아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.
식물체에서 아그로 박테 리움 – 매개 변이 단백질 생산을 단시간 내에 백신 항원 및 치료 용 단백질을 생산하는 유망한 접근법이다. 그러나,이 기술은 이제 막 극복되고 수직 확장 대규모 생산 많은 기술적 장애물에 적용되기 시작한다. 여기, 우리는 아그로 박테리아가 시작 벡터를 들고와는 담배 식물의 진공 침투를 기반으로 산업 규모의 과도 단백질 생산을위한 간단하고 재현성있는 방법을 보여줍니다. AB 매체에있는 아그로 박테 리움 재배의 최적화는 침투 과정을 단순화, 밀리 Q 물에있는 세균의 문화를 직접 희석을 할 수 있습니다. 는 담배, N.의 세 가지 시험 종 중 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana는) 때문에 침투의 용이성에 가장 유망한 호스트로 선정되었다, 고 기자 단백질 생산 수준, 약 2-F통제 된 환경 조건에서 오래된 높은 바이오 매스 생산. 아그로 같은 아세토 시린 곤 및 단당류로서 화학 약품을 사용 pBID4-GFP (담배 모자이크 바이러스 계)를 은닉의 유도는 단백질 생산 수준에 영향을 미치지 않았다. 30 일 또는 60 초 동안 50 ~ 100 밀리바에서 침투 식물은 식물 잎 조직의 약 95 % 침투의 결과. 아그로 박테 리움 실험실 변형 GV3101와 침투는 아그로 박테리아 실험실 변종 LBA4404 및 C58C1 및 야생 형 아그로 박테리아가 at77와 A4, AT10, AT6를 균주에 비해 가장 높은 단백질 생산을 보여 주었다. N.에서 바이러스 성 RNA 침묵 억제, P23 또는 P19, 공동 식 benthamiana는 표적 단백질 (인플루엔자 바이러스의 헤 마글 루티 닌) 이전 축적과 생산 증가 (15~25%)였다.
식물은 이제 이종 재조합 바이오 의약품 및 산업용 단백질 1-3의 제조, 안전 신뢰성, 확장 성 및 저렴한 플랫폼으로 인식하고 미생물 및 동물 세포 발현 시스템 4에 중요한 장점을 가지고있다. 식물은 조립 된 다중 체 항체 5-7 등의 번역 후 변형, 제대로 접힌 단백질을 표현 할 수 있습니다. 여러 식물 유래 재조합 의약품 단백질은 임상 평가 8을 겪고있다. 이러한 비호 지킨 림프종 9, 헤 마글 루티 닌 기반 유행성 계절 독감 백신 후보는 10, 11 (커밍스 등., 백신에 제출), 안티 – 연쇄상 구균의 표면 항원 I의 치료를위한 환자 특정 재조합 이디 백신 (scFv를)를 포함 / 치아 우식증 (12)의 치료, 당뇨병 (13)의 치료를위한 인간의 인슐린 II 항체. 또한, 인간의 RECO고셔병 환자에서 효소 대체 요법에 대한 mbinant glucocerebrosidase 이스라엘과 미국에서 승인 된 제품으로, 미국 (14, 15)의 외부로 확장 된 액세스 프로그램에 따라 제공된다.
이종 단백질을 안정적으로 변형 (유전자 변형 또는 Plastid 형질 전환) 또는 일시적으로 형질 전환 식물에서 생산 될 수있다. 과도 단백질 생산은 식 (16) 및 축적을 달성하기 위해 짧은 시간 포함한 형질 전환 식물에서의 생산에 비해 여러 가지 장점을 제공하고, 식물 조직 (4) 내에 세균 이진 벡터 또는 재조합 식물 바이러스 벡터를 도입함으로써 달성 될 수있다. 가장 진보 된 일시적인 발현 시스템은 식물 바이러스 및 이진 플라스미드의 성분을 배합하고, agroinfiltration 17,18 의해 전달되는 '발사 벡터'의 사용에 기초한다. 담배 모자이크 바이러스 (TMV)에 기초하여 발사 벡터의 Agroinfiltration 성공적 실험실에서 적용된이러한 인간 유두종 바이러스 19, 예 르시 니아 페스티 20 병원균에 대한 백신의 항원을 생산하기 위해 확장, 인플루엔자는 21, 22, 탄저균 23 바이러스 및 N.에 천연두 바이러스 (24) benthamiana 잎. 아그로 박테 리움 매개 일시적 발현은 여러 단백질 2,25-27의 동시 생산을위한 유망한 방법이다. 예를 들어, 식물, 일시적인 발현 시스템은 종양 특정 재조합 항체 28,29, 표피 성장 인자 수용체 (30)에 대하여 당화 재조합 항체 및 탄저균 방어 항원에 특이 31,32 모노클로 날 항체를 생산하는 데 사용되었다. 표적 유전자 및 향상된 표적 단백질의 발현 33, 34의 유전자 침묵 결과의 회로 부착 된 담배의 benthamiana 공장의 공동 침투.
Agroinfiltration 균일 introdu을위한 일반적인 방법입니다식물에 관심의 유전자를 숨겨의 cing 박테리아는 35-37를 조직. 그대로 공장에서 일시적인 유전자 발현에 나뭇잎 아그로 박테 리움의 진공 침투 형질 전환 식물 38 ~ 41을 생성 할 필요없이 외래 단백질의 생산을위한 신속한 확장 성, 유용한 방법입니다. 진공 agroinfiltration 동안, 식물이 거꾸로 뒤집 및 공중 부분은 아그로 박테 리움 현탁액에 잠긴. 그런 다음 진공 가스가 기공을 통해 잎의 세포 간 공간에서 철수하는 원인이 적용됩니다. 잎에 아그로 박테 리움 현탁액의 주입에 진공 결과의 신속한 재 가압 다음 릴리스. 아그로 박테리아의 진공 침투에 따라, 식물은 더 이상 재배 및 목표 표현이 모니터링됩니다. 표적 발현의 가장 높은 수준은 전형적으로 2-3 일 이후 발현 수준은 일반적 decrea 발사 벡터와 이진 벡터 및 4-7 dpi로, 함께 침투 (DPI)을 남기 관찰SES 17,18,42-45. 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스는 단백질 생산을위한 식물에 관심 유전자를 전달하기위한 가장 널리 사용되는 수단이다. Agroinfiltration는 N.에 매우 잘 작동합니다 benthamiana하지만 상대적으로 저조한 애기 장대 (46)를 포함하여 대부분의 다른 식물에서.
본 연구에서는 5 ~ 6 주 된 N.에 과도 단백질 생산을위한 간단하고 효율적이며 경제적 인 방법을 개발 benthamiana는 A.를 사용하여 침투를 투메 파시 엔스. agroinfiltration 기술의 산업 스케일링의 주요 단점은 '수확 박테리아 및 4'-히드 록시-3을 함유하는 배지에서 세균 펠릿 재 부유 원심 분리하고, 5'-디메 (아세토 시린 곤), 단당류, 및 2 – (N-모르 폴리 노) – 에탄 설 폰산 (MES) 비르 유전자의 유도를위한 버퍼. 우리는 아그로 박테 리움을 최적화함으로써 이러한 문제를 극복 할 수 있었다 </EM> AB 매체 (최소 배지)의 성장은 직접 밀리 Q 물과 침투 기간 및 조건을 제어하여 희석 하였다. 우리는 또한 야생형 담배 숙주 종 N.에서 목적 단백질의 생산을 비교 한 benthamiana와 N. 입시뿐만 아니라 하이브리드 N.에 excelsiana.
이 연구에서, 우리는 시작 벡터를 운반하는 아그로 박테 리움 균주를 사용하여 선택한 된 담배 종의 일상 과도 단백질 생산을위한 간단한 agroinfiltration 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 우리는 우리의 과도 식물 발현 시스템에서 가장 높은 재조합 단백질 생산 수준을 달성하기 위해 최적의 조건을 확인했다.
희석 A. 진공 침투 N.에 출시 벡터 pBID4를 숨겨 변형 GV3101을 투메 파시 엔스 benthamiana, N. excelsiana 및 N. 엑셀 시어는 알팔파 모자이크 바이러스를 숨겨 GV3101에 침투 피섬 새 티범 다른 식물 종에 비해 7 dpi로 내 표적 단백질 생산의 높은 수준, 결과 – 나 오이 모자이크 35S 프로모터에서 GFP의 리포터 유전자를 발현하는 바이러스 기반의 벡터 41, 또는 락 투카 사티, 까 lycoA.의 C58C1 변형으로 침투 persicum 및 애기 장대 베타 – 글루 쿠로니다 아제 리포터 유전자 57. N.을 들고 튜메 파시 엔스 benthamiana와 N. excelsiana는 90 % -95 %의 침투 효율이 30 ~ 60 초 동안 50 mbar에서 침투 진공 청소기로 청소하기 쉽게했다. 잎 지역의 나머지 10 % 때문에 진공의 응용 프로그램 중 아그로 박테 리움 현탁액의 표면에 잎의 일부 부동의 침투되지 않았습니다. 발사 벡터가 세포 간 이동 18 능력을 가지고 있기 때문에, 과도 단백질의 축적은 7 dpi로에 전체 잎뿐만 아니라 잎자루에서 발생합니다. pBID4 발현 벡터가 셀 사이를 이동시킬 수 있지만, 체계적 18 움직이지 때문에 10 dpi로에서 잡은 GFP 생산은 다소 낮았다; 따라서, 새로 자란 잎은 벡터를 포함하지 않고 대상의 생산에 기여하지 않습니다. 또한, 재조합 단백질의 열화 이상의 시간 mAY 10 dpi로에서 환원 단백질 수준에 기여한다. 우리의 결과는 A.의 침투를 보여 주었다 N. 일시적인 단백질 생산의 튜메 파시 엔스 균주 GV3101 매개 높은 수준 benthamiana. 또한, 목적 단백질은 lichenase하는 N-말단, C-말단 또는 내부 융합체 (LicKM), β-1 ,3-1, 4 – 글루 카나 아제, 클로스 트리 디움 thermocellum에서 열 안정성 효소이고 많은 타겟에 내열성을 부여로 설계 될 수있다 단백질 융합 18. N.의 침투 A.과 benthamiana 잎 말림, 잎자루의 신장, 컬링 : 가벼운 또는 심한 증상을 유발 관심의 유전자를 품고 야생형 균주 (AT6, AT10 및 at77를) 투메 파시 엔스. 어떤 병적 인 증상은 N.에서 관찰되지 않았다 일부 유전자가 GV3101을 변종 pBID4에 삽입 실험실로 변환하는 동안 benthamiana는, 빈 pBID4 벡터를 숨겨 실험실 변형 GV3101에 침투, C58C1 또는 LBA4404 가벼운 괴사 반응과 잎을 이끌어백화 / 잎의 침투 지역에서 증상을 황변. 야생 형 아그로 박테 리움 또는 가지과 식물 기폭 장치를 제거하는 균주에 의한 괴사 증상은 이전에 56, 57가보고되었습니다. 괴사 반응은 유형 III 분비 시스템의 유형 IV 분비 시스템에 의해 식물 세포에 전달 세균의 단백질 및 / 또는 편모 58-60 감도의 독성 요인에서 발생할 수 있습니다. 우리는 이종 단백질의 일시적인 생산도 병원성을 유도 할 수 있으며 침투 공장에서 과민 반응이 나뭇잎 것으로 나타났습니다. 많은 연구자들은 안정적으로 형질 전환 식물 28,57에 비해 과도 단백질 생산의 5 ~ 20 배 높은 수준까지 생산 공장 이진 벡터와 다른 식물 종의 agroinfiltration을보고했다. 우리의 데이터는 보여줍니다 N. benthamiana는 GV3101에 대해보고 된 GFP 수익률과 유사 GFP의 pBID4-GFP 일시적으로 발현 높은 수준을 품고으로 침투N.의 benthamiana는 아그로 박테리아가 롯트-GFPSYS 바이러스 벡터 (총 수용성 단백질의 80 %) 44 운반과 침투. 런칭 벡터를 이용 Agroinfiltration이 내열성 단백질 LicKM의 높은 생산 결과, 표준 플라스미드 바이너리 (18)를 사용하여 관찰 된 것보다 50 배.
A.의 감염을 테스트하려면 튜메 파시 엔스 및 발사 벡터의 안정성, 우리는 N.의 플랫 침투 benthamiana pBID4-GFP 플라스미드를 숨겨 GV3101의 동일한 밀리 Q 물 희석 문화권을 사용하여 최대 8 시간 동안 매 시간마다. 우리의 데이터는 GV3101의 변형을 효율적으로 최소 8 시간 및 pBID4 (발사 벡터)에 대한 감염성 것으로 나타났다은 8 시간 긴 침투하는 동안 매우 안정적입니다.
-80 ° C에 저장된 발사 벡터 pBID4-HAC1 (세포 은행을) 숨겨 GV3101 균주의 글리세롤 주식은 과도 PROTE의 변화없이 3 년 동안 매우 안정적인 것으로 나타났다침투 공장에서 생산.
최적의 조건에서 35 사이의 42 일 후 파종에서 재배 N. benthamiana의 식물 진공 침투 매개 일시적인 유전자 발현 (40)에 대한 최적이었다. (3-4 주령) 이하 식물 때문에 세포 현탁액 표면 및 진공을인가하는 기계적 효과에서 조직 손상에 떠있는 나뭇잎 완전히 침투 할 수 없다. 사십오일, N.보다 오래된 식물 benthamiana 사용 된 최적의 광 조건에서, 무대를 볼트, 일시적 발현의 수준이 낮습니다.
저분자 페놀 화합물 (아세토 시린 곤) 및 monosaccharaides (글루코오스) 55,61을 A. 투메 파시 엔스는 소재 VIR 유전자를 유도하는 것으로 알려져있다. 또한, N.의 침투 50-600 μM의 농도에서 아세토 시린 곤의 존재 이진 벡터 pCAMBIA (GFP)와 benthamiana 약간 과도을 증가 표시했다유전자 발현 40. 우리는 3 시간 동안 MMA에 pBID4-GFP를 숨겨 GV3101의 문화에 이들 화합물을 첨가하여 우리의 시스템에서 아세토 시린 곤과 포도당의 서로 다른 농도의 효과를 연구하고, GFP 발현에 차이를 찾을 수 없습니다. 흥미롭게도, pBID4-GFP를 숨겨 0.5의 600 밀리 Q 물에 희석하고 비르 유전자의 유도없이 침투 GV3101의 문화에 의한 문화 침투와 그로서 GFP의 동일한 금액을 표명했다. A. 튜메 파시 엔스의 비르 유전자 (들)은 잠재적으로 공장의 페놀 화합물 (아세토 시린 곤 및 sinapinic 산)과 잎의 조직에 존재하는 식물 monosaccharaides (포도당과 과당)에 의해 유도 될 수있다. 따라서 외인성 VIR 유전자 유도제의 존재 또는 부재에서 GFP 발현의 유사한 수준이 식물 세포에서 GFP 발현 발사 벡터의 복제 중에 본 세포질 VIR 유전자 유도제의 효과의 결과 일 수 있다는 것을 추측.
<p class= "jove_content"> 야생 형 N. benthamiana 과도 단백질 생산 49 모델 호스트로 사용되어왔다. 그러나, N. benthamiana의 상대적으로 낮은 바이오 매스 수율은 재조합 단백질의 대량 생산에 대한 응용 프로그램을 방해한다. 최적의 호스트는 일시적 발현의 높은 수준의 온실 쉬운 성장을 결합하고, 아그로 박테 리움의 침투 2에 민감해야한다. 다른 호스트를 선택하기 위해, 우리는 하이브리드 N.에게 된 담배 (N.의 benthamiana와 N. 엑셀)의 두 개의 서로 다른 야생 형 종을 침투하고 A.와 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana) pBID4-GFP 플라스미드를 숨겨 변형 GV3101을 투메 파시 엔스. 이러한 세 가지 종 중에서, GFP 발현 수준 N. 약간 높았다 benthamiana. N. 엑셀 시어 식물 인해 가죽 같은 잎을 진공 agroinfiltration에 어려움을 보였으며, N. excelsiana생산 거의 같은 성장 조건에서 더 많은 바이오 매스를 두 배. 7 dpi 해상도에서 GFP의 일시적인 생산 N. 상대적으로 유사하다 benthamiana와 N. excelsiana. 따라서, N. excelsiana은 재조합 단백질 생산에 더 적합한 호스트 일 수있다.아그로 박테 리움 매개 과도 단백질 생산 유전자가 식물 바이러스의 기원 (62)의 억제를 침묵의 공동 식으로 극복 할 수 PTGS 26 일에 의해 제한됩니다. 과도 단백질 생산 이전에 함침 조직 (34)에 PTGS를 억제 TBSV의 P19 단백질의 존재하에 50 배 향상된 것으로 나타났다. 우리의 연구에서, 우리는 개별적으로 발사 벡터 pBID4-HAC1와 공동 침투 두 바이러스 성 침묵 억제 (P19 및 P23)의 효과를 평가 하였다. 이러한 침묵 억제의 공동 침투 HAC1 만 약간의 증가와 함께, HAC1의 일시적 발현에 거의 영향을 미칠 듯공동 침투 P23 또는 P19의 존재 단백질의 축적 (15~25%). 단백질 생산에 긍정적 영향을 미치는 것으로, 침묵 억제 구체적 대상 식물 종 및 바이러스 벡터 (63)에서 유효로 선정 될 필요가있다. TMV의 헬리는 RNA 침묵 활동 (64), (65)의 억제가 있습니다. pBID4-HAC1와 P23 또는 P19의 공동 침투는 GFP의 증가없이 또는 과도 HAC1 단백질 생산에 약간의 증가의 결과로 우리의 데이터는 이러한 관찰을 확인합니다.
결론적으로, 우리는 수정 및 최적화 식물과 아그로 박테 리움의 성장 조건을 진공 침투의 효율성을 개선했습니다. 이 기술은 몇 시간에 식물 재료의 수백 킬로그램의 성장과 침투 할 수있었습니다. 우리는 성공적으로 현재 좋은 제조 관리 기준 (cGMP의) 조건에서 산업 규모에서 높은 처리량 백신 생산을위한 공장 일시적 발현 기술을 자동화. ABO 자세한 내용은UT 자동화 및 cGMP의 조건 하에서 서브 유니트 백신 후보를 포함한 재조합 단백질의 생산을위한 식물 과도 단백질 생산 시스템의 활용은, 독자는 홈페이지 칭한다 www.fhcmb.org/ .
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 분자 생명 공학, iBio, 주식 회사와 방위 고등 연구 프로젝트 기관 (승인 번호의 HDTRA1-07-C-0054)를위한 프라운호퍼 미국 센터에 의해 지원되었다. 저자는 Drs에 의해 관대 한 선물을 인정합니다. 생물 과학과, 퍼듀 대학교 (아그로 박테 리움 균주를 투메 파시 엔스)와 대규모 생물학 사의 웨인 Fitzmaurice (N.의 excelsiana 씨)뿐만 아니라 미국 된 담배 컬렉션, 노스 캐롤라이나 주립 대학 (N. 엑셀 씨의 제니퍼 니콜슨의 스탠튼 Gelvin ). 저자는 식물과 뛰어난 기술 지원을 제공하는 마가렛 실링 크리스토퍼 헐 감사합니다. 저자는 또한 Drs에 감사드립니다. 편집에 도움 스티븐 Streatfield와 나타샤 Kushnir.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |