Indirekte immunfluorescens (IIF) assays har tradisjonelt blitt brukt for påvisning av antinukleære antistoffer (ANA) i humant serum. Tilstedeværelsen av disse antistoffer kan hjelpe til ved diagnostisering av systemiske autoimmune revmatiske sykdommer (SArd). Denne protokollen demonstrerer hvordan du effektivt utføre IIF teknikk for å oppdage nøyaktig disse autoantistoffer.
The American College of Rheumatology standpunkt på ANA testing fastsetter bruk av IIF som gullstandarden metode for ANA screening en. Selv IIF er en utmerket screening test på ekspert hender, de tekniske vanskeligheter for behandling og lese IIF glir – slik som arbeidskrevende glide behandling, manuell avlesning, behovet for erfarne, trent teknologer og bruk av mørkt rom – å gjøre det IIF metoden vanskelig å få plass i arbeidsflyten av moderne, automatiserte laboratorier.
Den første og avgjørende skritt mot høy kvalitet ANA screening er forsiktig lysbilde behandling. Denne fremgangsmåte er arbeidskrevende, og krever full forståelse av prosessen, så vel som hensyn til detaljer og erfaring.
Bilde lesing er utført av fluoriserende mikros i mørke rom, og er gjort av kvalifiserte teknologer som er kjent med de ulike mønstre, i sammenheng med cellesyklusog morfologi av interfase og delende celler. Forutsatt at IIF er den første linjen screening verktøy for SARD, forstå fremgangsmåten for å riktig utføre denne teknikken er kritisk.
Nylig, har digitale bildebehandlingssystemer blitt utviklet for automatisk avlesning av IIF lysbilder. Disse systemene, som for eksempel NOVA Vis Automated fluorescerende mikroskop, er utviklet for å effektivisere rutine IIF arbeidsflyt. NOVA Vis kjøper og lagrer høyoppløselige digitale bilder av brønnene, og dermed skille image oppkjøpet fra tolkning; Bildene viste en tolket på høyoppløselige dataskjermer. Den lagrer bilder for fremtidig referanse og støtter operatørens tolkning ved å gi fluorescerende lys intensitet data på bildene. Det er også foreløpig kategoriserer resultatene som positive eller negative, og gir mønstergjenkjenning for positive prøver. I sammendraget, eliminerer behovet for mørkerom, og automatiserer og effektiviserer IIF reading / tolkning arbeidsflyt. Viktigst, øker det konsistens mellom lesere og opplesninger. Dessuten, med bruk av strekkode slides, blir transkripsjon feil elimineres ved å gi prøve sporbarhet og positiv pasientidentifikasjon. Dette resulterer i økt pasientdataintegritet og sikkerhet.
Det overordnede målet med denne videoen er å vise IIF prosedyren, inkludert lysbilde behandling, identifisering av felles IIF mønstre, og innføring av nye fremskritt for å forenkle og harmonisere denne teknikken.
Betegnelsen antinukleære antistoffer (ANA) beskriver en rekke av auto-antistoffer som reagerer med bestanddeler av cellekjerner, inkludert DNA, proteiner og ribonucleoproteins 1, 2. Hep-2 celle, en innfødt protein array med hundrevis av antigener, gir et ideelt underlag for påvisning av ANA en. Påvisning av ANA i humant serum er et viktig verktøy for screening bindevevssykdommer, og IIF er referansemetoden for testing av en ANA. Nylig, IIF på HEp-2-celler er blitt erstattet i noen laboratorier med antigen-spesifikke immunanalyser og multipleks-metoder. På grunn av bekymringer over falske negative resultater og mangel på åpenhet for klinikere, American College of Rheumatology dannet en arbeidsgruppe som konkluderte med at IIF bruker HEp-2 celler bør være "gullstandarden" for ANA screening en.
På grunn av den subjektive natur ANA screening, er kvaliteten på HEp-2-celler itegral til nøyaktig og trygg rapportering av resultater. Tilstedeværelse av et høyt antall av mitotiske celler, optimal cellemorfologi, tilstrekkelig til konfluens, og ekspresjon av relevante antigener er spesielt viktige. IIF mønstergjenkjenning fungerer som et viktig verktøy for å hjelpe til pasientens diagnose. Forstå betydningen av ulike mønstre gjør at klinikere og laboratoriepersonell til å utføre den aktuelle oppfølging testing for å bekrefte diagnosen. For eksempel kan homogene ANA mønster forekommer i nærvær av anti-dsDNA-eller kromatin-antistoffer, og kan være assosiert med systemisk lupus erythematosus (SLE) 3. Fra den andre siden, har det nylig blitt beskrevet at den såkalte tette fin flekkete mønster (DFS) som vanligvis ses hos opptil 12% av rutineprøver, for det meste blitt assosiert med anti DFS70 antistoffer. Disse autoantistoffer, da funnet i isolasjon (uten andre sykdomsspesifikke ANA) er ikke assosiert med systemiske autoimmune revmatiske sykdommer <sup> 4-9. Dermed bekreftende testing for anti-DFS70 antistoffer kan bidra til å redusere unødvendig refleks testing, gir store kostnadsbesparelser, og lette pasientens angst.
Gitt at IIF er den første linjen screening metode for å påvise antistoffer, er det viktig at brukeren forstår hvordan valg av reagenser og vev underlag kan påvirke resultatene. Siden IIF teknikken er i seg selv subjektivt, er det viktig at reagensene som benyttes gi den høyeste kvalitet.
Dette målet av denne videoen protokollen er å sette brukeren med de riktige trinnene for å utføre IIF metoden, de vanlige mønstre knyttet til ANA, og å innføre nye fremskritt som kan effektivisere laboratoriet arbeidsflyt og standardisere resultatene.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cassandra Bryant for å utføre IIF eksperiment og Carol Buchner for hennes ekspert teknisk gjennomgang.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |