Переходные производство белка в Nicotiana растений на основе вакуумной пропитки с Agrobacteria проведения запуска векторов (Табак вирус основе мозаики) является быстрым и экономический подход для получения вакцинных антигенов и терапевтических белков. Мы упростили процедуру и улучшение накопление целевой счет оптимизации условий культивирования бактерий, отбора видов хозяев, и со-внедрения РНК глушителей ограничителей.
Переходный производство белка Agrobacterium-опосредованной у растений является перспективным подходом для получения вакцинными антигенами и терапевтических белков в течение короткого периода времени. Тем не менее, эта технология только начинает применяться к крупномасштабных производственных столько технологических препятствий для расширения в настоящее время преодолены. Здесь мы демонстрируем простое и воспроизводимый метод для производства в промышленных масштабах переходный белка на основе вакуумной инфильтрации Nicotiana растений с Agrobacteria проведения запуска векторов. Оптимизация выращивания Agrobacterium в АБ среды позволяет прямое разбавление бактериальной культуры в Milli-Q воды, что упрощает процесс инфильтрации. Среди трех тестируемых видов Nicotiana, N. excelsiana (Н. benthamiana × N. Excelsior) была выбрана в качестве наиболее перспективного хозяина из-за легкости проникновения, высокий уровень продукции белка-репортера, и около двух-естарый выше производство биомассы в контролируемых условиях окружающей среды. Индукция Agrobacterium укрывательство pBID4-GFP (вируса табачной мозаики на основе) с использованием химических веществ, таких как ацетосирингона и моносахаридов не влияло на уровень производства белка. Проникнув завод под 50 до 100 мбар в течение 30 или 60 секунд в результате около 95% проникновения растительных тканях листа. Проникновение с Agrobacterium лабораторного штамма GV3101 показали высокий производство белка по сравнению с Agrobacteria лабораторных штаммов LBA4404 и C58C1 и дикого типа Agrobacteria напрягает AT6, AT10, at77 и A4. Совместная экспрессия вирусного РНК глушителей супрессоров, p23 или p19, в N. benthamiana привело к более ранней накопления и увеличения производства (15-25%) от белка-мишени (гемагглютинина вируса гриппа).
Растения в настоящее время признается в качестве безопасной, надежной, масштабируемой и недорогой платформы для производства гетерологичных рекомбинантных биофармацевтических препаратов и промышленных белки 1-3 и имеют важные преимущества перед микробных и животных систем экспрессии клеток 4. Растения способны выразить правильно сложенные белки с пост-трансляционных модификаций, включая собранные мультимерных антител 5-7. Несколько растительного происхождения рекомбинантные фармацевтические белки проходит клинические испытания 8. К ним относятся пациент-специфических рекомбинантных вакцин идиотипа (ScFv) для лечения неходжкинской лимфомы в 9, гемагглютинин основе пандемического и сезонного кандидатов вакцины против гриппа 10,11 (Каммингс и др.., Который был представлен вакцины), анти-Streptococcus поверхностный антиген I / II антитела для лечения кариеса зубов 12 и человеческого инсулина при лечении диабета 13. Кроме того, человеческий выздоровеетmbinant глюкоцереброзидаза для фермента терапии у пациентов с болезнью Гоше был одобрен в Израиле и США и предоставляется в рамках Программы доступа Расширенной за пределами США 14,15.
Гетерологичных белков могут быть получены в стабильно трансформированных (трансгенных или транспластомных) или временно трансформированных растений. Переходный производство белка предлагает несколько преимуществ по сравнению с производством в трансгенных растений, в том числе короткого периода времени, чтобы достичь экспрессию и накопление 16, и может быть достигнуто путем введения бактериальных двоичные векторы или рекомбинантный растительные вирусные векторы в растительные ткани 4. Самые передовые переходный система выражение основано на использовании "Launch векторов", которые сочетают компоненты растительных вирусов и бинарных плазмид, и поставляемых агроинфильтрации 17,18. Агроинфильтрации вектора ракеты на основе вируса мозаики табака (ВТМ) успешно применяется в лабораториимасштабировать для производства вакцинных антигенов против патогенов, таких как вирус папилломы человека 19, Yersinia Pestis 20, вирусы гриппа A 21,22, Bacillus сибирской язвы 23, и вирус оспы 24 в N. benthamiana уходит. Агробактериальная кратковременная экспрессия также перспективным методом одновременного производства нескольких белков 2,25-27. Например, растительные переходные системы экспрессии были использованы для получения опухоль-специфичные рекомбинантных антител, 28,29 гликозилированного рекомбинантного антитела против рецептора эпидермального фактора роста 30, а также моноклональное антитело, специфичное для сибирской язвы протективный антиген 31,32. Со-инфильтрация Nicotiana benthamiana растений с гена-мишени и подавитель результатов молчание генов в повышенной экспрессии белка-мишени 33,34.
Агроинфильтрации является распространенным методом для равномерно IntroduCing бактерии, несущие ген интереса в тканях растений 35-37. Вакуумная инфильтрация Agrobacterium для временной экспрессии генов в неповрежденной листьях растений является быстрым, масштабируемой и полезный метод для производства чужеродных белков без необходимости генерировать трансгенные растения 38-41. Во время вакуумной агроинфильтрации, растения перевернул с ног на голову и надземные части погруженным в Agrobacterium подвески. Тогда вакуум применяется вызывая газы эвакуироваться из листьев межклеточных пространствах через устьица. Быстрое повторное нагнетание После выхода из вакуумных приводит к инфузии Agrobacterium суспензии в лист. После вакуумной инфильтрации Agrobacteria, растения культивируют и целевой выражение контролируется. Самые высокие уровни целевой выражения обычно наблюдаются 2-3 дней после инфильтрации (точек на дюйм) с двоичным вектором и 4-7 руб с вектором запуска, после чего уровень экспрессии обычно уменьSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens является наиболее широко используемым средством для доставки гена интереса в растение для производства белка. Агроинфильтрации работает исключительно хорошо в N. benthamiana но относительно слабо и в большинстве других растений, в том числе арабидопсис 46.
В этом исследовании, мы разработали простой, эффективный и экономичный способ переходных продукции белка в 5-6 недельной давности N. benthamiana помощью A. tumefaciens инфильтрации. Основным недостатком промышленного масштабирования методики агроинфильтрации является центрифугирование добываемых бактерий и ресуспендирования бактериальных гранул в среде, содержащей 4'-гидрокси-3 ', 5'-диметоксиацетофенон (ацетосирингона), моносахариды, и 2 – (N-морфолино) -этансульфоновой кислоты (MES) буфер для индукции генов Вир. Мы были в состоянии преодолеть эти проблемы за счет оптимизации Agrobacterium </EM> рост AB среды (минимальная среда) с последующим непосредственно разбавления в Milli-Q воды и, контролируя продолжительность и условия инфильтрации. Мы также по сравнению производство белка мишени в дикого типа хост табак видов N. benthamiana и Н. эксцельсиор, а также в гибридных N. excelsiana.
В этом исследовании, мы разработали простой протокол агроинфильтрации для рутинной переходного производства белка в отдельных видов Nicotiana использованием штаммов Agrobacterium, несущие вектор запуска. Кроме того, мы определили оптимальные условия для достижения наивысшего рекомбинантный уровень производства белка в нашем переходном системы экспрессии растений.
Вакуумная инфильтрация разбавленного А. tumefaciens штамм GV3101, несущие вектор pBID4 запуска в N. benthamiana, Н. excelsiana и Н. эксцельсиор привело к более высоким уровням производства белка-мишени в течение 7 руб по сравнению с другими видами растений, таких как Pisum посевного пропитывают GV3101, несущего вирус мозаики люцерны – или вируса огуречной мозаики на основе векторов, экспрессирующих ген GFP-репортер под промотора 35S 41, или Lactuca сатива, Solanum LycoPersicum и арабидопсис проникли со штаммом C58C1 А. tumefaciens, несущие репортер ген бета-глюкуронидазы 57. Н. benthamiana и Н. excelsiana было легко пропылесосить проникнуть в 50 мбар в течение 30-60 сек, с 90-95%-ной эффективности инфильтрации. Остальные 5-10% площади листа не проникли из-за некоторого плавающего листьев на поверхности суспензии Agrobacterium в течение применением вакуума. Так как вектор запуск имеет способность для движения 18 от клетки к клетке, накопление переходный белка происходит в целых листьев, а также черешках на 7 руб. В 10 точек на дюйм, по оценкам производство GFP был несколько ниже, потому что вектор экспрессии pBID4 способен двигаться от клетки к клетке, но не двигаться системно 18 лет; Поэтому, вновь выращенные листья не содержат вектор и не способствуют производству цели. Кроме того, ухудшение рекомбинантного белка с течением времени май способствовать снижению уровня белка в 10 руб. Наши результаты показали, что проникновение в А. tumefaciens штамм GV3101 опосредованные высокие уровни переходных производства белка в N. benthamiana. Кроме того, целевой белок может быть спроектирован как N-концевые, С-концевые или внутренние слитых в лихеназы (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-глюканазы, который является термостабильный фермент из Clostridium thermocellum и дает термостабильность во многие цели слитый белок 18. Проникновение N. benthamiana с А. tumefaciens штаммов дикого типа (AT6, AT10 и at77) укрывательство интересующий ген вызвал умеренные или тяжелые симптомы: лист керлинг, черешок удлинения, и щипцы. Никаких патологических симптомов не наблюдалось в N. benthamiana проникли с лабораторным штаммом GV3101 укрывательство пустой pBID4 вектор, в то время как некоторые гены вставлены в pBID4 и превращается в лаборатории штаммов GV3101, C58C1 или LBA4404 вызвал умеренные некротические ответы и листхлороз / пожелтение симптомы в проникших регионов листьев. Некротические симптомы, вызванные дикого типа Agrobacterium или разоружены штаммов в пасленовых растений были сообщалось ранее 56,57. Некротический ответ может быть результатом факторов вирулентности секреции системы типа III, бактериальных белков, переданных в растительной клетке системой секреции типа IV, и / или чувствительности к флагеллином 58-60. Мы обнаружили, что переходный процесс производства гетерологичных белков также может вызывать патогенность и реакции гиперчувствительности в проникла листьев растений. Многие исследователи сообщили, что агроинфильтрации различных видов растений с растений двоичных векторов, произведенных до 5-20 раз более высокие уровни переходных продукции белка по сравнению с стабильно трансформированных растений 28,57. Наши данные показывают, что Н. benthamiana проникли с GV3101, несущие pBID4-GFP временно экспрессированного высокие уровни GFP, который похож на выход GFP, описанной дляН. benthamiana проникли с Agrobacteria неся вирусного вектора Pich-GFPSYS (до 80% от общего растворимого белка) 44. Агроинфильтрации с помощью нашего запуска вектор привело к высокой продукции термостабильной LicKM белка, в 50 раз выше, чем наблюдаемое с помощью стандартного бинарного плазмидного 18.
Чтобы проверить инфекционность А. tumefaciens и стабильность вектора ракеты, мы проникли один плашмя N. benthamiana каждый час в течение до 8 ч, используя тот же Milli-Q водном растворе культуры GV3101, несущие плазмиду pBID4-GFP. Наши данные показали, что штамм GV3101 эффективно инфекционный, по крайней мере 8 часов и pBID4 (вектор запуск) является очень стабильным в течение 8 ч на протяжении инфильтрации.
Глицерин запас GV3101 штамма, ракеты вектор pBID4-HAC1 (банк клеток), который хранится при -80 ° С, как было показано, чтобы быть очень стабильным в течение трех лет без изменений в переходных защпроизводства в проникших растений.
Н. benthamiana растения, выращенные в оптимальных условиях и между 35 и 42 дней после посева были оптимальными для вакуумной инфильтрации опосредованного временной экспрессии гена 40. Младшие растения (3-4 недель) не может быть полностью проник из-за листьев, плавающих на поверхности клеточной суспензии и повреждению тканей от механического воздействия применения вакуума. В растениях старше 45 дней, N. benthamiana болтов этап, при оптимальных условиях освещения, используемых, уровень кратковременной экспрессии является низким.
Низкомолекулярные соединения вес фенольные (ацетосирингона) и monosaccharaides (глюкозы), как известно, вызывают гены Вир в А. tumefaciens 55,61. Более того, проникновение N. benthamiana с бинарный вектор pCAMBIA (GFP) в присутствии ацетосирингона в концентрации 50-600 мкМ были показаны несколько увеличить переходныйэкспрессии генов 40. Мы изучали влияние различных концентраций ацетосирингона и глюкозы в нашей системе, добавив эти соединения в GV3101 культур, несущих pBID4-GFP в ММА в течение 3 часов, и не обнаружили различий в выражении GFP. Интересно, GV3101 культуры, несущие pBID4-GFP и разбавленные в Milli-Q воды до 600 и от 0,5 проникли без индукции гена Vir выражали то же самое количество GFP, как те проникли с индуцированных культур. А. Ген вир tumefaciens (ы) потенциально может быть вызвано фенольных соединений растений (ацетосирингона и sinapinic кислоты) и растений monosaccharaides (глюкоза и фруктоза), присутствующих в ткани листа. Таким образом, мы предполагаем, что подобные уровни GFP экспрессии в присутствии или в отсутствие экзогенного гена Vir индукторов может быть результатом эффекта цитоплазматических генов вир индукторов, присутствующих во время репликации GFP-экспрессирующих запуска вектора в клетках растений.
<p class= "Jove_content"> дикого типа Н. benthamiana был использован в качестве типового хозяина для переходного продукции белка 49. Тем не менее, относительно низкий выход биомассы Н. benthamiana 'ы сдерживает его применение для крупномасштабного производства рекомбинантных белков. Оптимальное хост должен объединить высокий уровень кратковременной экспрессии, легкий роста в теплице, и быть восприимчивыми к Agrobacterium инфильтрации 2. Чтобы выбрать альтернативный хост, мы проникли два разных вида дикого типа Nicotiana (Н. benthamiana и Н. стружку) и гибридный N. excelsiana (Н. benthamiana × N. Excelsior) с А. tumefaciens штамм GV3101, несущих плазмиды pBID4-GFP. Среди этих трех видов, уровень экспрессии GFP был несколько выше, в N. benthamiana. Н. Excelsior растения показал трудности в вакуумной агроинфильтрации из-за их кожистыми листьями, и Н. excelsianaпроизводится примерно в два раза больше биомассы при тех же условиях роста. Переходный производство GFP в 7 руб относительно похожи в N. benthamiana и Н. excelsiana. Таким образом, N. excelsiana может быть более подходящим хозяином для рекомбинантного белка.Переходные производство белка Агробактериальная ограничивается PTGS 26, который может быть преодолена путем совместной экспрессии гена глушителей супрессоры растительного вируса происхождения 62. Переходный производство белка Ранее было показано, чтобы быть повышена в 50 раз в присутствии белка р19 TBSV, который ингибирует PTGS в тканях проникли 34. В нашем исследовании мы оценивали влияние двух вирусных глушителей супрессоров (р19 и р23) отдельно совместно проникли с ракетой-вектора pBID4-HAC1. Совместное инфильтрация этих глушителей супрессоров, казалось, мало влияют на временной экспрессии HAC1, только с небольшим увеличением HAC1Накопление белка (15-25%) в присутствии со-проникли p23 или p19. Чтобы положительно повлиять на производство белка, глушителей супрессоров возможно, должны быть специально отобраны, чтобы быть эффективным для целевых видов растений и вирусного вектора 63. ВТМ геликаза имеет подавитель из РНК глушителей деятельности 64,65. Наши данные подтверждают это наблюдение как со-инфильтрация p23 или p19 с pBID4-HAC1 не привело к увеличению GFP или незначительного увеличения переходного производства HAC1 белка.
В заключение, мы изменили и оптимизированы завод и условия роста Agrobacterium и повысила эффективность вакуумной пропитки. Эта технология позволила нам расти и проникнуть сотни килограммов растительного материала в течение нескольких часов. Мы успешно автоматизировала переходный технику выражение завода по производству высокой пропускной вакцины в промышленных масштабах в нынешних надлежащей производственной практики (цГМФ) условия. Для получения дополнительной информации абоавтоматизация и использование растительного переходного белка производственной системы для производства рекомбинантных белков, в том числе кандидатов субъединицы вакцины, в условиях цГМФ ут, читатели могут обратиться к веб-сайта www.fhcmb.org/ .
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Fraunhofer США Центра молекулярной биотехнологии, Ibio, Inc и обороны Агентства перспективных исследовательских проектов (грант # HDTRA1-07-C-0054). Авторы признают, щедрые подарки от доктора. Стэнтон Gelvin биологических наук кафедра, Университет Пердью (Agrobacterium tumefaciens штаммы) и Уэйн Фитцморисом крупномасштабных биологии корпорации (Н. семян excelsiana), а также Дженнифер Николсон из США Nicotiana Collection, Государственного университета Северной Каролины (N. Excelsior семян ). Авторы выражают благодарность Маргарет Shillingford и Кристофер Халл для обеспечения растений и отличную техническую помощь. Авторы также благодарят доктора. Стивен Стритфилд и Наташа Кушнир за помощь в редактировании.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |