Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.
Agrobacterium-gemedieerde tijdelijke eiwitproductie in planten is een veelbelovend om vaccinantigenen en therapeutische eiwitten binnen een korte tijd. Echter, is deze technologie nog maar net beginnen te worden toegepast op grote schaal te produceren zo veel technologische belemmeringen voor opschaling worden nu overwonnen. Hier tonen we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het op industriële schaal voorbijgaande eiwitproductie op basis van vacuüm infiltratie van Nicotiana planten met Agrobacteriën dragen lancering vectoren. Optimalisatie van Agrobacterium teelt in AB medium maakt een directe verwatering van de bacteriecultuur in Milli-Q water, de vereenvoudiging van de infiltratie-proces. Onder de drie geteste soorten van Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. houtwol) werd gekozen als de meest veelbelovende gastheer vanwege het gemak van infiltratie, hoge reporter eiwitproductie en twee-foude hogere biomassaproductie onder gecontroleerde omstandigheden. Inductie van Agrobacterium pBID4-GFP (tabak mozaïek virus gebaseerde) met chemicaliën zoals acetosyringoon en monosaccharide had geen effect op het eiwit productieniveau. Infiltreren plant onder 50 tot 100 mbar gedurende 30 of 60 seconden resulteerde in ongeveer 95% infiltratie van plant blad weefsels. Infiltratie met Agrobacterium laboratoriumstam GV3101 toonde de hoogste eiwitproductie in vergelijking met Agrobacteria laboratoriumstammen LBA4404 en C58C1 en wild-type Agrobacteria stammen AT6, AT10, at77 en A4. Co-expressie van een viraal RNA silencing suppressor p23 of p19, in N. benthamiana resulteerde in eerdere accumulatie en verhoogde productie (15-25%) doelwiteiwit (influenzavirus hemagglutinine).
Planten worden nu erkend als een veilige, betrouwbare, schaalbare en goedkoop platform voor de productie van heterologe recombinante biofarmaceutische en industriële eiwitten 1-3 en hebben belangrijke voordelen ten opzichte van microbiële en dierlijke celexpressiesystemen 4. Planten zijn in staat om correct gevouwen eiwitten tot expressie met post-translationele modificaties, inclusief gemonteerde multimere antilichamen 5-7. Verschillende plantaardige recombinante farmaceutische eiwitten ondergaan klinische evaluatie 8. Deze omvatten patiëntspecifieke recombinante idiotype vaccins (scFv) voor de behandeling van non-Hodgkin lymfoom 9, hemagglutinine-gebaseerde pandemie en seizoensgebonden influenzavaccin gegadigden 10,11 (Cummings et al.. Aan Vaccine ingediend), anti-Streptococcus oppervlakteantigeen I / II antilichaam voor de behandeling van tandcariës 12 en humane insuline voor de behandeling van diabetes 13. Bovendien menselijk recombinant glucocerebrosidase voor enzym-substitutietherapie bij patiënten met de ziekte van Gaucher is in Israël en de VS goedgekeurd en wordt geleverd onder de Expanded Access Program buiten de VS 14,15.
Heterologe eiwitten kunnen worden geproduceerd in stabiel getransformeerde (transgeen of transplastomic) of tijdelijk getransformeerde planten. Voorbijgaande eiwitproductie biedt verschillende voordelen ten opzichte productie in transgene planten, waaronder de korte termijn expressie en accumulatie 16 bereiken, en kan worden bereikt door bacteriële binaire vectoren of recombinante planten virale vectoren in plantenweefsels 4. De meest geavanceerde transiënt expressiesysteem is gebaseerd op het gebruik van "launch vectoren" die bestanddelen van plantenvirussen en binaire plasmiden combineren, door agroinfiltration 17,18 geleverd. Agroinfiltration van een lancering vector op basis van tabak mozaïek virus (TMV) is met succes in het lab toegepastschalen naar vaccin antigenen produceren tegen pathogenen zoals het humaan papillomavirus 19, Yersinia pestis 20, influenzavirussen A 21,22, Bacillus anthracis 23 en pokkenvirus 24 in N. benthamiana bladeren. Agrobacterium gemedieerde tijdelijke expressie is een veelbelovende werkwijze voor de gelijktijdige productie van verschillende eiwitten 2,25-27. Zo zijn plantaardige tijdelijke expressiesystemen gebruikt om tumor-specifieke recombinante antilichamen 28,29, een geglycosyleerd recombinant antilichaam tegen de epidermale groeifactor receptor 30 en een monoklonaal antilichaam specifiek voor miltvuur beschermende antigeen 31,32 produceren. Co-infiltratie van Nicotiana benthamiana planten met een target-gen en een suppressor van gene silencing resulteert in verbeterde doeleiwitexpressie 33,34.
Agroinfiltration is een gemeenschappelijke methode voor het uniform introducing bacteriën drager zijn van een gen van belang in plantaardige weefsels 35-37. Vacuüm infiltratie van Agrobacterium voor transiënte genexpressie in intacte bladeren is een snelle, schaalbare en bruikbare werkwijze voor productie van heterologe eiwitten zonder dat transgene planten 38-41 genereren. Tijdens vacuüm agroinfiltration, zijn planten ondersteboven weggeknipt en bovengrondse delen ondergedompeld in Agrobacterium schorsing. Dan vacuüm wordt toegepast waardoor gassen te evacueren van blad intercellulaire ruimten via huidmondjes. Snelle re-onder druk na release van het vacuüm resultaten in de infusie van de Agrobacterium schorsing in het blad. Na vacuüm infiltratie van Agrobacteria, zijn planten verder gekweekt en doel expressie wordt bewaakt. De hoogste doelwitexpressiecassette worden typisch waargenomen 2-3 dagen na infiltratie (dpi) met een binaire vector en 4-7 dpi met een lancering vector, waarna het expressieniveau meestal decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens is het meest gebruikte middel voor het afleveren van een gen van belang in een plant voor eiwitproductie. Agroinfiltration werkt uitzonderlijk goed in N. benthamiana maar relatief slecht in de meeste andere planten, zoals Arabidopsis thaliana 46.
In deze studie hebben we een eenvoudige, efficiënte en economische methode voor transiënte eiwitproductie in 5-6 weken oude N. benthamiana behulp A. tumefaciens infiltratie. Het grote nadeel van industriële schaal van de agroinfiltration techniek centrifugatie geoogst bacteriën en resuspensie van de bacteriële pellet in medium dat 4'-hydroxy-3 ', 5'-dimethoxyacetofenon (acetosyringoon), monosacchariden, en 2 – (N-morfolino) -ethaansulfonzuur (MES) buffer voor de inductie van de vir-genen. We zijn in staat om deze problemen te overwinnen door het optimaliseren van de Agrobacterium geweest </em> groei in AB medium (minimaal medium), gevolgd door direct verdunnen in Milli-Q water en door het beheersen van de infiltratie duur en de omstandigheden. We hebben vergeleken doeleiwit productie in de wildtype tabak gastheersoort N. benthamiana en N. houtwol, evenals in hybride N. excelsiana.
In deze studie hebben we een eenvoudige agroinfiltration protocol voor alleen tijdelijke eiwitproductie in bepaalde soorten Nicotiana middels Agrobacterium stammen die de lancering vector ontwikkeld. Bovendien hebben wij de optimale omstandigheden die de hoogste recombinante eiwitproductie niveau onze transiënte fabriek expressiesysteem bereiken.
Vacuüm infiltratie van de verdunde A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de lancering vector pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana en N. excelsior resulteerde in hogere niveaus van target eiwitproductie binnen 7 dpi vergelijking met andere plantensoorten, zoals Pisum sativum geïnfiltreerd met GV3101 herbergen Alfalfa mosaic virus – of komkommer mozaïek-virus gebaseerde vectoren die de GFP reporter gen onder de 35S-promotor 41, of Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum en Arabidopsis thaliana geïnfiltreerd met de C58C1 stam van A. tumefaciens die de beta-glucuronidase reportergen 57. N. benthamiana en N. excelsiana waren gemakkelijk te stofzuigen infiltreren bij 50 mbar gedurende 30-60 sec, met 90-95% infiltratie efficiëntie. De resterende 5-10% bladoppervlak niet geïnfiltreerd vanwege een drijvende bladeren op het oppervlak van de Agrobacterium-suspensie tijdens het aanbrengen van het vacuüm. Sinds de introductie vector heeft de mogelijkheid voor cel-tot-cel beweging 18, voorbijgaande proteïne ophoping in hele bladeren en bladstelen 7 dpi. Bij 10 dpi, de geschatte GFP productie iets lager omdat pBID4 expressievector kan bewegen van cel naar cel, maar niet systemisch 18 bewegen; daarom, pas gegroeide bladeren niet de vector bevatten en niet bijdragen tot de productie van het doel. Bovendien degradatie van het recombinante eiwit tijd may dragen bij aan lagere niveau eiwit op 10 dpi. Onze resultaten toonden dat infiltratie van A. tumefaciens stam GV3101 gemedieerde hoge niveaus van voorbijgaande eiwitproductie in N. benthamiana. Verder kan doeleiwit worden gemanipuleerd als N-eindstandige, C-eindstandige of interne fusies aan lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, een thermostabiel enzym van Clostridium thermocellum en verleent thermostabiliteit vele doelwit eiwitfusie 18. Infiltratie van N. benthamiana met A. tumefaciens wild-type stammen (at6, AT10 en at77) herbergt het gen van interesse opgewekt milde of ernstige symptomen: blad curling, bladsteel rek, en curling. Geen pathologische symptomen waargenomen bij N. benthamiana geïnfiltreerd met het laboratorium stam GV3101 herbergen leeg pBID4 vector, terwijl sommige genen ingebracht in pBID4 en omgetoverd tot laboratorium stammen GV3101, C58C1 of LBA4404 uitgelokt milde necrotische reacties en bladchlorose / vergeling symptomen bij geïnfiltreerd regio's van bladeren. Necrotische symptomen veroorzaakt door wild-type Agrobacterium of ontwapend stammen in nachtschadeachtigen planten zijn eerder 56,57 gerapporteerd. De necrotische reactie kan resulteren uit virulentiefactoren van type III secretie systeem, bacteriële eiwitten overgebracht naar de plantencel door het Type IV secretie systeem, en / of gevoeligheid voor flagelline 58-60. Wij hebben gevonden dat transiënte productie van heterologe eiwitten ook kunnen opwekken pathogeniteit en een overgevoelige reactie in geïnfiltreerde bladeren. Veel onderzoekers rapporteerden dat agroinfiltration van verschillende plantensoorten met plant binaire vectoren geproduceerd tot 5-20 maal hogere niveaus van voorbijgaande eiwitproductie ten opzichte van stabiel getransformeerde planten 28,57. Onze gegevens tonen aan dat N. benthamiana geïnfiltreerd met GV3101 herbergen pBID4-GFP transiënt tot expressie hoge niveaus van GFP, die vergelijkbaar is met de GFP opbrengst gerapporteerdN. benthamiana geïnfiltreerd met Agrobacterium die de Pich-GFPSYS virale vector (tot 80% van de totale oplosbare eiwit) 44. Agroinfiltration gebruik van onze lancering vector resulteerde in hoge productie van de thermostabiele eiwit LicKM, 50-maal hoger dan deze waargenomen met behulp van een standaard binair plasmide 18.
Om de besmettelijkheid van A. testen tumefaciens en de stabiliteit van de lancering vector, we geïnfiltreerd een flat van N. benthamiana elk uur voor maximaal 8 uur met dezelfde Milli-Q-water verdund cultuur van GV3101 herbergen de pBID4-GFP plasmide. Onze gegevens laten zien dat de GV3101 stam efficiënt is besmettelijk gedurende minstens 8 uur en pBID4 (de lancering vector) is zeer stabiel tijdens de 8 uur durende infiltratie.
Glycerol voorraad van GV3101 stam die de lancering vector pBID4-HAC1 (cel bank) bewaard bij -80 ° C is aangetoond dat het zeer stabiel te zijn gedurende drie jaar zonder veranderingen in voorbijgaande protevan de productie in geïnfiltreerd planten.
N. benthamiana planten onder optimale condities en tussen 35 en 42 dagen na het zaaien gegroeid waren optimaal voor vacuüm-infiltratie gemedieerde transiënte genexpressie 40. Jongere planten (3-4 weken oud) niet volledig worden geïnfiltreerd door bladeren drijvend op de celsuspensie oppervlak en weefselschade door de mechanische werking van een vacuüm. In planten die ouder zijn dan 45 dagen, N. benthamiana builen podium, onder de optimale lichtomstandigheden gebruikt, het niveau van de tijdelijke expressie is laag.
Laag molecuulgewicht fenolische verbindingen (acetosyringoon) en monosaccharaides (glucose) daar vir genen induceren in A. tumefaciens 55,61. Bovendien infiltratie van N. benthamiana met de binaire vector pCAMBIA (gfp) in aanwezigheid van acetosyringoon bij concentraties van 50-600 pM werden licht toenemen voorbijgaandegenexpressie 40. We onderzochten het effect van verschillende concentraties van acetosyringoon en glucose in het systeem door het toevoegen van deze verbindingen GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP MMA 3 uur en vond geen verschil in GFP-expressie. Interessant, GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP en verdund in Milli-Q water tot een A 600 van 0,5 en geïnfiltreerd zonder de vir geninductie uitgedrukt dezelfde hoeveelheden GFP als die geïnfiltreerd met geïnduceerde culturen. De A. tumefaciens vir gen (en) zou kunnen worden geïnduceerd door plantfenolsamenstellingen (acetosyringoon en sinapinezuur) en plantaardige monosaccharaides (glucose en fructose) aanwezig in bladweefsel. Derhalve speculeren wij dat soortgelijke niveaus van GFP-expressie in de aanwezigheid of afwezigheid van exogeen vir gen inductoren gevolg van het effect van cytoplasmatische vir gen inductoren aanwezig tijdens replicatie van de GFP expressie vector introductie in plantencellen zijn.
<p class= "Jove_content"> Wild-type N benthamiana is gebruikt als model gastheer voor voorbijgaande eiwitproductie 49. Echter, N. benthamiana 's relatief laag biomassaopbrengst belemmert de toepassing ervan voor de grootschalige productie van recombinante eiwitten. De optimale gastheer moet een hoge mate van kortstondige expressie, gemakkelijke groei in een kas combineren, zijn gevoelig voor Agrobacterium infiltratie 2. Om een alternatieve gastheer selecteren, we geïnfiltreerd twee verschillende wild-type soort Nicotiana (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) met de A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de pBID4-GFP plasmide. Tussen deze drie soorten, het niveau van GFP-expressie iets hoger N. benthamiana. N. excelsior planten moeite met vacuüm agroinfiltration toonden door hun leerachtige bladeren, en N. excelsianaproduceerde ongeveer twee keer meer biomassa onder dezelfde groeiomstandigheden. De voorbijgaande productie van GFP op 7 dpi is relatief vergelijkbaar in N. benthamiana en N. excelsiana. Daarom N. excelsiana kan een meer geschikte gastheer voor recombinant eiwitproductie zijn.Agrobacterium gemedieerde tijdelijke eiwitproductie wordt beperkt door PTGS 26, die kan worden ondervangen door co-expressie van gene silencing suppressors van plantenvirus oorsprong 62. Voorbijgaande eiwitproductie werd aangetoond worden verbeterd 50-voudig in aanwezigheid van het p19 eiwit van TBSV, die PTGS in geïnfiltreerde weefsels 34 remt. In onze studie, onderzochten we het effect van twee virale silencing onderdrukkers (p19 en p23) afzonderlijk co-geïnfiltreerd met de lancering vector pBID4-HAC1. De co-infiltratie van deze zwijgen suppressors leek weinig invloed op transiënte expressie van HAC1 hebben, met slechts een lichte stijging HAC1eiwit accumulatie (15-25%) in de aanwezigheid van co-geïnfiltreerde p23 of p19. Een positieve invloed hebben eiwitproductie, kan het nodig zijn tot zwijgen onderdrukkers specifiek worden geselecteerd effectief voor de gerichte plantensoorten en virale vector 63 te zijn. TMV helicase heeft een onderdrukker van RNA-silencing activiteit 64,65. Onze gegevens bevestigen deze waarneming als co-infiltratie van p23 of p19 met pBID4-HAC1 resulteerde in een toename van GFP of een lichte stijging van de voorbijgaande HAC1 eiwitproductie.
Concluderend hebben we aangepast en geoptimaliseerd vaste Agrobacterium groei omstandigheden en verbeterde de efficiëntie van vacuüm infiltratie. Deze technologie ons in staat om te groeien en te infiltreren honderden kilo plantaardig materiaal in een paar uur. Wij hebben met succes geautomatiseerde de plant tijdelijke expressie techniek voor high-throughput vaccin productie op industriële schaal onder de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) omstandigheden. Voor meer informatie about automatisering en het gebruik van de plantaardige voorbijgaande eiwitproductie voor de productie van recombinante eiwitten, waaronder subunit vaccin kandidaten, onder cGMP condities, wordt de lezer verwezen naar de website www.fhcmb.org/ .
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Fraunhofer USA Centrum voor Moleculaire Biotechnologie, iBio, Inc en de Defense Advanced Research Projects Agency (subsidie # HDTRA1-07-C-0054). De auteurs erkennen de gulle giften door Drs. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammen) en Wayne Fitzmaurice van Large Scale Biologie Corp (N. excelsiana zaden), evenals Jennifer Nicholson van de Amerikaanse Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior zaden ). De auteurs danken Margaret Shillingford en Christopher Hull voor het leveren van planten en uitstekende technische bijstand. De auteurs danken ook Drs. Stephen Streatfield en Natasha Kushnir voor redactionele ondersteuning.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |