ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.
ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium בצמחים הוא גישה מבטיחה לייצר אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים בתוך תקופה קצרה של זמן. עם זאת, טכנולוגיה זו היא רק מתחילה להיות מיושמת על מכשולים טכנולוגיים רבים ייצור בקנה מידה גדולה בהיקף של עד הם עתה להתגבר עליו. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה ולשעתק לייצור חלבון חולף בקנה מידה תעשייתית המבוססים על חדירת אבק של צמחי Nicotiana עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה. אופטימיזציה של טיפוח Agrobacterium במדיום AB מאפשרת דילול ישיר של תרבות החיידקים במים מילי-Q, לפשט את תהליך החדירה. בין שלושה מינים שנבדקו של Nicotiana, נ ' excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) נבחר כמארח המבטיח ביותר בשל הקלות של חדירה, רמה גבוהה של ייצור חלבון כתב, ועל שני-fייצור ישן גבוה יותר ביומסה בתנאים סביבתיים מבוקרים. אינדוקציה של Agrobacterium מחסה pBID4-GFP (מבוסס נגיף פסיפס טבק) שימוש בכימיקלים כגון acetosyringone וmonosaccharide לא הייתה השפעה על רמת ייצור החלבון. צמח שחדר מתחת 50-100 mbar ל30 או 60 שניות הביא לחדירת% על 95 של רקמות עלים צמח. הסתננות עם GV3101 זן המעבדה Agrobacterium הראתה ייצור החלבון הגבוה ביותר בהשוואה לזני Agrobacteria מעבדה LBA4404 וC58C1 ופראי מהסוג Agrobacteria זני at6, at10, at77 וA4. שיתוף ביטוי של השתקת RNA נגיפי מדכא, p23 או p19, בנ benthamiana הביא להצטברות מוקדם יותר וייצור מוגבר (15-25%) חלבון המטרה (hemagglutinin וירוס שפעת) של.
צמחי החברה מוכרים כפלטפורמה בטוחה, אמינה, ניתן להרחבה וזולה לייצור תרופות הביולוגיים רקומביננטי Heterologous וחלבונים תעשייתיים 1-3 ויש לי יתרונות חשובים על פני מערכות ביטוי תא של חיידקים ובעלי חי 4. צמחים מסוגלים לבטא חלבונים מקופלים בצורה נכונה עם שלאחר translational שינויים, כולל נוגדנים Multimeric התאספו 5-7. חלבונים רקומביננטיים תרופות צמחיות כמה עוברים הערכה קלינית 8. אלה כוללים חיסוני מטופל ספציפי רקומביננטי אזוטיפ (scFv) לטיפול בלימפומה שאינה הודג'קין 9, מגיפה מבוססת hemagglutinin ומועמדים חיסון שפעת עונתיים 10,11 (קאמינגס et al., שהוגש לחיסון), אני אנטיגן פני השטח נגד סטרפטוקוקוס / נוגדן השני לטיפול בעששת 12, והאינסולין אנושי לטיפול בסוכרת 13. יתר על כן, reco אדםglucocerebrosidase mbinant לטיפול בתחליפי אנזים בחולים עם מחלת גושה כבר אושר בישראל ובארצות הברית, והוא ניתן במסגרת תכנית הגישה המורחבת מחוץ לארה"ב 14,15.
ניתן לייצר חלבוני Heterologous בהפכו ביציבות (מהונדס או transplastomic) או צמחים הפכו transiently. ייצור חלבון חולף מציע מספר יתרונות על פני ייצור בצמחים הטרנסגניים, כוללים פרק זמן קצר כדי להשיג ביטוי והצטברות 16, ויכול להיות מושגת על ידי החדרת וקטורים בינאריים חיידקים או וקטורים ויראליים צמח רקומביננטי לתוך רקמות צמח 4. מערכת הביטוי חולפת המתקדמת ביותר מבוססת על השימוש ב'וקטורי השקה 'המשלבים רכיבים של וירוסי צמחים ופלסמידים בינארי, ומועברים על ידי agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration של וקטור השקה המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) יושם בהצלחה במעבדהאת קנה המידה כדי לייצר אנטיגנים חיסון נגד פתוגנים כגון וירוס הפפילומה אנושי 19, Yersinia pestis 20, שפעת וירוסים, anthracis Bacillus 21,22 23, ונגיף אבעבועות שחורות 24 בנ benthamiana עוזב. ביטוי חולף בתיווך Agrobacterium הוא גם שיטה מבטיחה לייצור בו זמני של חלבונים רבים 2,25-27. לדוגמא, מערכות ביטוי חולפות צמח היו בשימוש כדי לייצר נוגדני גידול ספציפי רקומביננטי 28,29, נוגדן מסוכר רקומביננטי כנגד הקולטן לגורם גדילה באפידרמיס 30, ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים לאנטיגן מגן האנתרקס 31,32. שיתוף חדירה של צמחי benthamiana Nicotiana עם גן מטרה ומדכא של תוצאות להשתקת גנים בביטוי חלבון המטרה משופרת 33,34.
Agroinfiltration היא שיטה נפוצה לintrodu אחידחיידקי cing מחסה גן של עניין למפעל רקמות 35-37. חדירת אבק של Agrobacterium לביטוי גנים חולף בצמח שלם משאיר היא שיטה מהירה, ניתן להרחבה, ושימושית לייצור של חלבונים זרים ללא הצורך לייצר צמחים מהונדסים 38-41. במהלך agroinfiltration ואקום, צמחים התהפך במהופך וחלקי אוויר שקוע בהשעית Agrobacterium. אז ואקום מיושם גורם גזים לפינוי מחללים אינטר עלה דרך הפיוניות. השחרור מחדש על לחץ הבא מהיר של תוצאות הוואקום בעירוי של ההשעיה Agrobacterium לעלה. בעקבות חדירת אבק של Agrobacteria, צמחי מעובדות נוספות וביטוי היעד הוא תחת פיקוח. הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי היעד הם נצפו בדרך כלל 2-3 ימים שלאחר חדירה (dpi) עם וקטור בינארי ו4-7 dpi עם וקטור השקה, לאחר שרמת הביטוי בדרך כלל decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens הוא הרכב הנפוץ ביותר להעברת גן של עניין למפעל לייצור חלבון. Agroinfiltration עובד מצוין בנ benthamiana אבל יחסית גרוע ברוב הצמחים אחרים, כולל thaliana ארבידופסיס 46.
במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית לייצור חלבון חולף בנ 'בן השבוע 5-6 benthamiana באמצעות א tumefaciens הסתננות. החסרון העיקרי של קנה מידה תעשייתית של טכניקת agroinfiltration הוא צנטריפוגה של חיידקים וresuspension של גלולה החיידקים במצע המכילה 4'-hydroxy-3 שנקטפו ", 5'-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), מונוסכרידים, ו 2 – (N-morpholino) -Ethanesulfonic חומצה (MES) חיץ לאינדוקציה של גנים vir. אנחנו כבר מסוגלים להתגבר על בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של Agrobacterium </em> צמיחה במדיום AB (מדיום מינימאלי) ואחריו ישירות דילול במים מילי-Q ועל ידי שליטה על משך החדירה ותנאים. יש לנו גם בהשוואה ייצור חלבון המטרה בנ 'מיני מארח טבק wild-type benthamiana ונ ' נסורת, כמו גם בנ ההיברידי excelsiana.
במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול agroinfiltration פשוט לייצור חלבון חולף שיגרתי במינים Nicotiana נבחרו באמצעות זני Agrobacterium נושאים את וקטור השיגור. בנוסף, יש לנו זיהינו את התנאים האופטימליים כדי להשיג את רמת ייצור חלבון הגבוהה ביותר רקומביננטי במערכת הביטוי שלנו חולפת צמח.
חדירת אבק של א 'בדילול tumefaciens GV3101 זן מחסה pBID4 וקטור ההשקה לנ benthamiana, נ ' excelsiana ונ 'הנסורת הביאו לרמות גבוהות יותר של ייצור חלבון המטרה תוך 7 dpi בהשוואה למינים צמחים אחרים, כגון Pisum sativum הסתנן עם GV3101 מחסה וירוס פסיפס אספסת – או פסיפס מלפפון וקטורים מבוסס וירוס המבטאים את הגן המדווח GFP תחת אמרגן 35S סאטיבה 41, או lactuca, Solanum lycothaliana persicum וארבידופסיס הסתנן עם זן C58C1 של א ' tumefaciens נושא את גן הכתב בטא glucuronidase 57. נ benthamiana ונ ' excelsiana היו קל לואקום לחדור ב50 mbar עבור 30-60 שניות, עם 90-95% יעילות הסתננות. 5-10% הנותרים של אזור עלה לא הסתננו בגלל כמה צף של עלים על פני השטח של ההשעיה Agrobacterium במהלך היישום של הוואקום. מאז יש לו את וקטור השקת יכולת לתנועת תא אל התא 18, הצטברות חלבון חולפת מתרחשת בעלים שלמים, כמו גם פטוטרות ב7 dpi. ב10 dpi, ייצור ה-GFP המוערך היה נמוך במקצת בגלל וקטור ביטוי pBID4 הוא מסוגל לעבור מתא לתא, אך לא לעבור מערכתי 18; לכן, עלים גדלו חדש אינם מכילים את הווקטור ואינו תורמים לייצור של היעד. בנוסף, מ 'לאורך זמן פירוקו של חלבון רקומביננטיאיי לתרום לרמת חלבון מופחתת ב10 dpi. התוצאות שלנו הראו כי חדירה של א ' רמות גבוהות GV3101 מתח tumefaciens תיווך של ייצור חלבון החולף בנ benthamiana. יתר על כן, חלבון המטרה יכול להיות מהונדס כהתכת N-מסוף, טרמינל C-או פנימית לlichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, שהוא אנזים חום מthermocellum Clostridium ומקנה thermostability רבים יעד היתוך חלבון 18. הסתננות של נ ' benthamiana עם א ' tumefaciens wild-type זנים (at6, at10 וat77) מחסה הגן של עניין שהושרו על תסמינים מתונים או חמורים: סלסול עלים, התארכות פטוטרת, ומסתלסל. אין תסמינים פתולוגיים נצפו בנ benthamiana הסתנן עם GV3101 זן המעבדה מחסה וקטור pBID4 ריק, בעוד כמה גנים מוכנסים לתוך pBID4 והפכו למעבדת זני GV3101, C58C1 או LBA4404 עורר תגובות נמקים קלות ועלהירקון / מצהיבים סימפטומים באזורי שחדר של עלים. סימפטומים הנגרמים על ידי נימקי Agrobacterium wild-type או זני מנשקו בצמחי הסולניים כבר דיווחו בעבר 56,57. תגובת נמקים יכולה לנבוע מגורמים ארסי של מערכת הפרשת סוג III, חלבוני חיידקים מועברים לתא הצמח על ידי מערכת הפרשת סוג ד ', ו / או רגישות לflagellin 58-60. מצאנו כי ייצור חולף של חלבוני Heterologous עשוי גם לעורר פתוגניות ותגובת רגישות יתר בצמח חדר עוזבת. חוקרים רבים דיווחו agroinfiltration זה של מיני צמחים שונים עם וקטורים בינאריים מפעל מיוצרים עד לרמות גבוהות יותר 5-20 זמנים של ייצור חלבון חולף בהשוואה לצמחים הפכו ביציבות 28,57. הנתונים שלנו מראה שנ ' benthamiana הסתנן עם GV3101 מחסה רמות גבוהות של ה-GFP, שהיא דומה לתשואת ה-GFP דיווחה להביעו transiently pBID4-GFPנ benthamiana הסתנן עם Agrobacteria נושא את וקטור Pich-GFPSYS הנגיפי (עד 80% מחלבון מסיס בסך הכל) 44. Agroinfiltration באמצעות וקטור ההשקה שלנו הביא לייצור גבוה של חלבון LicKM החום, 50 לקפל גבוה יותר מזה שנצפה באמצעות פלסמיד בינארי סטנדרטי 18.
כדי לבדוק את ההדבקה של א ' tumefaciens והיציבות של וקטור ההשקה, אנחנו הסתננו שטוחים אחד נ benthamiana כל שעה עד 8 שעות שימוש באותה התרבות בדילול מים מילי-Q של GV3101 מחסה פלסמיד pBID4-GFP. הנתונים שלנו הראו כי מתח GV3101 הוא יעילות התולעת לפחות 8 שעות וpBID4 (וקטור ההשקה) הוא מאוד יציב במהלך החדירה ארוכת שעות 8.
מניית גליצרול של מתח GV3101 מחסה וקטור השקת pBID4-HAC1 (בנק תא) מאוחסן ב -80 C ° הוכח להיות מאוד יציב במשך שלוש שנים ללא שינויים בהגנה של מחזור חולףבייצור במפעלים שחדר.
צמחי נ benthamiana גדלו בתנאים אופטימליים ובין 35 42 הודעה ימי זריעה היו אופטימליים לביטוי ואקום בתיווך החדירה חולף גן 40. צמחים צעירים יותר (3-4 שבועות) לא יכולים להיות שחדר כולו בגלל עלים צפים על פני ההשעיה תא ונזק לרקמות מפני ההשפעות מכאניות של החלת ואקום. בצמחים מבוגרים יותר מ45 ימים, נ ' benthamiana הנעילה במה, בתנאי האור האופטימלי בשימוש, ברמה של ביטוי החולף היא נמוכה.
תרכובות פנוליות נמוכה מולקולריות משקל (acetosyringone) וmonosaccharaides (גלוקוז) ידועים כדי לגרום לגני vir בא tumefaciens 55,61. יתר על כן, חדירה של נ ' benthamiana עם pCAMBIA ינארי הווקטור (GFP) בנוכחות acetosyringone בריכוזים של 50-600 מיקרומטר הוצג כדי להגדיל מעט חולף ביטוי גנים 40. אנחנו בחנו את ההשפעה של ריכוזים שונים של acetosyringone וגלוקוז במערכת שלנו על ידי הוספת תרכובות אלה לתרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP בMMA למשך 3 שעות, ולא מצאנו הבדל בביטוי של GFP. מעניין, תרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP ומדולל במים מילי-Q ל600 של 0.5 והסתננו ללא האינדוקציה גן vir הביעו אותן כמויות של ה-GFP כמו אלה הסתננו עם תרבויות מושרה. א גן tumefaciens vir (ים) שעלול להיגרם על ידי תרכובות פנוליות צמח (acetosyringone וחומצת sinapinic) וmonosaccharaides צמח (גלוקוז ופרוקטוז) הנמצא ברקמת עלה. לכן, אנו משערים כי רמות דומות של ביטוי ה-GFP בנוכחותו או היעדריו של מעוררי גן vir אקסוגני עשויות להיות תוצאה של השפעת מעוררי גן vir cytoplasmic הנוכחים במהלך השכפול של וקטור ההשקה-GFP-לבטא בתאי צמח.
<p class= "Jove_content"> נ Wild-type benthamiana שמש כמארח מודל לייצור חלבון חולף 49. עם זאת, תשואה ביומסה נמוכה יחסית נ 'של benthamiana מעכבת את בקשתה לייצור בקנה מידה גדולה של חלבונים רקומביננטיים. המארח האופטימלי צריך לשלב רמה גבוהה של ביטוי חולף, צמיחה קלה בחממה, ולהיות רגיש לAgrobacterium חדירה 2. כדי לבחור מארח חלופי, אנו הסתננו שני מינים בטבע מהסוג שונים של Nicotiana (נ benthamiana ונ 'אקסלסיור) ונ' היברידי excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) עם א ' tumefaciens GV3101 זן מחסה פלסמיד pBID4-GFP. בין שלושת המינים הללו, רמת הביטוי של GFP הייתה מעט גבוהה יותר בנ benthamiana. נ צמחי נסורת הראו קושי בagroinfiltration ואקום בשל העלים העור שלהם, ונ ' excelsianaמיוצר כשני לקפל יותר ביומסה באותם תנאי גידול. הייצור הארעי של ה-GFP ב7 dpi הוא יחסית דומה בנ benthamiana ונ ' excelsiana. לכן, נ ' excelsiana עשוי להיות מארח מתאים יותר לייצור חלבון רקומביננטי.ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium מוגבל על ידי 26 PTGS, שניתן להתגבר על ידי שיתוף ביטוי של השתקת גני מדכאי ממוצא וירוס צמח 62. ייצור חלבון חולף כבר הראה בעבר להיות משופר פי 50 בנוכחותו של חלבון p19 של TBSV, אשר מעכב PTGS ברקמות הסתננו 34. במחקר שלנו, העריך את ההשפעה של שני מדכאי נגיפיים השתקה (p19 ו p23) בנפרד שיתוף הסתננו עם וקטור השקת pBID4-HAC1. שיתוף ההסתננות של מדכאי השתקה אלה נראית שיש השפעה מועטת על ביטוי חולף של HAC1, עם עלייה קלה בלבד בHAC1הצטברות חלבון (15-25%) בנוכחות של p23 או p19 שיתוף הסתנן. כדי להשפיע על ייצור חלבון באופן חיובי, מדכאי השתקה ייתכן שיהיו הצורך שנבחרו במיוחד כדי להיות יעיל עבור מיני צמחים הממוקדים ווקטור ויראלי 63. יש helicase TMV מדכאי פעילות השתקת RNA 64,65. הנתונים שלנו לאשר תצפית זו כמו שיתוף ההסתננות של p23 או p19 עם pBID4-HAC1 לא גרמה לעלייה בGFP או עלייה קלה בייצור חלבון HAC1 החולף.
לסיכום, יש לנו שונה ומותאם צמח ותנאי גידול Agrobacterium ושיפרו את היעילות של חדירת אבק. טכנולוגיה זו אפשרה לנו לגדול ולחדור מאות קילוגרמים של חומר צמחי בכמה שעות. אנחנו אוטומטיים בהצלחה טכניקת הביטוי חולפת המפעל לייצור חיסון תפוקה גבוהה בקני מידה תעשייתיות בשיטות ייצור טוב הנוכחיות תנאים (cGMP). לקבלת מידע נוסף אבוהאוטומציה ut וניצול של מערכת הצמח חולפת חלבון הייצור לייצור חלבונים רקומביננטיים, כולל מועמדי חיסון למקטע, תחת תנאי cGMP, קוראים מופנים לאתר www.fhcmb.org/.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי Fraunhofer מרכז ארה"ב למולקולרית וביוטכנולוגיה, iBio, Inc וביטחון מחקר מתקדם פרויקטים סוכנות (# מענק HDTRA1-07-C-0054). המחברים מודים מתנות הנדיבות על ידי בני הזוג. סטנטון Gelvin של מדע ביולוגי חוג, אוניברסיטת פרדו (Agrobacterium tumefaciens זנים) וויין פיצמוריס לביולוגיה קורפ בקנה מידה גדולה (זרעי excelsiana נ '), כמו גם ג'ניפר ניקולסון של ארה"ב Nicotiana אוסף, צפון קרוליינה סטייט (זרעי נסורת נ ). המחברים מודים מרגרט Shillingford וכריסטופר האל על מתן צמחים וסיוע טכני מעולה. המחברים מודים גם בני הזוג. סטיבן Streatfield ונטשה קושניר למערכת סיוע.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |