacterium N. benthamiana og N. excelsior, samt i hybrid N. excelsiana.

Protocol

En. Plant Økende

For påfølgende agroinfiltration vi evaluert to villtype Nicotiana arter (N. benthamiana og N. excelsior) og en hybrid (N. excelsiana) vokst hydroponically på Rockwool i innendørs anlegg.

  1. Sug steinullfibre plater i et anlegg gjødsel-løsning.
  2. Så frø av villtype N. benthamiana, N. excelsior og N. excelsiana (hybrid av N. benthamiana × N. excelsior) på næringsstoffer gjennomvåt Rockwool overflaten.
  3. Dyrke planter fra frø under kontrollerte forhold (24 ° C og 40-65% relativ luftfuktighet) og en lang dag daglengde (14 timers lys og 10 timer mørke, med belysning av 130-150 μE m -2 sek -1) for 4-5 uker for N. benthamiana og N. excelsiana, og 5-6 uker for N. excelsior.

2. Bygging av vektorer for Agroinfiltration

  1. Sett inn en syntetisk reporter genet (grønt fluorescerende protein [GFP]), full-lengde hemagglutinin (HA) fra A/California/04/2009 stamme av influensavirus (HAC1), og re-konstruert lichenase enzym (LicKM) 18 hver for seg i lanseringen vektor pBID4 18 (TMV-basert vektor) for å få pBID4-GFP, pBID4-HAC1 og pBID4-LicKM henholdsvis 18,32,41,47.
  2. Introduser 10-50 ng av pBID4 bærer GFP eller HAC1 inn electrocompetent celler av A. tumefaciens belastning GV3101 og LicKM inn electrocompetent celler av A. tumefaciens stammer GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 og A4 med genet MicroPulser electroporator.
  3. Bruk forvandlet Agrobacteria for infiltrasjonsforsøk med mindre annet er angitt.

Tre. Støvsug Infiltrasjon av Agrobacterium inn Nicotiana Planter

  1. Grow A. tumefaciens påkjenningen over natten (O / N) i LB medium, YEB Medium-eller AB-medium supplert med 50 mg / L kanamycin ved 28 ° C med rysting ved 200 til 250 rpm.
  2. Fortynn Agrobacteria i Milli-Q vann til en optisk densitet ved 600 nm (A 600) på 0,5 eller sentrifuge Agrobacterium-celler dyrket i LB-eller YEB eller AB ved 4000 x g i 10 min ved 4 ° C, re-suspendere i induksjonsmedium (1x MS salt, 10 mM MES, 200 mM acetosyringone, 2% sukrose [MMA]) å A 600 på 0,5, og omrør ved romtemperatur i 1-3 time, med mindre noe annet er angitt.
  3. Infiltrere planter i et vakuumkammer ved å senke Nicotiana plante antenne vev i Agrobacterium suspensjon og bruke en 50-400 mbar vakuum for 30 eller 60 sek. Den optimale infiltrering blir rutinemessig anvendt ved 50 til 100 mbar i 60 sek.
  4. Når vakuumet brytes, fjernes planter fra vakuumkammeret, skylles i vann, og vokse i 5-7 dager under de samme vekstbetingelser som benyttes for å pre-infiltrasjon vekst.
  5. For å teste effektenav kjemikalier som induserer Agrobacterium vir-genet, forskjellige konsentrasjoner av acetosyringone (0, 100, 200 eller 400 pM) ble tilsatt til Agrobacteria suspendert i infiltrasjons buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glukose). For virkningen av monosakkarid på induksjon av vir-genet, forskjellige prosenter av glukose (0, 1, 2 eller 4%) ble tilsatt til Agrobacteria suspendert i infiltrasjons buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 mM acetosyringone). N. benthamiana planter ble infiltrert som nevnt ovenfor i trinn 3.3 og 3.4).
  6. Agrobacterium laboratoriestammer GV3101, C58C1 og LBA4404 og villtype stammer A4, At06, AT10, og At77 husing den pBID4-LicKM vektor ble fortynnet i Milli-Q vann til A 600 på 0,5 N.. benthamiana planter ble infiltrert med hverandre bestemte belastninger som er nevnt ovenfor i trinn 3.3 og 3.4.

4. Co-agroinfiltration Prosedyre for Viral Slå av lyd lyddemper

  1. Mix de Milli-Q vann-utvannet Agrobacterium GV3101 kulturer bærer GFP genet og viral stanse suppressor p19 av Tomato buskete stunt virus (TBSV) på 1:01, 2:01, 3:01 og 4:01 forholdstall. Infiltrere N. benthamiana planter som er beskrevet ovenfor.
  2. Infiltrere N. benthamiana planter med en blanding av to Milli-Q-vann-fortynnet Agrobacterium GV3101 kulturer: den første bærer pBID4-HAC1 plasmid og den andre bærer en av de Silencing suppressors - p19 av TBSV eller p23 av Citrus Tristeza virus, i pCassp plasmid ( pCassp19) og i PGR binært plasmid under 35S promoter (PgR-P23), henholdsvis i forholdet 4:1.

5. Western Blot analyse

  1. Samle tilfeldige blad prøver fra N. benthamiana, N. excelsior eller N. excelsiana anleggene på 4-7 ppt og pulverisere i flytende nitrogen til et fint pulver.
  2. Legg tre bindene av 1x PBS buffer som inneholder 0,5% TritonX-100 til hver prøve.
  3. Rist de utpakkede prøvene for 15 min ved 4 ° C.
  4. Spinn ekstrakt i 5 min, og samle totalt oppløselig protein inn i en ren Eppendorf-rør.
  5. Fortynn ekstraktene til en passende fortynning (1:50 1:100) i 1 x PBS ekstraksjon buffer, og tilsett 5 x prøvebuffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% bromfenolblått og 50% glycerol v / v, og 500 mM DTT) til en endelig konsentrasjon 1 x.
  6. Kok prøver for 5 min.
  7. Separate proteiner ved 10% SDS-PAGE, overføre til Immobilon-P overføring membran, og blokkere med 0,5% I-blokk.
  8. Detect GFP bruker kanin polyklonale anti-GFP antiserum på 1:5,000 og HAC1 bruker mus anti-poly-histidin monoklonalt antistoff på 1:1.000 i blokkering løsning for en hr.
  9. Etter primær antistoffmerking, vaskes membranene tre ganger i 10 minutter hver med 1 x PBST-20 og inkuberes med et pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert anti-kanin-antistoff på 1:5,000 eller HRP-konjugatd anti-mus-antistoff til 1:10.000 i 1 time, for GFP og HAC1 påvisning hhv.
  10. Behandle vestlige blotter bruker SuperSignal West Pico Chemiluminescent underlaget.
  11. Bruk GeneTools Programvare å analysere bandet intensiteten av protein og få bandet kalibrert kvantitet.

Proteinproduksjon: (Kalibrert kvantum x fortynning av prøven) / mengden av prøve ladet) x 4 = mg / kg.
Formel: protein produksjon (P), kalibrert mengde (C), fortynning av prøven (D), og mengden av prøve lagt i (S).

6. Zymogram Assay

  1. Samle pBID4-LicKM-infiltrert N. benthamiana tilfeldig vevsprøver.
  2. Ekstraher proteiner ved hjelp av de samme metoder som er beskrevet ovenfor for Western blot-analyse, og deretter analysere med 10% SDS-PAGE med 0,1% lichenan inkludert i gelene.
  3. Etter elektroforese, vaske gelene to ganger i 10 minutter hver i vaskebuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] og 0,1% Triton X-100), Og deretter inkuberes i vaskebuffer ved 65 ° C i 1 time.
  4. Etter inkubasjon forkaste vaskebuffer og beis gelene med 0,5% Congo Red i 5 min ved romtemperatur.
  5. Skyll gels i Milli-Q vann tre ganger i 10 min hver, og tilsett 1 M NaCl å visualisere lichenase aktivitet. Den rensede bakterielle lichenase protein ble anvendt som en positiv kontroll for enzymaktivitet.

7. GFP Imaging

  1. Utfør visuell påvisning av GFP fluorescens i hele forbigående forvandlet planter ved hjelp av en håndholdt lang bølgelengde UV lampe.
  2. Foto forbigående forvandlet planter med et digitalt kamera gjennom en gul 8, ES 52 filter (eksponeringstid, 15 sek).
  3. Få bilder fra Western blot analyser ved hjelp av GeneSnap programvaren på en GeneGnome og kvantifisere resultatene ved hjelp av GeneTools programvare, med en kalibreringskurve basert på renset GFP standard.
  4. Kvantifisere HAC1 protein ved hjelp av en kalibreringskurve basert på renseteknologied HAC protein standard fra A/Indonesia/05/05 stamme av influensavirus.
  5. Beregn middelverdier 3-4 gjentak for alle eksperimenter.

Representative Results

Næringskrav for plantevekst. Bruken av hydroponisk plantevekstmedium (Rockwool) og nærings-løsning sikrer ensartethet av N. benthamiana vekst og eliminerer kompleksiteten (mekanisk, regulatoriske og effektivitet) forbundet med å bruke jord for plantedyrking. Vi vokste N. benthamiana på rockwool plater dynket i kommersielt tilgjengelige gjødsel for å bestemme optimale forhold for plantevekst og biomasse opphopning. Vi observerte 95-100% frø spiring. Man bør merke seg at blant annet fosfor er avgjørende for å oppnå spiring, fordi vi fant ut at næringsstoff løsning mangler fosfor klarte å støtte spiring og vekst av N. benthamiana frø (Figur 1a).

Effekter av Agrobacterium vekst og infiltrasjon media på plantehelse og proteinproduksjon. Vi har testet flere medie vilkår for å optimalisere effektiviteten av than agroinfiltration teknikk for storskala produksjon. Bakterier (A. tumefaciens GV3101 belastning) skjuler den pBID4-GFP konstruere ble dyrket O / N i ulike medieforhold (YEB, LB eller AB), og enten sentrifugeres og re-suspendert i induksjon medium (MMA) (som inneholder ett × Murashige & Skoog [MS] Basal Salt Blanding, 10 mM MES pH 5,6, 20 g / L sukrose og 200 mikrometer acetosyringone) eller fortynnet i Milli-Q vann til A 600 på 0,5 før du bruker for anleggs infiltrasjon. Vi har observert at vakuum infiltrasjon av planter med bakterier i vannløsning resulterte i proteinproduksjon sammenlignes med de som oppnås med en hvilken som helst infiltrasjon medier i tidligere rapporter 42,48. I kontrast, infiltrasjon med ufortynnet Agrobacteria vokst i YEB eller LB media resulterte i fullstendig visner av N. benthamiana blader i mindre enn 24 timer innlegg infiltrasjon, mens ufortynnet Agrobacteria dyrket i AB medium hadde ingen effekt på helsen til infiltrert planter (daten ikke vist). Som illustrert på figur 1B, planter infiltrert med Agrobacterium kulturer dyrket i LB YEB, eller AB-Reklame og fortynnet med Milli-Q vann (01:05, A 600 av 0,6 til 0,8 eller 01:10, A 600 av 0,3-0,4) viste ingen symptomer, og oppviste en gjennomsnittlig GFP produksjon av 1645, 1520 og 1839, respektivt. Agrobacteria sentrifugert og re-suspendert i induksjonsmedium (MMA) viste ingen symptomer og ingen signifikant forskjell i proteinproduksjon i forhold til Agrobacteria direkte fortynnet i Milli-Q vann ( 1671 ± 102 og 1667 ± 131 mg / kg, henholdsvis). Derfor anbefales Milli-Q vann for å fortynne Agrobacterium kulturer for plante infiltrasjon og ble rutinemessig brukt i våre påfølgende eksperimenter for å oppnå en A-600 på 0,5.

Effekter av Agrobacterium suspensjon celletetthet og tid selvfølgelig på mål uttrykk. Vi neste undersøkt om bakterienes celletetthetenpåvirker effektiviteten av infiltrasjon og nivåer av target uttrykk. For dette formålet, vurderte vi fire forskjellige cellesuspensjonstettheter av Agrobacterium bærer pBID4-GFP, A 600 på 1,0, 0,5, 0,1 og 0,05. Etter infiltrasjon, N. benthamiana planter ble overvåket for synlig symptom utvikling og tid løpet av målet uttrykk ved å samle inn prøver på 4, 7 og 10 dpi. På fire dpi, observerte vi merkbare forskjeller i GFP fluorescens blant planter infiltrert med forskjellige cellesuspensjon tettheter av Agrobacterium (ingen GFP uttrykk ble observert på A 600 på 0,05). På syv dpi, GFP fluorescens var lik i planter infiltrert på celle suspensjon tettheter av A 600 1.0, 0.5 og 0.1, men var lavere i planter infiltrert i en A 600 på 0,05. Som vist på figur 1C, ble disse data bekreftet ved Western blot analyser av prøver tatt ved 4 ppt, viser meget lavt proteinproduksjon ved A 600 600 av 1,0 (1,739 mg / kg). På syv dpi, planter viste ingen signifikante forskjeller i anslått GFP produksjon på A 600 på 1,0, 0,5 og 0,1 (1662, 1870 og 1890, henholdsvis), mens A 600 på 0,05 viste lavere GFP produksjon (1199 mg / kg). I motsetning til dette ble det ved 10 oppløsning observert noen forskjeller i GFP produksjonen hos planter infiltrert med en av de fire cellesuspensjonstettheter (1218, 1181, 1197 og 1304).

Infiltrasjon med alternative stammer av Agrobacterium. For å øke mangfoldet av Agrobacterium stammer tilgjengelig for forbigående proteinproduksjon, testet vi vill-type isolater. Disse stammer, isolert fra kronen-gnagsår av naturlige verter, var vennlig levert av Dr. Gelvin (Purdue University, West Lafayette, Indiana). For å undersøke sin nytte i forbigående proteinproduksjon, infiltrert vi N. benthamiana med følgende stammer Carrying pBID4-LicKM 18: A. rhizogenes (A4) og A. tumefaciens vill-type-stammer Nester A348, A208 og A281 (kalt AT6, AT10 og At77, henholdsvis), samt konstruerte laboratoriestammer av A. tumefaciens GV3101, C58C1, og LBA4404. De infiltrerte Bladene ble oppsamlet ved 7 dpi og nivået av LicKM ekspresjon ble estimert ved Western blot-analyse. Som vist i figur 2A, det høyeste nivå av LicKM produksjonen kan oppnås med stammer GV3101, A4 og LBA4404 (~ 1750 ± 163 1650 ± 26 og 1450 ± 117 mg / kg, henholdsvis), med små forskjeller; det laveste nivået av ekspresjon (~ 900 ± 102 mg / kg) med C58C1; og mellomliggende produksjon med AT6, AT10 og At77 (~ 1250 ± 19 1100 ± 42 og 1200 ± 111 mg / kg, henholdsvis). Den lichenase enzymatisk aktivitet ble demonstrert ved hjelp Zymogram analysen. Figur 2B viser at lichenase produsert i infiltrert plantemateriale ved hjelp av noen av deAgrobacterium påkjenningen var enzymatisk aktive. Man bør også merke seg at N. benthamiana planter infiltrert med A4 og At77 stammer viste patologiske symptomer (stunting, petiole tøyelighet og curling, og blad curling), mens med AT10 belastning symptomene var milde. Ingen symptomer ble observert i N. benthamiana planter infiltrert med laboratoriestammen GV3101 (figur 2C).

Infiltrasjon av alternative Nicotiana arter. Vi sammenlignet med tallene for biomasseproduksjon og proteinproduksjon i to villtype arter av slekten Nicotiana (N. benthamiana og N. Excelsior), og i et hybrid arter, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Av de testede arter, N. benthamiana, en mye brukt vertskap for transient proteinproduksjon ved hjelp av Agrobacterium-baserte eller virusbaserte ekspresjonssystemer 2,34,49, når infiltrasjon beredskap innen 4-5 uker etter spiring. Den nødvendige vekstperiode for å generere den optimale grad av biomasse også er 4-5 uker for N. excelsiana men er lengre (6-7 uker) for N. excelsior. I tillegg er de plante internodes er forholdsvis korte for N. Excelsior sammenlignet med andre Nicotiana arter.

Videre observerte vi at vakuum infiltrasjon av N. benthamiana og N. excelsiana på 50-250 mbar for 60 sek er svært effektiv for agroinfiltration av hele blader, mens N. Excelsior er vanskelig å infiltrere på grunn av deres nedre baldakin og læraktige blader, selv om et vakuum ble påført tre ganger i 1 min hver i nærvær av ikke-ioniske overflateaktive midler slik som Sillwet-77 eller S240. Også spiring frekvensen av N. excelsiana og N. Excelsior frø var ~ 40-50%; for å øke spirefrekvensen til 90 til 100%, må frøene behandles med 10% Blealm for en time før såing. Under de samme vekstvilkår, det høyeste blad biomasse som kan genereres fra N. excelsiana er omtrent to ganger høyere sammenlignet med N. benthamiana (Tabell 1).

Proteinproduksjon ble undersøkt i N. benthamiana, N. excelsior og N. excelsiana infiltrert med Agrobacterium stamme GV3101 husing pBID4-GFP. GFP akkumulering ble vurdert til 7 dpi i hele infiltrert blader ved hjelp av UV-lys etterfulgt av Western blot analyse. Figur 3A viser jevn fordeling av GFP i N. benthamiana og N. excelsiana og ujevn fordeling i N. excelsior (på grunn av vanskeligheter med å infiltrere et helt blad område av N. excelsior). Figur 3B viser nivået av GFP produksjon anslått av UV lys belysning i infiltrert bladene samlet fra de tre Nicotiana arter på 7 dpi. GFP akkumulertesjonsnivået var høyere i N. benthamiana (~ 2,23 g / kg) enn i N. excelsiana og N. Excelsior (~ 1,89 og 1,54 g / kg, henholdsvis). Det lave nivået av proteinproduksjonen i N. excelsior skyldes ujevn infiltrasjon og distribusjon av akkumulert GFP i samlet blad.

Vi observerte at øvre bladene direkte eksponert for lys ofte viser de tidligste og høyeste nivåene av forbigående GFP akkumulering (2-4 dpi) enn bladene under kalesjen. Men i våre studier, var GFP akkumulering den høyeste på syv dpi og ble jevnt fordelt over de fleste bladene, bortsett fra i uninfiltrated nylig voksende blader som ikke viser GFP akkumulering.

Effekter av vakuum trykk og varighet på forbigående proteinproduksjon. Vacuum infiltrasjon signifikant øker forbigående uttrykk nivåer sammenligne med trykket for hånd injeksjon med en nålløs sprøyte 42. Anvendelsen av envakuum forårsaker gasser å evakuere fra neddykket plante blader gjennom stomata. Når vakuumet brutt, og trykket øker hurtig, er suspensjonen av Agrobacterium drevet inn i bladene for å erstatte de evakuerte gasser 50.

For å teste virkningen av vakuumtrykk på bladene av N. benthamiana, vi infiltrert planter med Agrobacterium stamme GV3101 husing pBID4-GFP under ulike vakuumtrykk (50-400 mbar) for 30 eller 60 sek. Det ble demonstrert at jo sterkere vakuum (under 50 mbar) søkt om 30 eller 60 sek resultater i mekanisk skade av infiltrert blader, som fører til vev Wilting og plante død kort tid etter infiltrasjon (24-48 timer). På den annen side er anvendelsen av mildere vakuum (400 mbar) ende infiltrering av kun 50% av bladarealet og en redusert grad av GFP produksjon (303 ± 90 mg / kg) (figur 4A). Viktigere, observerte vi ingen forskjeller i GFP produksjon under 50, 100 og 200 mbar (1651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 mg / kg, henholdsvis) (Figur 4A) og mild til ingen, skadelige virkninger på plantehelse når vakuum press 50-200 mbar ble søkt om 30 eller 60 sek. Derfor er 50-100 mbar av vakuum trykk anbefales for infiltrasjonsforsøk.

Effekten av varigheten av vakuum på målet ekspresjon ble undersøkt ved å infiltrere en flate av N. benthamiana planter hver time med en A 600 på 0,5 av GV3101 huse pBID4 -. GFP for 8 timers i samme Agrobacterium kultur Figur 4B viser at nivået av GFP produksjonen var lik på all-time peker opp til 8 timers, noe som tyder på at over dette tidsperiode i Agrobacterium opprettholder sin evne til å sette i gang en enkelt-trådet DNA.

Effekt av kjemisk induksjon på proteinproduksjon. Visse plante fenoliske metabolitter og sukker kan indUCE virulens gener av A. tumefaciens 1,52. Som en konsekvens av dette, har mange kjemikalier og monosaccharaides blitt rapportert å forbedre transient proteinproduksjon i forskjellige plantearter. Acetosyringone er oftest lagt til kulturer av A. tumefaciens å indusere vir operon før agroinfiltration 40,53-57.

Vi har vurdert effekten av forskjellige konsentrasjoner av acetosyringone (0, 100, 200 og 400 uM) og glukose (0-4%) i transient GFP proteinproduksjon i N. benthamiana infiltrert med Agrobacterium stamme GV3101 husing pBID4 - GFP. For dette formål vi re-suspendert Agrobacterium-celler i MMA induksjons medier som inneholder forskjellig konsentrasjon av acetosyringone og glukose for 1-3 timer før infiltrasjon. I henhold til resultatene av både visuell observasjon (data ikke vist) og Western blot-analyse (figur 4C), er ingen av de testede konsentrasjonav disse forbindelsene induserte en signifikant økning i fluorescens GFP eller protein produksjon sammenlignet med kontroll, hvor induksjonsmedier inneholdt ingen acetosyringone eller glukose.

Effekt av co-infiltrasjon av en knebling suppressor på forbigående produksjon av GFP og HAC1 gener i N. benthamiana blader. Det har tidligere blitt vist at samtidig uttrykk for en knebling suppressor (p19 av Tomato buskete stunt virus [TBSV]) griper inn med post-transcriptional gene silencing (PTGs), noe som resulterer i økt produksjon av reporter proteiner 34.

Vi har evaluert effekten av co-infiltrasjon av N. benthamiana med lanseringen vektor bærer GFP reporter genet (pBID4-GFP) og P19. Før infiltrasjon, à 600 av 0,5 fortynninger av A. tumefaciens GV3101 kulturer skjuler pBID4-GFP og p19 ble henholdsvis blandet i forhold på 1:01, 2:01, 3:01 og 4:01. Expression av stanse suppressor ble kontrollert av blomkål mosaikkvirus 35S promoter. Som det fremgår av resultatene av Western blot-analyse ved 7 ppt (figur 5A), ble forekomsten av p19 ikke øke eller redusere produksjonen i GFP N. benthamiana, når som forholdet mellom de to Agrobacterium suspensjoner.

Vi har også sammenlignet effekten av to virale genet stanse dempere - p23and P19 - på forebygging av PTGs for HAC1. Kulturer av Agrobacterium bærer lanserings vektor pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) og en av de to virus Silencing suppressor plasmider ble fortynnet til en 600 på 0,5, blandes i et forhold på 4:01, henholdsvis, og co-infiltrert i 4-5 uker gamle, N. benthamiana. En suspensjon av A. tumefaciens bærer pBID4 - HAC1 alene ble infiltrert som en kontroll. De infiltrert blad prøver ble samlet inn 3-8 dpi. Eksperimentet var Repererte tre ganger og gjennomsnittlige nivåer av HAC1 uttrykk bestemmes av Western blot analyse.

Som vist i figur 5B, co-infiltrasjon av N. benthamiana med p23-eller p19 resulterte i (642 ± 157 og 764 ± 108 mg / kg, henholdsvis) en økning i HAC1 produksjon sammenlignet med uten anvendelse av stanse suppressor (ca. 15 til 25%, respektivt) ved 6 dpi. Dette tyder på at p23 og p19 er effektive i vårt system. Imidlertid bør det bemerkes at akkumulering av HAC1 oppstått en dag tidligere når pBID4-HAC1 ble co-infiltrert med p19. Derfor våre resultater viser at virkningen av den stanse suppressor p19 på HAC1 og GFP akkumulering er forskjellige, noe som tyder på selektiv forsterkning av transient ekspresjon og / eller stabiliteten av noen proteiner i N. benthamiana.

Vi har også observert at både i nærvær og i fravær av en stanse suppressor nivået av HAC1 protein production startet fallende på 7 dpi. Dette indikerer at tidspunktet for nedgangen i den forbigående proteinproduksjon i N. benthamiana infiltrert med lanseringen vektor er målet spesifikke.

Cellen bank av Agrobacterium husing lanseringen vektor ble evaluert hvert år for målgen stabilitet, Agrobacterium levedyktighet og nivået av protein akkumulering. Den glycerol lager av cellebank av GV3101 stamme transformert med pBID4-HAC1 som ble lagret ved -80 ° C har vist seg å være meget stabil i mer enn tre år uten endring av nivået av transient proteinproduksjon i infiltrert N. benthamiana planter. figur 5C viser at HAC1 protein produksjon anslått av Western blotting i årene 2010, 2011, 2012 og 2013 var 670, 685, 566 og 683 mg / kg, henholdsvis. Den gjennomsnittlige HAC1 produksjon i N. benthamiana planter var 651 ± 49,4 mg / kg.


Tabell 1. Sammenligning av N. benthamiana og N. excelsiana plante biomasseproduksjon.

Figur 1
Figur 1. Western blot analyse av forbigående genuttrykk i N. benthamiana. (A) Seks uker gamle N. benthamiana 1) planter som vokser i en gjødsel-løsning inneholdende 4,8% fosfor og 2) planter som vokser i en gjødsel-løsning inneholdende 0% fosfor. Tjuefem mikrogram av fersk blad vekt tilsvarende ble lastet per kjørefelt. (B) Sammenligning av GFP produksjon i planter vakuum infiltrert med pBID4-GFP-husing Agrobacterium GV3101 kulturer dyrket i tre forskjellige medier: YEB, AB og LB. GV3101 kulturer vokst O / N i YEB eller LB media ble sentrifugert ved lav hastighet og re-suspendert i induksjon medium (MMA) (baner: MMA-en og MMA-2, henholdsvis), eller vokst O / N i YEB, LB eller AB media og direkte fortynnet til 1:05 eller 1:10 med Milli-Q vann (baner: YEB / 5 og YEB/10; AB / 5 og AB/10; LB / 5 og LB/10) (C) sammenligning. av GFP uttrykk på 4, 7 og 10 dpi følgende vakuum infiltrasjon med ulike konsentrasjoner (A 600 på 1,0, 0,5, 0,1 og 0,05) av A. tumefaciens GV3101 belastning bærer pBID4-GFP.

Fig. 2
Figur 2. Sammenligning av forbigående lichenase produksjon og aktivitet etter vakuum infiltrasjon av N. benthamiana planter med diffeleie stammer av Agrobacteria. Kulturer av Agrobacteria stammer (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, at10 og LBA4404) skjuler lanseringen vektor pBID4-LicKM ble infiltrert individuelt inn blader av N. benthamiana. Infiltrert blader ble samlet på 7 dpi. (A) Lichenase produksjon kvantifisert ved Western blotting. (B) Zymogram analysen viser lichenase produksjon gjennom enzymatisk aktivitet. (C) Effekt av Agrobacterium (villtype A4, AT10, At77 og laboratoriestammen GV3101) infiltrasjon på N. benthamiana plantehelse på 7 dpi. Tjue fem mikrogram av fersk blad vekt tilsvarende ble lastet per kjørefelt.

Figur 3
Figur 3. Transient GFP uttrykk i blader av N. benthamiana, N. excelsiana og N. excelsior på 7 dpi etter vakuum infiltrasjon med A. tumefaciens husing lanseringen vektor pBID4 - GFP. (A) Visuell undersøkelse av GFP uttrykk under UV lys. (B) Western blot analyse av GFP opphopning.

Figur 4
Figur 4 (A) Effekter av vakuum press på forbigående GFP uttrykk og plantehelse.. N. benthamiana planter ble infiltrert med pBID4 -. GFP under vakuum presset av 400, 200, 100 eller 50 mbar, ved vakuum holdetid på 30 eller 60 sek (B) Stabilitet og smittsomhet av A. tumefaciens i N. benthamiana infiltrert med Agrobacterium GV3101 husing pBID4-GFP vokst i AB medium og fortynnet til en A 600 på 0,5. Agroinfiltration ble utført ved å infiltrere en flat av N. benthamiana planter hver time i den samme utvannet Agrobacterium kultur (baner 0-8). (C) Effekt av ulike konsentrasjoner av acetosyringone og glukose på gående uttrykk av GFP. Den Agrobacterium belastningen GV3101 husing pBID4 - GFP ble dyrket O / N i YEB media, sentrifugert og resuspendert i en A 600 0,5 enten i MMA inneholdende 2% glucose med acetosyringone på 0, 100, 200 eller 400 pM, eller i MMA inneholdende 200 uM acetosyringone med glukose på 0, 1, 2 eller 4%. De Agrobacterium suspensjoner ble holdt i 3 timer ved romtemperatur før infiltrasjon.

Figur 5
Figur 5. Effekter lyddemping dempere på forbigående protein produksjon i N. benthamiana blader. (A) Western blot analyse av GFP protein etter samtidig infiltrasjon av pBID4-GFP og p19 på forskjellige forhold. Prøver tatt ved 7 dpi (25 ug av frisk bladvekt tilsvar ble lastet per bane). (B) En kultur av Agrobacterium bærer pBID4-HAC1 ble individuelt blandet i et forhold på 4:01 med en kultur som bærer p19-eller p23 stanse suppressor plasmider. De resulterende kombinasjoner av Agrobacterium kulturer ble vakuum infiltrert i planter. Infiltrert vev av HAC1 ble samlet daglig opp til åtte dpi for rekombinant protein kvantifisering. (C) Stabilitet av Agrobacterium cellen bank. Planter ble infiltrert med samme batch av Agrobacterium cellen bank hvert år for å evaluere protein akkumulering. Femti mikrogram av fersk blad vekt tilsvarende ble lastet per kjørefelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av ther figur.

Discussion

I denne studien har vi utviklet en enkel agroinfiltration protokoll for rutinemessig forbigående protein produksjon i utvalgte Nicotiana arter som bruker Agrobacterium stammer bærer lanseringen vektor. I tillegg har vi identifisert de optimale betingelser for å oppnå høyest rekombinant proteinproduksjonsnivået i vårt transient plante ekspresjonssystem.

Vacuum infiltrasjon av fortynnet A. tumefaciens belastning GV3101 husing lanseringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana og N. excelsior resulterte i høyere nivåer av mål protein produksjon innen 7 dpi i forhold til andre plantearter, som for eksempel Pisum sativum infiltrert med GV3101 husing Alfalfa mosaikk virus - eller agurk mosaikkvirusbaserte vektorer som uttrykker GFP reporter genet under 35S promoter 41, eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum og Arabidopsis thaliana infiltrert med C58C1 stamme av A. tumefaciens som bærer beta-glucuronidase reporter gen 57.. N. benthamiana og N. excelsiana var lett å støvsuge infiltrere på 50 mbar for 30-60 sek, med 90-95% infiltrasjon effektivitet. De resterende 5-10% av bladarealet ble ikke infiltrert på grunn av noen flytende av blader på overflaten av Agrobacterium suspensjonen under anvendelse av vakuum. Siden lanseringen vektor har muligheten for celle-til-celle bevegelse 18, oppstår forbigående akkumulering av proteiner i hele blader samt petioles på 7 dpi. På 10 ppt, beregnet GFP produksjonen var noe lavere fordi pBID4 ekspresjonsvektor er i stand til å bevege seg fra celle til celle, men ikke til å bevege seg systemisk 18; derfor trenger nylig dyrkede bladene ikke inneholder vektoren, og bidrar ikke til fremstilling av målet. I tillegg nedbrytning av det rekombinante protein over tid may bidra til redusert protein nivå på 10 dpi. Våre resultater viste at infiltrasjon av A. tumefaciens belastning GV3101 medierte høye nivåer av forbigående protein produksjon i N. benthamiana. Videre kan målprotein være konstruert som N-terminale, C-terminale eller interne fusjoner til lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanase, som er et termostabilt enzym fra Clostridium thermocellum og confers termostabilitet for mange target protein fusion 18. Infiltrasjon av N. benthamiana med A. tumefaciens villtype stammer (AT6, at10 og at77) skjuler genet av interesse fremkalte milde eller alvorlige symptomer: blad curling, bladstilken tøyelighet, og curling. Ingen patologiske symptomer ble observert i N. benthamiana infiltrert med laboratoriestammen GV3101 husing tom pBID4 vektor, mens noen gener settes inn pBID4 og forvandlet til laboratoriestammer GV3101, C58C1 eller LBA4404 fremkalte mild nekrotiske svar og bladchlorosis / gulning symptomer i infiltrert regioner av blader. Nekrotiske symptomer forårsaket av villtype Agrobacterium eller avvæpnet stammer i solanaceous planter har tidligere 56,57 blitt rapportert. Den nekrotiske responsen kan skyldes virulensfaktorer av Type III sekresjon system, bakterielle proteiner overført til planteceller ved type IV sekresjon system, og / eller følsomhet for flagellin 58-60. Vi har funnet at forbigående produksjon av heterologe proteiner, kan også fremkalle patogenitet og en hypersensitiv respons i infiltrert planteblader. Mange forskere rapporterte at agroinfiltration av ulike plantearter med plante binære vektorer produsert opp til 5-20 ganger høyere nivåer av forbigående proteinproduksjon sammenlignet med stabilt transformerte planter 28,57. Våre data viser at N. benthamiana infiltrert med GV3101 husing pBID4-GFP forbigående uttrykt høye nivåer av GFP, som er lik den GFP rapporterte utbytte forN. benthamiana infiltrert med Agrobacteria bærer Pich-GFPSYS viral vektor (opp til 80% av den totale oppløselige protein) 44. Agroinfiltration bruke vår lansering vektor resulterte i høy produksjon av termostabile protein LicKM, 50 ganger høyere enn det som er observert ved hjelp av en standard binær plasmid 18.

For å teste smittsomhet av A. tumefaciens og stabiliteten av lanseringen vektor, infiltrert vi en flat av N. benthamiana hver time for opptil 8 timers bruker samme Milli-Q vann-fortynnet kultur GV3101 huse den pBID4-GFP plasmid. Våre data viste at GV3101 belastningen er effektivt infeksiøs i minst 8 timer og pBID4 (lanseringen vektor) er svært stabil i løpet av åtte timer lange infiltrasjon.

Glyserol lager av GV3101 belastning husing lanseringen vektor pBID4-HAC1 (cellen bank) oppbevares ved -80 ° C har vist seg å være svært stabil i tre år uten endringer i transient protei produksjon i infiltrert planter.

N. benthamiana planter dyrket under optimale forhold og mellom 35 og 42 dager etter såing var optimal for vakuum infiltrasjon-mediert forbigående genuttrykk 40. Yngre planter (3-4 uker gamle) kan ikke bli infiltrert i sin helhet på grunn av blader som flyter på cellesuspensjon overflate og vevsskade fra de mekaniske virkninger av å anvende et vakuum. I planter som er eldre enn 45 dager, N. benthamiana bolting scenen, under optimale lysforhold som brukes, er nivået på gående uttrykk lav.

Lav molekylvekt fenoliske forbindelser (acetosyringone) og monosaccharaides (glukose) er kjent for å indusere vir gener i A. tumefaciens 55,61. Videre, infiltrasjon av N. benthamiana med den binære vektoren pCAMBIA (GFP) i nærvær av acetosyringone ved konsentrasjoner på 50 til 600 uM ble vist å gradvis øke transientgenuttrykk 40. Vi studerte effekten av ulike konsentrasjoner av acetosyringone og glukose i vårt system ved å legge disse forbindelsene til GV3101 kulturer skjuler pBID4-GFP i MMA i 3 timer, og fant ingen forskjell i GFP uttrykk. Interessant, GV3101 kulturer skjuler pBID4-GFP og utvannet i Milli-Q vann til en A 600 på 0,5 og infiltrerte uten vir genet induksjon uttrykt de samme mengder av GFP som de infiltrert med induserte kulturer. Den A. tumefaciens vir-genet (e) kan potensielt bli indusert av plante fenoliske forbindelser (acetosyringone og sinapinic syre) og plante monosaccharaides (glukose og fruktose) til stede i blad vev. Derfor spekulere vi at tilsvarende nivåer av GFP ekspresjon i nærvær eller fravær av eksogene genet vir indusere kan være et resultat av virkningen av cytoplasmatiske vir genet induktorer stede under replikasjonen av GFP-uttrykkende vektor lanserings i planteceller.

N. benthamiana har blitt benyttet som en modell-vert for transient proteinproduksjon 49.. Imidlertid hindrer N. benthamiana er relativt lavt utbytte av biomasse dens anvendelse for stor-skala produksjon av rekombinante proteiner. Den optimale vert bør kombinere en høy grad av transient ekspresjon, lett vekst i et drivhus, og være utsatt for Agrobacterium infiltrasjon 2.. For å velge en alternativ vert, vi infiltrert to forskjellige villtype arter av Nicotiana (N. benthamiana og N. excelsior) og en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens belastning GV3101 husing den pBID4-GFP plasmid. Blant disse tre artene, nivået av GFP uttrykk var noe høyere i N. benthamiana. N. Excelsior planter viste problemer med vakuum agroinfiltration grunn av sine læraktige blader, og N. excelsianaproduserte omtrent to ganger mer biomasse under samme vekstbetingelser. Den forbigående produksjon av GFP på 7 dpi er relativt like i N. benthamiana og N. excelsiana. Derfor, N. excelsiana kan være en mer passende vert for rekombinant proteinproduksjon.

Agrobacterium-mediert forbigående protein produksjonen er begrenset av PTGs 26, som kan overvinnes ved co-uttrykk av genet stanse undertrykkere av plante virus opprinnelse 62 år. Transient proteinproduksjon er tidligere vist å være forbedret 50 ganger i nærvær av p19 proteinet i TBSV, som hemmer PTGs i infiltrert vev 34. I vår studie, vurderte vi effekten av to virus Silencing dempere (P19 og P23) separat co-infiltrert med lanseringen vektor pBID4-HAC1. Den co-infiltrasjon av disse støydempere dempere syntes å ha liten innflytelse på forbigående uttrykk for HAC1, med bare en svak økning i HAC1akkumulering av proteiner (15-25%) i nærvær av co-infiltrerte p23 eller p19. Å positivt påvirke proteinproduksjon, kan støydempere dempere må være spesielt utvalgt for å være effektive for de målrettede plantearter og viral vektor 63. TMV heli har en suppressor av RNA stanse aktiviteten 64,65. Våre data bekrefter denne observasjonen som co-infiltrasjon av p23 eller p19 med pBID4-HAC1 medførte ingen økning i GFP eller en svak økning i den forbigående HAC1 proteinproduksjon.

Som konklusjon, har vi modifiserte og optimaliserte anleggs Agrobacterium vekstbetingelser og forbedret effektiviteten av vakuum infiltrasjon. Denne teknologien gjort oss i stand til å vokse og infiltrere hundrevis av kilo plantemateriale i noen timer. Vi vellykket automatisert anlegget gående uttrykk teknikk for høy gjennomstrømming vaksineproduksjon ved industrivekt under dagens Good Manufacturing Practices (cGMP) vilkår. For mer informasjon about automatisering og utnyttelse av anlegget transient proteinproduksjonssystem for produksjon av rekombinante proteiner, inkludert subenhet vaksinekandidater, under cGMP betingelser, blir lesere referert til nettsiden www.fhcmb.org/ .

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Fraunhofer USA Center for molekylær bioteknologi, IBIO, Inc. og Defense Advanced Research Projects Agency (stipend # HDTRA1-07-C-0054). Forfatterne erkjenner de sjenerøse gaver av legene. Stanton Gelvin of Biological Science Dept., Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammer) og Wayne Fitzmaurice av Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frø), samt Jennifer Nicholson på US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior frø ). Forfatterne takker Margaret Shillingford og Christopher Hull for å gi planter og god teknisk assistanse. Forfatterne har også takke legene. Stephen Streatfield og Natasha Kushnir for redaksjonell bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Tags

Plant Biology Agroinfiltration, Forbigående proteinproduksjon plantebasert uttrykk viral vektor,
Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V.,… More

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter