基于真空浸润土壤杆菌携带发射向量( 烟草花叶病毒为基础)是一种快速和经济的方法来生产疫苗抗原和治疗性蛋白质的瞬态蛋白生产中烟草属植物。我们简化了程序,并通过优化细菌培养的条件,在选择宿主物种,并同时引入的RNA沉默抑制改善目标的积累。
农杆菌介导的瞬时蛋白质的生产在植物中是有前途的方法,以一个短的时间周期内产生的疫苗抗原和治疗性蛋白质。然而,这项技术才刚刚开始被应用到大规模生产尽可能多的技术障碍,以扩大目前正在克服。在这里,我们展示了工业规模的瞬态蛋白生产简单,重复性好方法基于烟草植株农杆菌携带发射向量的真空渗透。 农杆菌培养的AB培养基的优化可直接稀释细菌培养在Milli-Q水的,简化的渗透过程。其中烟草 , 北三个品种测试excelsiana(烟草本塞姆氏×N.刨花 )被选定为最有希望的宿主,由于易于渗透,高级别报告蛋白的生产,和大约2-F在受控环境条件下老更高的生物量产生。诱导农杆菌窝藏pBID4-GFP( 烟草花叶病毒为主),使用化学物质,如乙酰丁香酮和单糖对蛋白质的生产水平没有影响。在50至100毫巴,30或60秒浸润植物导致植物叶组织中约95%的浸润。浸润土壤杆菌实验室菌株GV3101中表现出最高的蛋白质的生产相比, 土壤杆菌实验室菌株LBA4404和C58C1和野生型农杆菌菌株AT6,AT10,at77和A4。共表达的病毒RNA沉默抑制,P23或P19,在北本生导致早期靶蛋白(流感病毒血凝素)的积累和产量增加(15-25%)。
植物现在被确认为用于生产异源重组生物制药和工业蛋白1-3安全,可靠,可扩展的和廉价的平台,有超过微生物和动物细胞表达系统4个重要的优点。植物能够表达正确折叠的蛋白质与翻译后修饰,包括组装的多聚体抗体5-7。几种植物来源的重组药用蛋白正在接受临床评估8。在这些患者特异性重组基因型疫苗(抗体)对非霍奇金淋巴瘤9,血凝素为基础的大流行和季节性流感候选疫苗10,11(Cummings 等人 ,提交给疫苗),抗链球菌表面抗原Ⅰ的治疗/ II抗体,用于治疗龋齿12的,与人胰岛素的糖尿病13的治疗。此外,人类的RECOmbinant葡糖脑苷脂酶的患者Gaucher病的酶替代疗法已被批准在以色列和美国,而根据扩大使用计划提供了美国14,15之外。
异源蛋白可以在稳定转化的(转基因或叶绿体转)或瞬时转化的植物来生产。瞬态蛋白生产提供了在转基因植物,包括短的时间内实现表达和积累16对生产许多优点,并且可以通过引入细菌二元载体或重组植物病毒载体导入植物组织4来实现。最先进的瞬时表达系统是基于使用的“发射矢量”相结合的植物病毒和二元质粒的组件,并通过农杆菌渗入17,18交付。基于烟草花叶病毒 (TMV)发射载体农杆菌已成功应用在实验室规模生产疫苗抗原对病原体如人类乳头状瘤病毒19, 鼠疫耶尔森氏菌 20,流感病毒21,22, 炭疽杆菌 23,并在北天花病毒24 本塞姆氏叶。 农杆菌介导的瞬时表达也是一种很有前途的方法,同时生产多种蛋白质2,25-27的。例如,植物瞬时表达系统已被用于产生肿瘤特异性的重组抗体28,29,针对表皮生长因子受体30糖基化的重组抗体,并具体针对炭疽保护性抗原31,32的单克隆抗体。共浸润与靶基因和基因沉默的结果在增强靶蛋白表达33,34抑制基因本氏烟植物。
农杆菌是用于均匀introdu的常用方法庆安细菌窝藏感兴趣的基因导入植物组织35-37。 农杆菌真空渗透在完整植物瞬时基因表达的叶子是一种快速,可扩展的和有用的方法用于生产外源蛋白质,而不需要产生的转基因植物38-41。在真空农杆菌,植物翻转倒过来,地上部分淹没在农杆菌悬浮液。然后抽真空,使气体从叶片细胞间隙通过气孔撤离。真空结果在农杆菌悬浮液进入叶子的输注快速重新加压下释放。以下农杆菌真空渗透,植物栽培进一步和目标的表达进行监测。目标表达的最高水平,通常观察到2-3天发表浸润(dpi)的一个二进制向量和4-7 dpi,采用一个发射向量,在这之后的表达水平通常decreaSES 17,18,42-45。 农杆菌是最广泛使用的车辆递送感兴趣的基因导入植物的蛋白质产量。农杆菌工作非常出色的全本生但相对较差,在大多数其他植物,包括拟南芥46。
在这项研究中,我们在5-6周龄北路开发的瞬态蛋白生产一种简单,高效,经济的方法A.使用本生农杆菌浸润。工业尺度的农杆菌渗入法的主要缺点是收获的细菌和含4'-羟基-3的细菌沉淀在培养基中再悬浮的离心',5'-二甲氧基苯乙酮(乙酰丁香酮),单糖,以及2 – (N-吗啉代) -乙磺酸(MES)缓冲液诱导vir基因。我们已经能够通过优化农杆菌来克服这些问题</em>的生长在AB培养基(基础培养基),然后直接稀释于Milli-Q水中并通过控制渗透时间和条件。我们还比较了目标蛋白质的生产中,野生型烟草宿主物种N。本生和N。木丝 ,以及在混合N。 excelsiana。
在这项研究中,我们已经开发了一个简单的农杆菌协议,用于日常的瞬态蛋白生产中使用农杆菌株携带发射向量选择的烟草属物种。此外,我们已经确定了最佳工艺条件,以实现我们的短暂的植物表达系统中的最高重组蛋白的生产水平。
稀释后的A的真空渗农杆菌菌株GV3101窝藏推出矢量pBID4到N。本生,N. excelsiana和N精益求精导致于7 dpi的更高水平的目标蛋白质的生产相对于其他植物物种,如豌豆渗入了GV3101窝藏苜蓿花叶病毒 -或黄瓜花叶下的35S启动子表达GFP报告基因的病毒为基础的载体41,或莴苣 , 龙LYCO梭梭和拟南芥渗透与A的C58C1应变农杆菌携带β-葡萄糖醛酸酶报告基因57。N.本生和N。 excelsiana很容易真空渗透在50毫巴30-60秒,用90-95%的渗透效率。由于叶片的应用真空过程中土壤杆菌悬浮液的表面上的一些浮叶面积的其余5-10%的未渗透。自启动向量具有对细胞至细胞的运动能力18,瞬态蛋白积累发生在整个叶片以及叶柄在7 dpi的。在10 DPI时,估计的GFP产量略低,因为pBID4表达载体是能够从单元格之间移动,但不能对全身18移动;因此,新长出来的叶子不包含向量,不利于生产的目标。此外,重组蛋白质的降解随着时间的推移米唉有助于降低蛋白水平在10 dpi的。我们的研究结果表明,A的那个渗透根癌农杆菌菌株GV3101介导的高水平的瞬态蛋白生产中N的本塞姆氏 。此外,靶蛋白可以被设计为N-末端,C-末端或内部融合到地衣多糖(LicKM),β-1 ,3-1,4 -葡聚糖,这是从热纤维梭菌的热稳定性酶和赋予热稳定性的许多目标蛋白融合18。 N的渗透本生与甲根癌农杆菌野生型菌株(AT6,AT10和at77)窝藏感兴趣的基因引起轻度或重度症状:叶片卷曲,叶柄伸长率和卷曲。没有病理症状N.观察本生渗透与实验室菌株GV3101窝藏空pBID4载体,而另一些基因插入pBID4并转化为实验室菌株GV3101,C58C1或LBA4404引起轻度坏死反应和叶绿/叶的渗透区域泛黄的症状。造成的野生型农杆菌或茄科植物解除菌株坏死症状先前已经报道56,57。坏死的反应,可能会导致从III型分泌系统,由IV型分泌系统转移到植物细胞中的细菌蛋白质,和/或敏感性鞭毛58-60的毒力因子。我们已经发现,短暂的生产异源蛋白质也可以引起致病性和在渗透植物超敏反应离开。许多研究报道不同的植物种类与产能达到5-20倍更高水平的瞬态蛋白生产相比,稳定转化的植物28,57植物双元载体的农杆菌。我们的数据显示, 全本塞姆氏烟草渗入了GV3101窝藏pBID4-GFP瞬时表达高水平的GFP,其类似于报告的GFP产量的本塞姆氏烟草渗入了土壤杆菌携带PICH-GFPSYS病毒载体(高达80%的总可溶性蛋白)44。使用我们的发射载体农杆菌导致高生产的耐热蛋白LicKM的,50倍高于使用标准二进制质粒18观察。
为了测试A的感染力根癌农杆菌和发射矢量的稳定性,我们渗透N的一个平本塞姆氏每隔一小时使用GV3101的相同的Milli-Q水稀释的培养窝藏pBID4-GFP质粒高达8小时。我们的数据表明,GV3101菌株有效地感染性至少8小时,pBID4(发射向量)是非常稳定的8小时之久的渗透过程。
GV3101菌株窝藏保存在-80℃下推出的矢量pBID4-HAC1(细胞库)的甘油股票已被证明是非常稳定的三年没有变化的瞬态保护制服在生产中渗入植物。
最佳条件和天后播种42之间35和下生长的烟草本塞姆氏植株最适用于真空浸渗介导的瞬时基因表达40。年轻的植物(3-4周龄)不能完全是因为树叶漂浮在细胞悬液表面和施加真空的机械效应组织损伤的渗透。在年龄超过45天, 全厂本塞姆氏抽苔阶段中,使用的最佳光照条件下,瞬时表达的水平是低的。
低分子量的酚化合物(乙酰丁香酮)和monosaccharaides(葡萄糖)是已知的诱导vir基因的根癌农杆菌 55,61。此外,N的渗透本塞姆氏烟草的二元载体pCAMBIA(GFP)的乙酰丁香酮的存在下,在50-600μM的浓度,显示出稍有增加的瞬态基因表达40。我们研究了不同浓度的乙酰丁香酮和葡萄糖在我们的系统中的作用,加入这些化合物GV3101文化窝藏pBID4-GFP在MMA 3小时,并在发现GFP的表达无明显差异。有趣的是,GV3101文化窝藏pBID4-GFP和稀释于Milli-Q水中的0.5的A 600和渗透而不对vir基因的诱导表达的GFP的相同量的那些渗入了诱导的培养。该A.农杆菌vir区基因(次)可能由植物酚类化合物(乙酰丁香酮和芥子酸)和植物monosaccharaides(葡萄糖和果糖)本叶组织中被诱导。因此,我们推测,在外感vir区基因诱导物的存在或不存在的GFP表达水平相似的可能是在植物细胞中表达GFP的发射矢量的复制过程中存在胞质vir区基因诱导剂的作用的结果。
<p class=“jove_content”>野生型N。本塞姆氏烟草已被用来作为一种模式的主机的瞬态蛋白生产49。然而, 本氏烟的比较低的生物质产量阻碍其大规模生产重组蛋白的应用。最优的主机应结合高水平瞬时表达的,易于生长在温室中,并易受农杆菌浸润2。选择其他主机,我们渗透烟草 ( 烟草本塞姆氏和N精益求精 )的两个不同的野生型品种和混合N. excelsiana(本氏烟×N。精益求精 )与A。农杆菌菌株GV3101窝藏pBID4-GFP质粒。在这三种物种,GFP的表达水平是在N.略高本塞姆氏。N.精益求精的植株难以真空农杆菌由于其坚韧的叶子,和N。 excelsiana生产约2倍在相同生长条件下更多的生物量。瞬态生产的GFP在7 dpi的是N。比较相似本生和N。 excelsiana。因此,N。 excelsiana可能是更合适的宿主生产重组蛋白质。农杆菌介导的瞬时蛋白质的生产是通过PTGS 26,其可通过共表达的基因沉默植物病毒起源62的抑制剂可以克服的限制。瞬态蛋白生产先前已显示出提高了50倍于TBSV的P19蛋白质,其抑制PTGS中渗入组织34的存在。在我们的研究中,我们评估了两种病毒沉默抑制子(P19和P23)分别共同渗透,推出矢量pBID4-HAC1的效果。共渗这些沉默抑制子的似乎对HAC1的瞬时表达的影响不大,在HAC1仅略有增加蛋白的积累(15-25%)在共同渗透P23或P19的存在。积极影响蛋白的生产,沉默抑制可能需要被具体地选择为有效的靶向植物种类和病毒载体63。烟草花叶病毒解螺旋酶具有RNA沉默活性的64,65的抑制器。我们的数据证实了这种观察作为共渗P23或P19用pBID4-HAC1的导致不增加GFP或在瞬时的HAC1蛋白的生产略有增加。
总之,我们修改和优化厂房及农杆菌生长条件,提高真空渗透效率。这种技术使我们能够在几个小时内生长和渗透几百千克植物材料。我们成功地为自动化高通量疫苗生产在工业规模工厂的瞬态表现手法下,现行良好制造规范(cGMP)的条件。 ABO血型的更多信息UT自动化和利用植物瞬时蛋白质生产系统生产重组蛋白,包括亚单位疫苗候选,cGMP的条件下,读者可以参考该网站www.fhcmb.org/ 。
The authors have nothing to disclose.
本工作为分子生物技术,iBio,公司和美国国防部高级研究计划局(赠款#HDTRA1-07-C-0054)支持由Fraunhofer美国中心。作者承认了丰厚的礼品由Drs。生物科学系,美国普渡大学( 根癌农杆菌株)和大型生物公司的韦恩·菲茨莫里斯(N. excelsiana种子),以及美国烟草收集,北卡罗莱纳州立大学(N.精益求精种子詹妮弗·尼科尔森斯坦顿Gelvin )。作者感谢玛格丽特SHILLINGFORD和克里斯托弗·赫尔提供植物和优良的技术援助。作者还感谢博士。斯蒂芬Streatfield和娜塔莎Kushnir的编辑协助。
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |