Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الأمثل والاستفادة من Published: April 19, 2014 doi: 10.3791/51204
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

Summary

إنتاج البروتين عابرة في النباتات نيكوتيانا استنادا فراغ تسلل مع Agrobacteria تحمل ناقلات إطلاق (فسيفساء التبغ القائم على الفيروس) هو نهج سريع والاقتصادية لإنتاج مستضدات اللقاح والبروتينات العلاجية. نحن تبسيط الإجراءات وتحسين تراكم الهدف عن طريق تحسين ظروف زراعة البكتيريا، واختيار الأنواع المضيفة، وشارك في تقديمه-RNA إسكات المكثفات.

Abstract

إنتاج البروتين عابرة بوساطة الأجرعية في النباتات هو نهج واعدة لإنتاج مستضدات اللقاح والبروتينات العلاجية في غضون فترة قصيرة من الزمن. ومع ذلك، وهذه التكنولوجيا ليست سوى مجرد بداية ليتم تطبيقها على إنتاج العديد من العقبات التكنولوجية على نطاق واسع لزيادة ويجري حاليا التغلب عليها. هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإنتاج البروتين عابرة على نطاق صناعي يعتمد على فراغ تسلل النباتات نيكوتيانا مع Agrobacteria تحمل ناقلات الاطلاق. الاستفادة المثلى من زراعة الأجرعية في AB المتوسطة يسمح التخفيف المباشر للثقافة البكتيرية في المياه الملة، س، وتبسيط عملية التسلل. بين ثلاثة أنواع من اختبار نيكوتيانا، N. وقد تم اختيار excelsiana (N. benthamiana N. × نجارة) بوصفها البلد المضيف الواعدة نظرا لسهولة التسلل، ومستوى عال من إنتاج البروتين المراسل، وحوالي اثنين وإنتاج الكتلة الحيوية القديمة أعلى في ظل الظروف البيئية التي تسيطر عليها. كان تحريض الأجرعية إيواء pBID4-GFP (فسيفساء التبغ القائم على الفيروس) استخدام المواد الكيميائية مثل acetosyringone وأحادي السكاريد أي تأثير على مستوى إنتاج البروتين. أدى التسلل النبات تحت 50-100 م بار لمدة 30 أو 60 ثانية في حوالي 95٪ تسلل الأنسجة ورقة النبات. أظهرت تسلل مع سلالة المختبر الأجرعية GV3101 أعلى إنتاج البروتين مقارنة سلالات مختبر Agrobacteria LBA4404 وC58C1 والبرية من نوع Agrobacteria سلالات AT6، AT10، at77 وA4. شارك في التعبير عن الفيروسي RNA إسكات القامع، P23 أو P19، في N. أدى تراكم benthamiana في وقت سابق، وزيادة الإنتاج (15-25٪) من البروتين الهدف (راصة دموية فيروس الأنفلونزا).

Introduction

يتم التعرف على النباتات الآن كمنصة آمنة وموثوقة وقابلة للتطوير وغير مكلفة لإنتاج المستحضرات الصيدلانية البيولوجية المؤتلف مغاير والبروتينات الصناعية 1-3 ولها مزايا مهمة على الميكروبية والحيوانية أنظمة التعبير الخلية 4. النباتات هي قادرة على التعبير عن البروتينات مطوية بشكل صحيح مع بعض التعديلات بعد متعدية، بما في ذلك الأجسام المضادة multimeric تجميعها 5-7. العديد من البروتينات المؤتلف الصيدلانية المشتقة من النباتات تشهد التقييم السريري 8. وتشمل هذه اللقاحات المريض محددة المؤتلف نمط ذاتي (scFv) لعلاج سرطان الغدد الليمفاوية اللاهودجكين 9، باء على أساس راصة دموية والمرشحين لقاح الأنفلونزا الموسمية 10،11 (كامينغز وآخرون، قدمت إلى اللقاحات)، ومكافحة العقدية المستضد السطحي أنا / الضد الثاني لعلاج تسوس الأسنان 12، والأنسولين البشري لعلاج مرض السكري 13. علاوة على ذلك، ريكو الإنسانتمت الموافقة glucocerebrosidase mbinant لاستبدال العلاج الانزيم في المرضى الذين يعانون من مرض غوشيه في إسرائيل والولايات المتحدة ويتم توفير إطار برنامج الوصول الموسع خارج الولايات المتحدة 14،15.

يمكن أن تنتج البروتينات مغاير في تحويل ثابت (المعدلة وراثيا أو transplastomic) أو النباتات تتحول عابر. يقدم إنتاج البروتين عابرة العديد من المزايا أكثر من الإنتاج في النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الإطار الزمني القصير لتحقيق التعبير وتراكم 16، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إدخال ناقلات ثنائي البكتيرية أو الفيروسية النباتية ناقلات المؤتلف في الأنسجة النباتية 4. ويستند نظام التعبير عابرة الأكثر تقدما على استخدام "نواقل إطلاق 'التي تجمع بين عناصر من الفيروسات النباتية والبلازميدات ثنائي، ويتم تسليمها من قبل agroinfiltration 17،18. وقد تم تطبيق Agroinfiltration من ناقلات إطلاق يعتمد على التبغ فسيفساء فيروس (TMV) بنجاح في المختبرالنطاق لإنتاج مستضدات قاح ضد مسببات الأمراض مثل فيروس الورم الحليمي البشري 19، الطاعون يرسينيا 20، فيروسات الأنفلونزا A 21،22، 23 عصيات الجمرة الخبيثة، والفيروسات الجدري في 24 N. benthamiana يترك. بوساطة الأجرعية التعبير عابر هو أيضا وسيلة واعدة لإنتاج بروتينات متعددة في وقت واحد 2،25-27. على سبيل المثال، تم استخدام نظم التعبير عابرة مصنع لإنتاج ورم محددة الأجسام المضادة المؤتلف 28،29، الأجسام المضادة المؤتلف الغليكوزيلاتي ضد مستقبلات عامل نمو البشرة 30، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة لمرض الجمرة الخبيثة مستضد واقية 31،32. شارك في تسلل النباتات benthamiana نيكوتيانا مع الجينات المستهدفة والقامع النتائج إسكات الجينات في تعزيز البروتين المستهدف التعبير 33،34.

Agroinfiltration هو طريقة شائعة لintrodu موحدالوراثة البكتيريا ايواء الجين من الفائدة في مصنع الأنسجة 35-37. فراغ تسلل الأجرعية عن التعبير الجيني عابرة في محطة سليمة يترك هو وسيلة سريعة وقابلة للتطوير، ومفيد لإنتاج البروتينات الخارجية دون الحاجة إلى توليد النباتات المعدلة وراثيا 38-41. خلال فراغ agroinfiltration، وانقلبت رأسا على عقب النباتات والأجزاء الهوائية المغمورة في الأجرعية التعليق. ثم يتم تطبيق فراغ تسبب الغازات لإخلاء مساحات من ورقة بين الخلايا من خلال الثغور. الإفراج السريع إعادة الضغط التالية من نتائج الفراغ في ضخ تعليق الأجرعية في ورقة. بعد فراغ تسلل Agrobacteria، وكذلك النباتات المزروعة ويتم رصد التعبير الهدف. عادة ما لوحظ أعلى مستويات التعبير الهدف 2-3 أيام بعد تسلل (نقطة في البوصة) مع ناقل ثنائي و4-7 نقطة في البوصة مع ناقلات إطلاق، وبعد ذلك على مستوى التعبير عادة decreaسيس 17،18،42-45. الأجرعية المورمة هو الوسيلة الأكثر استخداما على نطاق واسع لإيصال الجينات في المصالح في مصنع لإنتاج البروتين. Agroinfiltration يعمل بشكل جيد للغاية في N. benthamiana ولكن سيئة نسبيا في معظم النباتات الأخرى، بما في ذلك نبات الأرابيدوبسيس thaliana 46.

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة واقتصادية لإنتاج البروتين عابرة في 5-6 أسابيع من العمر N. benthamiana باستخدام A. المورمة التسلل. العيب الرئيسي من التوسع الصناعي للتقنية agroinfiltration هو الطرد المركزي من البكتيريا حصادها وإعادة تعليق بيليه البكتيرية في المتوسط ​​تحتوي 4'هيدروكسي-3 '، 5'-dimethoxyacetophenone (acetosyringone)، السكريات الأحادية، و 2 - (N-morpholino) -ethanesulfonic حمض (MES) العازلة لتحريض جينات فير. كنا قادرين على التغلب على هذه المشاكل عن طريق تحسين الأجرعية N. البرية من نوع الأنواع المضيفة التبغ وbenthamiana N. نجارة، وكذلك في الهجين N. excelsiana.

Protocol

1. زراعة النباتات

لagroinfiltration اللاحقة قمنا بتقييم اثنين من النوع البري الأنواع نيكوتيانا (N. benthamiana N. ونجارة) وهجين (N. excelsiana) نمت المائي على الصوف الصخري في المرافق الداخلية.

  1. نقع ألواح الصوف الصخري في حل الأسمدة النباتية.
  2. زرع البذور البرية من نوع N. benthamiana، N. نجارة وN. excelsiana (هجين من N. benthamiana N. × نجارة) على سطح المواد الغذائية غارقة الصوف الصخري.
  3. تنمو النباتات من البذور تحت ظروف خاضعة للرقابة (24 درجة مئوية والرطوبة النسبية 40-65٪) والإضاءة يوم طويل (14 ساعة ضوء و 10 ساعة ظلام، مع إضاءة من 130-150 م -2 μE ثانية -1) ل 4-5 أسابيع لN. وbenthamiana N. excelsiana، و5-6 أسابيع لN. نجارة.

2. بناء ناقلات للAgroinfiltratأيون

  1. إدراج الجينات الاصطناعية مراسل (الفلورية الخضراء البروتين [GFP])، كامل طول راصة دموية (HA) من سلالة A/California/04/2009 من فيروس الانفلونزا (HAC1)، وإعادة هندستها lichenase انزيم (LicKM) 18 بشكل منفصل في ناقلات إطلاق pBID4 18 (ناقل القائمة TMV) للحصول على pBID4-GFP، pBID4-HAC1 وpBID4-LicKM، على التوالي 18،32،41،47.
  2. أعرض 10-50 نانوغرام من pBID4 تحمل GFP أو HAC1 إلى خلايا electrocompetent من A. المورمة GV3101 سلالة وLicKM إلى خلايا electrocompetent من A. المورمة سلالات GV3101، C58C1، GLA4404، At06، AT10، At77 وA4 مع electroporator MicroPulser الجينات.
  3. استخدام Agrobacteria تحولت للتجارب تسلل ما لم يذكر خلاف ذلك.

3. فراغ تسلل الأجرعية في النباتات نيكوتيانا

  1. تنمو A. المورمة سلالات بين عشية وضحاها (O / N) في LB المتوسطة، ميد YEBالبوتاسيوم أو AB المتوسطة تستكمل مع 50 ملغ / لتر من كاناميسين عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة.
  2. تمييع Agrobacteria في المياه الملة، س إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (A 600) 0.5 أو أجهزة الطرد المركزي الأجرعية الخلايا المزروعة في LB أو YEB أو AB في 4،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإعادة تعليق في الحث المتوسطة (1X MS الملح، و 10 ملي زارة التربية والعلم، و 200 ميكرومتر acetosyringone، 2٪ سكروز [MMA]) الى 600 من 0.5، ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 ، ما لم يذكر خلاف ذلك ساعة.
  3. التسلل النباتات في غرفة الفراغ الذي غمر الأنسجة النباتية الجوي نيكوتيانا في الأجرعية التعليق وتطبيق فراغ 50-400 م بار لمدة 30 أو 60 ثانية. يتم تطبيق التسلل بشكل روتيني الأمثل في 50-100 م بار لمدة 60 ثانية.
  4. مرة واحدة يتم تقسيم الفراغ، وإزالة النباتات من فراغ الغرفة، وشطف في الماء، وتنمو لمدة 5-7 أيام وفقا للشروط النمو نفسها التي استخدمت للنمو ما قبل التسلل.
  5. لاختبار فعاليةالمواد الكيميائية المحفزة الأجرعية فير الجينات، وتركيزات مختلفة من acetosyringone (0، 100، 200 أو 400 ميكرومتر) تمت إضافتها إلى Agrobacteria علقت في المخزن تسلل (1X MS، 10 ملي زارة التربية والعلم، 2٪ الجلوكوز). للتأثير أحادي السكاريد على تحريض الجينات فير، نسب مختلفة من الجلوكوز (0، 1، 2 أو 4٪) تمت إضافتها إلى Agrobacteria علقت في المخزن المؤقت تسلل (1X MS، 10 ملي زارة التربية والعلم، 200 ميكرومتر acetosyringone). N. وقد تسلل النباتات benthamiana على النحو المذكور أعلاه في خطوات 3.3 و 3.4).
  6. مختبر الأجرعية سلالات GV3101، C58C1 وLBA4404 والبرية من نوع السلالات A4، At06، AT10، وAt77 إيواء ناقلات pBID4-LicKM كانت مخففة في الماء ملي-Q لA 600 0.5. N. وقد تسلل النباتات benthamiana مع كل سلالة معينة على النحو المذكور أعلاه في خطوات 3.3 و 3.4.

4. إجراء المشارك agroinfiltration لإسكات الفيروسي المكثف

  1. Mالتاسع من الملة-Q-المخفف بالماء الثقافات الأجرعية GV3101 تحمل الجين GFP وإسكات الفيروسي القامع P19 من الطماطم حيلة خطها فيروس (TBSV) في 1:1، 2:1، 3:01 و 4:1 النسب. التسلل N. النباتات benthamiana كما هو موضح أعلاه.
  2. التسلل N. النباتات benthamiana مع مزيج من اثنين ملي-Q-المخفف بالماء الأجرعية GV3101 الثقافات: الأولى تحمل البلازميد pBID4-HAC1 والثانية تحمل واحدة من المكثفات إسكات - P19 من TBSV أو P23 الحمضيات فيروس tristeza، في البلازميد pCassp ( pCassp19) وفي البلازميد ثنائي الموارد الوراثية النباتية تحت المروج 35S (PGR-P23)، على التوالي، في نسبة 4:1.

5. تحليل لطخة غربية

  1. جمع عينات عشوائية من أوراق N. benthamiana، N. نجارة أو N. النباتات excelsiana في 4-7 نقطة في البوصة ويطحنون في النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم.
  2. إضافة ثلاثة مجلدات من 1X العازلة PBS تحتوي على 0.5٪ تريتونX-100 على كل عينة.
  3. بلطف يهز العينات المستخرجة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. تدور استخراج لمدة 5 دقائق وجمع البروتين الكلي للذوبان في أنبوب إيبندورف نظيفة.
  5. يخفف من مقتطفات لتخفيف المناسبة (1:50 1:100) في برنامج تلفزيوني 1X العازلة الاستخراج، وإضافة 5 × عينة العازلة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [6.8 درجة الحموضة]، و 10٪ SDS، 0.5٪ برموفينول الأزرق، 50٪ الجلسرين ت / ت، و 500 ملي DTT) إلى النهائي 1 × التركيز.
  6. عينات يغلي لمدة 5 دقائق.
  7. البروتينات منفصلة بنسبة 10٪ SDS-PAGE، ونقل على غشاء نقل Immobilon-P، ومنع مع 0.5٪ I-كتلة.
  8. كشف GFP باستخدام الأرنب بولكلونل مكافحة GFP مصل في 1:5،000 وHAC1 باستخدام الماوس المضادة للبولي الحامض الاميني الأضداد وحيدة النسيلة في 1:1،000 في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة.
  9. بعد وضع العلامات الأجسام المضادة الأولية، وغسل الأغشية ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منها 1 × PBST-20 واحتضان مع البيروكسيداز الفجل (HRP)، مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في 1:5،000 أو HRP-المتقارنةد الأضداد المضادة للماوس في 1:10،000 لمدة 1 ساعة، والكشف عن GFP HAC1، على التوالي.
  10. معالجة البقع الغربية باستخدام الركيزة SuperSignal الغربية بيكو Chemiluminescent.
  11. استخدام البرنامج لتحليل شدة GeneTools الفرقة من البروتين والحصول على الفرقة كمية معايرة.

إنتاج البروتين: (معايرة كمية X التخفيف من العينة) / كمية العينة تحميل) × 4 = ملغم / كغم.
المعادلة: إنتاج البروتين (P)، وكمية معايرة (C)، التخفيف من العينة (D) و (S) كمية عينة تحميلها.

6. Zymogram الفحص

  1. N. جمع pBID4-LicKM تسللت- benthamiana أنسجة عشوائية العينات.
  2. استخراج البروتينات باستخدام نفس الأساليب المذكورة أعلاه لتحليل لطخة غربية ثم تحليل بنسبة 10٪ SDS-PAGE مع 0.1٪ lichenan المدرجة في المواد الهلامية.
  3. بعد الكهربائي، وغسل المواد الهلامية مرتين لمدة 10 دقيقة في كل من غسل العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [درجة الحموضة 8.0] و 0.1٪ تريتون X-100)، ثم احتضان في غسل العازلة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. بعد الحضانة، وتجاهل غسل العازلة وصمة عار المواد الهلامية مع 0.5٪ الكونغو الأحمر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. شطف المواد الهلامية في المياه الملة، س ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما، وإضافة 1 M كلوريد الصوديوم لتصور النشاط lichenase. تم استخدام البروتين المنقى lichenase البكتيرية كعنصر تحكم إيجابية لنشاط انزيم.

7. التصوير GFP

  1. تنفيذ الكشف البصرية مضان GFP كليا النباتات تتحول عابر باستخدام الطول الموجي الطويل مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد.
  2. صورة تتحول عابر النباتات مع الكاميرا الرقمية من خلال صفراء 8، ES 52 فلتر (زمن التعرض، 15 ثانية).
  3. الحصول على الصور من لطخة غربية يحلل باستخدام برنامج GeneSnap على GeneGnome وتحديد النتائج باستخدام برنامج GeneTools، مع منحنى المعايرة على أساس معيار تنقية GFP.
  4. قياس البروتين HAC1 باستخدام منحنى المعايرة على أساس purifiإد HAC القياسية البروتين من سلالة A/Indonesia/05/05 من فيروس الانفلونزا.
  5. حساب متوسط ​​القيم 3-4 يعيد لجميع التجارب.

Representative Results

الاحتياجات الغذائية لنمو النبات. استخدام الزراعة المائية المتوسطة نمو النبات (الصوف الصخري) والمحلول المغذي يضمن توحيد N. النمو benthamiana ويزيل التعقيدات (الميكانيكية والتنظيمية والكفاءة) المرتبطة باستخدام التربة لزراعة النباتات. نحن نمت N. benthamiana على ألواح الصوف الصخري غارقة في الأسمدة المتاحة تجاريا لتحديد الظروف المثلى لنمو النبات وتراكم الكتلة الحيوية. لاحظنا 95-100٪ إنبات البذور. ينبغي للمرء أن يلاحظ أن الفوسفور بما في ذلك أمر بالغ الأهمية لتحقيق إنبات، لأننا وجدنا أن المحلول المغذي تفتقر إلى الفوسفور فشلت في دعم إنبات ونمو N. بذور benthamiana (الشكل 1A).

آثار النمو الأجرعية وسائل الإعلام تسلل على الإنتاج والصحة والبروتينات النباتية. لقد اختبرنا العديد من الشروط وسائل الإعلام لتحسين كفاءة رانه agroinfiltration تقنية لإنتاج على نطاق واسع. تم الانتهاء من زراعة البكتيريا (A. المورمة سلالة GV3101) إيواء بناء pBID4-GFP O / N في ظروف وسائل الإعلام المختلفة (YEB، LB أو AB)، وإما طرد وإعادة علقت في الحث المتوسطة (MMA) (تحتوي على 1 × Murashige و سكوغ [MS] بصل ملح خليط، 10 ملي زارة التربية والعلم ودرجة الحموضة 5.6، 20 جرام / لتر سكروز و 200 ميكرومتر acetosyringone) أو مخففة في الماء ملي-Q لA 600 0.5 قبل استخدام لتسلل النبات. لاحظنا أن فراغ تسلل النباتات مع البكتيريا المخفف في الماء أدى إلى إنتاج البروتين مماثلة لتلك التي تحققت مع أي وسيلة إعلامية تسلل في تقارير سابقة 42،48. في المقابل، أدى تسلل مع Agrobacteria مخفف تزرع في YEB أو LB سائل الإعلام في ذبول كاملة من N. benthamiana يترك في أقل من 24 ساعة تسلل آخر، في حين كان Agrobacteria مخفف نمت في المتوسط ​​AB أي تأثير على صحة النباتات تسلل (داتليست معروضة). كما هو موضح في الشكل 1B، والنباتات تسللت مع الثقافات الأجرعية تزرع في YEB، LB أو AB وسائل الإعلام والمخفف بالماء ملي-Q (1:5، A 600 من 0.6-0.8 أو 1:10، وهناك 600 من 0.3-0.4) أظهرت عرضت أي أعراض وبمتوسط ​​إنتاج GFP 1645 1520 و 1839، على التوالي. Agrobacteria طرد وإعادة علقت في الحث المتوسطة (MMA) لم تظهر أي أعراض ويوجد فرق كبير في إنتاج البروتين مقارنة Agrobacteria المخفف مباشرة في الماء ملي-Q ( 1671 ± 102 و 1667 ± 131 ملغ / كغ، على التوالي). لذلك، ينصح باستخدام المياه الملة، س لتمييع الثقافات الأجرعية للتسلل النبات واستخدمت بشكل روتيني في تجارب لاحقة لدينا لتحقيق A 600 0.5.

آثار الكثافة الأجرعية خلية التعليق وبالطبع الوقت على التعبير الهدف. درسنا القادم اذا كثافة الخلية البكتيريةيؤثر على كفاءة عمليات التسلل ومستويات التعبير الهدف. لهذا الغرض، قمنا بتقييم أربعة مختلفة الكثافات تعليق خلية من الأجرعية تحمل pBID4-GFP، A 600 1.0، 0.5، 0.1 و 0.05. بعد تسلل، N. تم رصد النباتات benthamiana للتنمية أعراض واضحة وبالطبع الوقت التعبير الهدف من خلال جمع عينات في 4 و 7 و 10 نقطة في البوصة. عند 4 نقطة في البوصة، لاحظنا اختلافات ملحوظة في GFP مضان بين النباتات تسلل مع مختلف الكثافات تعليق خلية من الأجرعية (لم يلاحظ أي التعبير GFP في A 600 من 0.05). في 7 نقطة في البوصة، وكان GFP مضان مماثلة في محطات تسلل بكثافة تعليق خلية من A 600 1.0، 0.5 و 0.1، ولكن كان أقل في النباتات تسلل في لA 600 0.05. كما هو مبين في الشكل 1C، تم تأكيد هذه البيانات من قبل لطخة غربية تحليل العينات التي تم جمعها في 4 نقطة لكل بوصة، والتي تبين الإنتاج المنخفضة جدا في البروتين A 600 600 من 1.0 (1739 ملغ / كلغ). في 7 نقطة في البوصة، وأظهرت النباتات فروق ذات دلالة إحصائية في الإنتاج تقدر ب GFP A 600 1.0، 0.5 و 0.1 (1،662، 1،870 و1،890، على التوالي)، في حين أظهرت 600 من 0.05 انخفاض الإنتاج GFP (1،199 ملغ / كلغ). في المقابل، في 10 نقطة في البوصة لوحظ عدم وجود فروق في الإنتاج GFP بين النباتات تسللت مع أي من أربعة الكثافات تعليق خلية (1،218، 1،181، 1،197 و1،304).

تسلل مع سلالات بديلة للالأجرعية. لزيادة تنوع سلالات الأجرعية المتاحة للإنتاج البروتين عابرة، ونحن اختبار البرية من نوع يعزل. هذه السلالات، معزولة عن تاج المرارة الجنود الطبيعية، وقدمت من قبل الدكتور التفضل Gelvin (جامعة بوردو، وست لافاييت بولاية انديانا). لدراسة فائدتها في إنتاج البروتين عابرة، ونحن تسلل N. benthamiana مع السلالات التالية كاريينغ pBID4-LicKM 18: أ. rhizogenes (A4) و أ. المورمة البرية من نوع نستر سلالات A348، A208، A281 و(اسمه AT6، AT10، وAt77، على التوالي)، فضلا عن سلالات مختبر هندستها من A. المورمة GV3101، C58C1، وLBA4404. تم جمع الأوراق تسللت في 7 نقطة في البوصة وقدرت مستوى LicKM التعبير من خلال طخة فحص الغربية. كما هو مبين في الشكل 2A، وهو أعلى مستوى الإنتاج LicKM لا يمكن أن يتحقق مع سلالات GV3101، A4 وLBA4404 (~ 1،750 ± 163، 1،650 ± 1،450 ± 26 و 117 ملغم / كغم، على التوالي)، مع اختلافات طفيفة؛ أدنى مستوى التعبير (~ 900 ± 102 ملغ / كغ) مع C58C1؛ وإنتاج وسيطة مع AT6، AT10 وAt77 (~ 1،250 ± 19، ± 42 1،100 و 1،200 ± 111 ملغ / كغ، على التوالي). وقد تجلى هذا النشاط الأنزيمي lichenase باستخدام Zymogram الفحص. ويبين الشكل 2B التي lichenase تنتج في الأنسجة النباتية تسلل باستخدام أي منكان سلالات الأجرعية نشط إنزيمي. ينبغي للمرء أن نلاحظ أيضا أن النباتات benthamiana N. تسللت مع A4 وAt77 سلالات أظهرت الأعراض المرضية (التقزم، واستطالة سويقات والشباك، ورقة الشباك)، في حين يجهد مع AT10 كانت الأعراض خفيفة. لم يلاحظ أي أعراض في محطات benthamiana N. تسللت مع سلالة المختبر GV3101 (الشكل 2C).

تسلل الأنواع نيكوتيانا البديلة. قارنا معدلات توليد الكتلة الحيوية وإنتاج البروتين في اثنين من الأنواع البرية من نوع من جنس نيكوتيانا (N. benthamiana N. ونجارة) وفي الأنواع الهجينة، N. excelsiana (N. benthamiana N. × نجارة). من الأنواع اختبارها، N. benthamiana، مجموعة تستخدم على نطاق واسع لإنتاج البروتين عابرة باستخدام نظم التعبير المستندة إلى الأجرعية أو بناء الفيروسي 2،34،49، تصل استعداد تسلل في غضون 4-5 أسابيع من الإنبات. فترة النمو اللازم لتوليد المستوى الأمثل من الكتلة الحيوية هو أيضا 4-5 أسابيع لN. excelsiana لكن أطول (6-7 أسابيع) لN. نجارة. بالإضافة إلى ذلك، السلاميات محطة قصيرة نسبيا لN. نجارة بالمقارنة مع الأنواع الأخرى نيكوتيانا.

وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن تسلل الفراغ من N. وbenthamiana N. excelsiana في 50-250 م بار لمدة 60 ثانية هو ذات كفاءة عالية لagroinfiltration من أوراق كامل، في حين N. نجارة يصعب التسلل نتيجة لانخفاض مظلة ومصنوع من الجلد أوراقها، حتى عندما تم تطبيق فراغ ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة في كل وجود السطحي غير الأيونية مثل Sillwet-77 أو S240. أيضا، فإن معدل إنبات N. excelsiana وN. كان البذور نجارة ~ 40-50٪؛ من أجل زيادة معدل الإنبات إلى 90-100٪، ويجب أن يعامل البذور مع 10٪ bleaالفصل لمدة 1 ساعة قبل البذر. في ظل ظروف النمو نفسه، وهو أعلى ورقة الكتلة الحيوية التي يمكن أن تتولد من N. excelsiana ما يقرب من اثنين أضعاف مقارنة مع N. benthamiana (الجدول 1).

تم فحص إنتاج البروتين في N. benthamiana، N. نجارة وN. excelsiana تسللت مع سلالة GV3101 الأجرعية إيواء pBID4-GFP. تم تقييم تراكم GFP في 7 نقطة في البوصة في الأوراق تسلل كله باستخدام الأشعة فوق البنفسجية يليه تحليل لطخة غربية. ويبين الشكل 3A حتى توزيع GFP في N. وbenthamiana N. excelsiana والتوزيع غير المتكافئ في N. نجارة (نظرا لصعوبة اختراق منطقة نبات بأكمله من N. نجارة). ويبين الشكل 3B مستوى الإنتاج GFP يقدرها الأشعة فوق البنفسجية ضوء الإضاءة في الأوراق تسللت التي تم جمعها من الأنواع الثلاثة نيكوتيانا في 7 نقطة في البوصة. وaccumu GFPكان مستوى الشكان العالي في N. benthamiana (~ 2.23 جم / كجم) مما كانت عليه في N. excelsiana وN. نجارة (~ 1.89 و 1.54 جم / كجم، على التوالي). انخفاض مستوى إنتاج البروتين في N. ويرجع ذلك إلى تسلل غير المتكافئة، وتوزيع GFP المتراكمة في ورقة جمع نجارة.

لاحظنا أن الأوراق العليا تتعرض مباشرة لضوء غالبا ما تظهر أقدم وأعلى مستويات تراكم GFP عابر (في 2-4 نقطة في البوصة) من الأوراق تحت المظلة. ومع ذلك، في دراساتنا، وكان تراكم GFP أعلى مستوى عند 7 نقطة في البوصة وكانت موزعة بالتساوي عبر معظم الأوراق، ما عدا في uninfiltrated أوراق المتزايد حديثا والتي لا تظهر أي تراكم GFP.

آثار الضغط فراغ والمدة في إنتاج البروتين عابرة. فراغ تسلل يزيد بشكل كبير من مستويات التعبير عابرة مقارنة مع الضغوط التي مورست عن طريق الحقن جنب مع حقنة needleless 42. تطبيقالفراغ يسبب غازات لاجلاء من محطة المغمورة يترك من خلال الثغور. عندما يتم كسر الفراغ والضغط يزيد بسرعة، هو الدافع وراء تعليق الأجرعية في الأوراق لاستبدال الغازات اجلاء 50.

لاختبار تأثير ضغط الفراغ على أوراق N. benthamiana، ونحن تسلل النباتات مع سلالة GV3101 الأجرعية إيواء pBID4-GFP تحت ضغوط الفراغ المختلفة (50-400 م بار) لمدة 30 أو 60 ثانية. وقد تبين أن الفراغ أقوى (أقل من 50 م بار) بطلب للحصول على 30 أو 60 ثانية في نتائج الأضرار الميكانيكية من أوراق تسلل، مما يؤدي إلى ذبول الأنسجة وموت النبات بعد وقت قصير من تسلل (24-48 ساعة). من ناحية أخرى، وتطبيق الفراغ أكثر اعتدالا (400 م بار) النتائج في تسلل 50٪ فقط من مساحة الورقة وانخفاض مستوى الإنتاج GFP (303 ± 90 ملغ / كلغ) (الشكل 4A). الأهم من ذلك، لاحظنا عدم وجود فروق في الإنتاج GFP تحت 50، 100 و 200 م بار (1،651 ± 107، 1،688 ± 40، ± 1،594 26 مغ / كغ، على التوالي) (الشكل 4A) ومعتدل للا، آثار ضارة على صحة النبات عند تطبيق الضغوط فراغ 50-200 م بار لمدة 30 أو 60 ثانية. لذلك، ينصح 50-100 م بار من الضغط فراغ لتجارب التسلل.

تم تقييم تأثير مدة الفراغ على التعبير الهدف عن طريق التسلل شقة واحدة من N. النباتات benthamiana كل ساعة مع A 600 0.5 من GV3101 إيواء pBID4 - GFP لمدة 8 ساعة في ثقافة الأجرعية نفسه ويبين الشكل 4B أن مستوى الإنتاج GFP كان مماثلا في كل مرة يشير يصل الى 8 ساعة، مما يشير إلى أن أكثر من هذا فترة من الزمن يحافظ على الأجرعية قدرتها على إطلاق الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل.

تأثير تحريض الكيميائية على إنتاج البروتين. بعض نواتج الأيض الفينول النباتية والسكريات يمكن أن دائرة الهجرة والجنسيةالجينات الفوعة فوسي من A. المورمة 1،52. ونتيجة لذلك، تم الإبلاغ عن العديد من المواد الكيميائية وmonosaccharaides لتعزيز إنتاج البروتين عابرة في الأنواع النباتية المختلفة. يضاف Acetosyringone الأكثر شيوعا لثقافات A. المورمة للحث على الاوبرون فير قبل agroinfiltration 40،53-57.

قمنا بتقييم تأثير تركيزات مختلفة من acetosyringone (0، 100، 200 و 400 ميكرومتر) والجلوكوز (0-4٪) على إنتاج البروتين GFP عابر في N. تسللت benthamiana مع سلالة GV3101 الأجرعية إيواء pBID4 - GFP. لهذا الغرض، ونحن إعادة علقت الخلايا الأجرعية في MMA وسائل الإعلام التي تحتوي على تحريض تركيز مختلفة من acetosyringone والجلوكوز لمدة 1-3 ساعة قبل التسلل. وفقا لنتائج كلا الملاحظة البصرية (لا تظهر البيانات) وتحليل لطخة غربية (الشكل 4C)، فإن أيا من التركيز اختبارمن هذه المركبات التي يسببها زيادة كبيرة في مضان GFP أو إنتاج البروتين مقارنة مع مراقبة وسائل الاعلام حيث الواردة الاستقراء لا acetosyringone أو الجلوكوز.

تأثير المشترك تسلل القامع إسكات على الإنتاج عابرة من GFP وHAC1 الجينات في N. benthamiana يترك، وقد أظهرت في وقت سابق ان وشارك في التعبير عن القامع إسكات (P19 من الطماطم الفيروس حيلة خطها [TBSV]) يتداخل مع إسكات الجينات في مرحلة ما بعد النسخي (PTGS)، مما أدى إلى تعزيز إنتاج البروتينات مراسل 34.

لدينا تقييم الأثر المشترك تسلل N. benthamiana مع ناقلات إطلاق تحمل الجين مراسل GFP (pBID4-GFP) وP19. قبل تسلل، وهناك 600 من التخفيفات 0.5 من A. الثقافات المورمة GV3101 إيواء pBID4-P19 GFP وكانت مختلطة على التوالي في نسب 1:1، 2:1، 3:01 و 4:1. اكسبرسوتمت السيطرة أيون من القامع إسكات من قبل المروج القرنبيط فيروس فسيفساء 35S. كما يتبين من نتائج تحليل لطخة غربية في 7 نقطة في البوصة (الشكل 5A)، فإن وجود P19 لا زيادة أو نقصان الإنتاج GFP في N. benthamiana، في أي نسبة من اثنين من تعليق الأجرعية.

لدينا أيضا مقارنة آثار اثنين من الجينات الفيروسية إسكات المكثفات - p23and P19 - بشأن منع PTGS لHAC1. كانت مخففة ثقافات الأجرعية تحمل إطلاق النواقل pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) واحد من اثنين إسكات الفيروسي البلازميدات القامع إلى A 600 0.5، وخلط في نسبة 4:1، على التوالي، و شارك تسللت-إلى N. 4-5 أسابيع من العمر benthamiana. A تعليق A. تم اختراق HAC1 وحدها كعنصر تحكم - المورمة تحمل pBID4. تم جمع عينات أوراق تسللت 3-8 نقطة في البوصة. كانت التجربة REPEated ثلاث مرات ومتوسط ​​مستويات التعبير HAC1 يحدده تحليل لطخة غربية.

كما هو موضح في الشكل 5B، وشارك في تسلل N. أدى benthamiana مع P23 أو P19 في (642 ± 157 و 764 ± 108 ملغ / كغ على التوالي) زيادة في الإنتاج مقارنة مع HAC1 باستخدام أي القامع إسكات (حوالي 15-25٪، على التوالي) في 6 نقطة في البوصة. هذا يشير إلى أن P23 P19 وتتسم بالكفاءة في نظامنا. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تراكم HAC1 وقعت في اليوم السابق عندما كان pBID4-HAC1 شارك تسللت مع P19. لذلك، نتائجنا تثبت أن آثار القامع P19 إسكات على HAC1 وتراكم GFP مختلفة، مما يشير إلى تعزيز انتقائية التعبير و / أو استقرار بعض البروتينات في N. عابرة benthamiana.

لاحظنا أيضا أن كلا في وجود وعدم وجود القامع إسكات مستوى البروتين همز HAC1 التي uction تراجع في 7 نقطة في البوصة. هذا يشير إلى أن توقيت انخفاض في إنتاج البروتين عابرة في N. benthamiana تسللت مع ناقلات الاطلاق محددة الهدف.

تم تقييم البنك خلية من الأجرعية إيواء ناقلات إطلاق كل عام لهدف الاستقرار الجيني، الأجرعية الجدوى ومستوى تراكم البروتين. وقد تبين الأسهم الجلسرين من بنك الخلايا من سلالة GV3101 تحولت مع pBID4-HAC1 التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية إلى أن تكون مستقرة جدا لأكثر من ثلاث سنوات دون تغييرات في مستوى إنتاج البروتين عابرة في N. اخترقتها النباتات benthamiana. يوضح الشكل 5C أن إنتاج البروتين HAC1 المقدرة من قبل النشاف الغربية في سنوات 2010، 2011، 2012 و 2013 كان 670، 685، 566 و 683 ملغم / كغم على التوالي. متوسط ​​الإنتاج HAC1 في N. كان النباتات benthamiana 651 ± 49.4 ملغم / كغم.

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الجدول 1
الجدول 1. مقارنة N. benthamiana N. وإنتاج الكتلة الحيوية النباتية excelsiana.

الشكل 1
الشكل 1. تحليل لطخة غربية في التعبير الجيني عابرة في N. benthamiana. (A) N. من العمر ستة أسابيع benthamiana 1) النباتات التي تنمو في حل الأسمدة التي تحتوي على الفوسفور 4.8٪ و 2) النباتات التي تنمو في حل الأسمدة التي تحتوي على الفوسفور 0٪. تم تحميل خمسة وعشرين ميكروغرام من جديد ما يعادل وزن ورقة في حارة (B) مقارنة الإنتاج GFP في النباتات فراغ تسللت مع pBID4-إيواء GFP الثقافات الأجرعية GV3101 نمت في ثلاث وسائل الإعلام المختلفة: YEB، AB وLB. GV3101 الثقافات نمت O / N في YEB أو تم طرد وسائل الإعلام LB بسرعة منخفضة وإعادة علقت في الحث المتوسطة (MMA) (الممرات: MMA-1 و 2-MMA، على التوالي)، أو نمت O / N في YEB، LB أو وسائل الإعلام AB والمخفف مباشرة إلى 1:05 أو 1:10 بالماء ملي-Q (الممرات: YEB / 5 وYEB/10؛ AB / 5 وAB/10؛ LB / 5 وLB/10) (C) مقارنة. التعبير GFP في 4 و 7 و 10 نقطة في البوصة التالية فراغ تسلل مع تركيزات مختلفة (A 600 من 1.0، 0.5، 0.1 و 0.05) من A. المورمة سلالة GV3101 تحمل pBID4-GFP.

الرقم 2
الشكل 2. مقارنة الإنتاج lichenase عابرة والنشاط التالية تسلل الفراغ من N. النباتات benthamiana مع diffeاستئجار سلالات Agrobacteria. ثقافات سلالات Agrobacteria (GV3101، A4، At77، C58C1، AT6، AT10 وLBA4404) إيواء ناقلات إطلاق مخترقة pBID4-LicKM بشكل فردي في أوراق N. benthamiana. تم جمع الأوراق تسللت في 7 نقطة في البوصة. (A) Lichenase الإنتاج كميا بواسطة النشاف الغربية. (B) Zymogram الفحص تبين إنتاج lichenase من خلال النشاط الأنزيمي. (C) تأثير الأجرعية (البرية من نوع A4، AT10، At77 وسلالة المختبر GV3101) تسلل على N. benthamiana الصحة النباتية في 7 نقطة في البوصة. تم تحميل خمسة وعشرين ميكروغرام من جديد ما يعادل وزن الورقة في الممر.

الرقم 3
الرقم 3. عابر GFP التعبير في أوراق N. benthamiaغ، N. excelsiana وN. اكسلسيور في 7 نقطة في البوصة بعد فراغ تسلل مع أ. المورمة إيواء إطلاق النواقل pBID4 - GFP. (أ) الفحص البصري للGFP التعبير تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. (B) تحليل لطخة غربية من تراكم GFP.

الرقم 4
الشكل 4 (أ) آثار الضغط فراغ عابرة على التعبير GFP والصحة النباتية. N. وقد تسلل النباتات benthamiana مع pBID4 - GFP تحت ضغوط الفراغ من 400، 200، 100 أو 50 م بار، في فراغ عقد الساعة 30 أو 60 ثانية (B) الاستقرار والعدوى من A. المورمة في N. تسللت benthamiana مع الأجرعية GV3101 إيواء pBID4-GFP تزرع في AB المتوسطة والمخفف إلى A 600 0.5. Agroiتم إجراء nfiltration بواسطة التسلل شقة واحدة من N. النباتات benthamiana كل ساعة في نفس الثقافة المخفف الأجرعية (الممرات 0-8). (C) تأثير تركيزات مختلفة من acetosyringone والجلوكوز على التعبير عابرة من GFP. سلالة GV3101 الأجرعية إيواء pBID4 - كانت تزرع GFP O / N في وسائل الإعلام YEB، طرد ومعلق إلى A 600 0.5 إما في MMA تحتوي على 2٪ الجلوكوز مع acetosyringone في 0، 100، 200 أو 400 ميكرومتر، أو في مجلس العمل المتحد تحتوي على 200 ميكرومتر acetosyringone مع الجلوكوز في 0، 1، 2 أو 4٪. وأبقى تعليق الأجرعية لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل التسلل.

الرقم 5
الرقم 5. آثار إسكات المكثفات على إنتاج البروتين عابرة في N. benthamiana يترك. (A) تحليل لطخة غربية من البروتين GFP التالية المشترك تسلل pBID4-GFP وP19 في نسب مختلفة. العينات التي تم جمعها في 7 نقطة في البوصة (25 ميكروغرام من جديد ما يعادل وزن الورقة تم تحميلها في حارات). (B) ثقافة الأجرعية تحمل pBID4-HAC1 كانت مختلطة بشكل فردي في نسبة 4:1 مع ثقافة تحمل P19 أو P23 إسكات القامع البلازميدات. تركيبات الناتجة من الثقافات الأجرعية تم الفراغ تسللوا الى النباتات. تم جمع الأنسجة تسلل من HAC1 يوميا ما يصل إلى 8 نقطة في البوصة للالمؤتلف البروتين الكمي. (C) الاستقرار من بنك الخلايا الأجرعية. وقد تسلل النباتات مع نفس الدفعة من بنك الخلايا الأجرعية كل عام لتقييم تراكم البروتين. تم تحميل خمسين ميكروغرام من جديد ما يعادل وزن الورقة في الممر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الهو الرقم.

Discussion

في هذه الدراسة، وقد وضعنا بروتوكولا agroinfiltration بسيطة لإنتاج البروتين روتينية عابرة في الأنواع نيكوتيانا المحدد باستخدام سلالات الأجرعية تحمل ناقلات الاطلاق. بالإضافة إلى ذلك، حددنا الظروف المثلى لتحقيق أعلى مستوى إنتاج البروتين المؤتلف في نظام التعبير عابرة لدينا مصنع.

فراغ تسلل من المخفف A. المورمة سلالة GV3101 إيواء pBID4 متجه إلى إطلاق N. benthamiana، N. أدى excelsiana وN. نجارة في مستويات أعلى من إنتاج البروتين الهدف في 7 نقطة في البوصة بالمقارنة مع الأنواع النباتية الأخرى، مثل بيسوم ساتيفوم تسللت مع GV3101 إيواء البرسيم فيروس موزاييك - موزاييك الخيار أو ناقلات القائم على فيروس التعبير عن الجينات مراسل GFP تحت المروج 35S 41، أو خس ساتيفا، مغد lycopersicum ونبات الأرابيدوبسيس thaliana تسللت مع سلالة C58C1 من A. المورمة تحمل بيتا غلوكورونيداز مراسل الجين 57. N. وbenthamiana N. كان من السهل التسلل إلى فراغ في 50 م بار لمدة 30-60 ثانية، مع 90-95٪ كفاءة تسلل excelsiana. لم يكن تسلل المتبقية 5-10٪ من مساحة الورقة العائمة بسبب بعض الأوراق على سطح تعليق الأجرعية خلال تطبيق فراغ. منذ إطلاق ناقلات لديه القدرة على الخلية الى خلية حركة 18، يحدث تراكم البروتين عابرة في الأوراق بأكملها وكذلك أعناق في 7 نقطة في البوصة. في 10 نقطة في البوصة، وكان إنتاج GFP يقدر أقل قليلا لأن pBID4 التعبير ناقلات قادرة على الانتقال من خلية إلى أخرى ولكن ليس بشكل منتظم لنقل 18؛ لذلك، يترك نمت حديثا لا تحتوي على النواقل ولا تسهم في إنتاج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، تدهور البروتين المؤتلف مع مرور الوقت مالمنعم يوسف تسهم في خفض مستوى البروتين في 10 نقطة في البوصة. أظهرت نتائجنا أن تسلل من A. مستويات عالية المورمة سلالة GV3101 بوساطة من إنتاج البروتين عابرة في N. benthamiana. وعلاوة على ذلك، والبروتين المستهدف يمكن هندستها كما N-المحطة، اندماج C-محطة أو داخلية لlichenase (LicKM)، β-1 ،3-1 ،4-glucanase، وهو انزيم بالحرارة من كلوستريديوم thermocellum ويمنح صمود للحرارة لهدف العديد من انصهار بروتين 18. تسلل N. benthamiana مع أ. المورمة من نوع البرية سلالات (AT6، AT10 وat77) بايواء الجينات في المصالح أثارت خفيفة أو شديدة الأعراض: الشباك ورقة، سويقات استطالة، والشباك. لم يلاحظ أي أعراض مرضية في N. تسللت benthamiana مع GV3101 سلالة المختبر إيواء فارغة pBID4 ناقلات، في حين أن بعض الجينات إدراجها في pBID4 وتحويلها إلى المختبر سلالات GV3101، C58C1 أو LBA4404 أثارت ردود نخرية خفيفة ورقةالاخضرار / اصفرار الأعراض في المناطق تسللوا من الأوراق. وقد تم الإبلاغ عن الأعراض التي تسببها نخرية من نوع البرية سلالات الأجرعية أو نزع سلاحها في النباتات باذنجاني سابقا 56،57. استجابة نخرية يمكن أن تنجم عن عوامل الفوعة للنظام إفراز النوع الثالث، والبروتينات البكتيرية نقلها إلى الخلية النباتية من قبل النظام إفراز النوع الرابع، و / أو حساسية لفلاجيلين 58-60. لقد وجدنا أن إنتاج عابرة للبروتينات مغاير يمكن أيضا انتزاع الإمراضية واستجابة شديدة الحساسية في مصنع تسلل يترك. وذكرت العديد من الباحثين أن agroinfiltration من الأنواع النباتية المختلفة مع ناقلات مصنع ثنائي تنتج ما يصل الى مستويات أعلى 5-20 مرات من إنتاج البروتين عابرة بالمقارنة مع محطات تحويل ثابت 28،57. بياناتنا تظهر أن N. تسللت benthamiana مع GV3101 إيواء pBID4-GFP مستويات عالية أعرب عابر من GFP، الذي يشبه إلى العائد GFP ذكرت لN. benthamiana تسللت مع Agrobacteria تحمل ناقلات فيروسية بيش-GFPSYS (ما يصل الى 80٪ من البروتين الكلي للذوبان) 44. أدى Agroinfiltration باستخدام ناقلات إطلاقنا في إنتاج عالية من البروتين LicKM بالحرارة، و 50 أضعاف أعلى من تلك التي لوحظت باستخدام البلازميد ثنائي معيار 18.

لاختبار العدوى من A. المورمة واستقرار ناقلات إطلاق، ونحن تسلل شقة واحدة من N. benthamiana كل ساعة لمدة تصل إلى 8 ساعات باستخدام نفس الملة-Q ثقافة المخفف بالماء من GV3101 بايواء البلازميد pBID4-GFP. وأظهرت البيانات المتوفرة لدينا أن سلالة GV3101 يصبح معديا بكفاءة لا يقل عن 8 ساعة وpBID4 (ناقلات الإطلاق) مستقرة جدا خلال لمدة ساعة تسلل 8.

وقد تبين الأسهم الجلسرين من سلالة GV3101 إيواء إطلاق النواقل pBID4-HAC1 (بنك الخلايا) تخزينها في -80 درجة مئوية إلى أن تكون مستقرة جدا لمدة ثلاث سنوات من دون تغيير في المتواجد عابرةفي الإنتاج في مصانع تسلل.

كانت النباتات benthamiana N. نمت في ظل ظروف مثلى وبين 35 و 42 يوما بعد البذر الأمثل للفراغ بوساطة تسلل عابرة التعبير الجيني 40. النباتات الأصغر سنا (3-4 أسابيع من العمر) لا يمكن أن تسلل كليا بسبب أوراق تطفو على السطح تعليق خلية وتلف الأنسجة من آثار الميكانيكية تطبيق فراغ. في النباتات يزيد عمرها عن 45 يوما، N. benthamiana انشقاقه المرحلة، في ظل ظروف الإضاءة الأمثل المستخدمة، ومستوى التعبير عابرة منخفضة.

ومن المعروف أن مركبات الفينول منخفضة الوزن الجزيئي (acetosyringone) وmonosaccharaides (الجلوكوز) للحث على جينات فير في A. المورمة 55،61. علاوة على ذلك، تسلل N. عرضت benthamiana مع ناقلات pCAMBIA ثنائي (GFP) في وجود acetosyringone في تركيزات 50-600 ميكرومتر إلى زيادة طفيفة عابرة التعبير الجيني 40. درسنا تأثير تركيزات مختلفة من acetosyringone والجلوكوز في نظامنا بإضافة هذه المركبات على الثقافات GV3101 إيواء pBID4-GFP في مجلس العمل المتحد لمدة 3 ساعة، ويوجد فرق في GFP التعبير. ومن المثير للاهتمام، والثقافات GV3101 إيواء pBID4-GFP والمخفف في الماء الملة، س إلى 600 ألف من 0.5 وتسللوا من دون تحريض فير الجينات وأعرب نفس الكميات من GFP مثل تلك تسللت مع الثقافات التي يسببها. ألف المورمة فير الجين (ق) من المحتمل أن يسببها المركبات النباتية الفينول (حامض acetosyringone وsinapinic) وmonosaccharaides النبات (الجلوكوز والفركتوز) موجودة في الأنسجة ورقة. لذلك، نحن التكهن بأن مستويات مماثلة من التعبير GFP في وجود أو عدم وجود محرضات خارجية فير الجينات قد يكون نتيجة لتأثير حشوية فير محرضات الجينات موجودة أثناء النسخ المتماثل للتعبير عن GFP إطلاق النواقل في الخلايا النباتية.

= "jove_content"> من نوع البرية N. وقد استخدم benthamiana كمضيف نموذج لإنتاج البروتين عابر 49. ومع ذلك، منخفضة نسبيا العائد الكتلة الحيوية N. benthamiana 'ق يعيق تطبيقها لإنتاج على نطاق واسع من البروتينات المؤتلف. المضيف الأمثل ينبغي أن تجمع بين مستوى عال من التعبير عابرة، والنمو سهلة في الاحتباس الحراري، وتكون عرضة للالأجرعية تسلل 2. لتحديد مضيف البديلة، ونحن تسلل اثنين من مختلف الأنواع البرية من نوع من نيكوتيانا (N. benthamiana N. ونجارة) وN. الهجين excelsiana (N. benthamiana N. × نجارة) مع أ. المورمة سلالة GV3101 بايواء البلازميد pBID4-GFP. من بين هذه الأنواع الثلاثة، كان مستوى التعبير GFP أعلى قليلا في N. benthamiana. N. أظهرت النباتات نجارة صعوبة في فراغ agroinfiltration بسبب أوراقها مصنوع من الجلد، وN. excelsianaأنتجت ما يقرب من شقين أكثر الكتلة الحيوية تحت ظروف النمو نفسه. إنتاج عابرة من GFP في 7 نقطة في البوصة مشابه نسبيا في N. وbenthamiana N. excelsiana. لذا، N. excelsiana قد يكون المضيف أكثر ملاءمة لإنتاج البروتين المؤتلف.

إنتاج البروتين عابرة بوساطة الأجرعية محدودة بسبب PTGS 26، والتي يمكن التغلب عليها من خلال المشاركة في التعبير عن الجينات إسكات المكثفات من أصل 62 محطة الفيروس. وقد تم إنتاج البروتين عابرة أظهرت في وقت سابق إلى أن يتعزز 50 أضعاف في وجود البروتين P19 من TBSV، الذي يثبط PTGS في الأنسجة تسلل 34. في دراستنا، قمنا بتقييم تأثير اثنين من المكثفات إسكات الفيروسي (P19 P23 و) بشكل منفصل شارك تسللت مع إطلاق النواقل pBID4-HAC1. يبدو للتسلل المشارك لهذه المكثفات إسكات أن يكون لها تأثير يذكر على التعبير عابرة من HAC1، مع زيادة طفيفة فقط في HAC1تراكم البروتين (15-25٪) في وجود P23 المشارك تسلل أو P19. أن تؤثر بشكل إيجابي إنتاج البروتين، قد تحتاج المكثفات إسكات التي سيتم اختيارها خصيصا لتكون فعالة لأنواع النباتات المستهدفة وناقلات فيروسية 63. TMV helicase ديه القامع للنشاط الحمض النووي الريبي إسكات 64،65. تؤكد البيانات المتوفرة لدينا هذه الملاحظة كما أسفر التعاون تسلل P23 أو P19 مع pBID4-HAC1 في أي زيادة في GFP أو زيادة طفيفة في إنتاج البروتين HAC1 عابرة.

في الختام، قمنا بتعديل وتحسين النبات وظروف النمو الأجرعية وتحسين كفاءة فراغ تسلل. مكنتنا هذه التكنولوجيا في النمو واختراق مئات الكيلوغرامات من المواد النباتية في غضون ساعات قليلة. نحن الآلي بنجاح المصنع تقنية التعبير عابرة لإنتاج لقاح الإنتاجية العالية على المستويات الصناعية تحت ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) الظروف. لمزيد من المعلومات ابوالتحرير التشغيل الآلي والاستفادة من نظام الإنتاج عابرة البروتينات النباتية لإنتاج البروتينات المؤتلف، بما في ذلك اللقاحات المرشحة الوحيدات، في ظل ظروف المركب، ويشار إلى القراء لموقع www.fhcmb.org/ .

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مركز فراونهوفر الولايات المتحدة الأمريكية للتكنولوجيا الحيوية الجزيئية، iBio، وشركة وكالة مشاريع أبحاث الدفاع المتقدمة (منحة # HDTRA1-07-C-0054). والكتاب يعترف الهدايا السخية من قبل الدكاترة. ستانتون Gelvin من قسم علوم البيولوجية، جامعة بوردو (الأجرعية المورمة سلالات) وواين فيتزموريس على نطاق واسع الأحياء كورب (بذور excelsiana N.)، وكذلك جينيفر نيكلسون من الولايات المتحدة نيكوتيانا جمع وجامعة ولاية نورث كارولينا (N. بذور نجارة ). المؤلفين أشكر مارغريت Shillingford وكريستوفر هال لتوفير النباتات والمساعدة التقنية الممتازة. أشكر الكتاب أيضا الدكاترة. ستيفن Streatfield وناتاشا كوشنير للمساعدة التحرير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Tags

علم الأحياء النباتية، العدد 86، Agroinfiltration،
الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V.,… More

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter