Indirekte immunofluorescens (IIF) assays er traditionelt blevet anvendt til påvisning af antinukleare antistoffer (ANA) i humant serum. Tilstedeværelsen af disse antistoffer kan støtte i diagnosticering af systemiske autoimmune reumatiske sygdomme (SARD). Denne protokol viser, hvordan man effektivt udfører IIF teknik til præcist at opdage disse autoantistoffer.
American College of Rheumatology position erklæring om ANA test fastsætter anvendelse af IIF som guldstandarden metode til ANA screening 1. Selvom IIF er en fremragende screening test i ekspert hænder, de tekniske vanskeligheder for forarbejdning og læsning IIF slides – såsom arbejdskrævende slide behandling, manuel aflæsning, behovet for erfarne, uddannede teknologer og brugen af mørkt rum – gør IIF-metoden svært at passe i arbejdsgangen af moderne, automatiserede laboratorier.
Det første og afgørende skridt i retning af høj kvalitet ANA screening er omhyggelig slide forarbejdning. Denne procedure er arbejdskrævende, og kræver fuld forståelse af processen, samt opmærksomhed på detaljer og erfaring.
Slide læsning er udført af fluorescerende mikroskopi i mørke rum, og er udført af uddannede teknologer, der er bekendt med de forskellige mønstre i forbindelse med cellecyklusog morfologi interfase og delende celler. Forudsat at IIF er den første linje screeningsværktøj til SARD forstå de skridt til korrekt udføre denne teknik er kritisk.
For nylig er der blevet udviklet digital billedbehandling systemer til automatiseret læsning af IIF dias. Disse systemer, såsom NOVA View Automated fluorescerende mikroskop, er designet til at strømline den rutinemæssige IIF workflow. NOVA View erhverver og gemmer højopløselige digitale billeder af brøndene, og dermed adskille billede erhvervelse fra fortolkning; billederne ses en fortolket på høj opløsning computerskærme. Den gemmer billeder til fremtidig reference og støtter operatørens fortolkning ved at give fluorescerende lys intensitet data om billederne. Det er også foreløbigt kategoriserer resultater som positiv eller negativ, og giver mønstergenkendelse for positive prøver. Sammenfattende det eliminerer behovet for mørkekammer, og automatiserer og strømliner IIF om enhedenng / tolkning workflow. Vigtigst er det, det øger overensstemmelsen mellem læsere og aflæsninger. Desuden med brug af stregkoder dias, er transskriptionsfejl elimineres ved at prøve sporbarhed og positiv patient identifikation. Dette resulterer i øget patientsikkerhed dataintegritet og sikkerhed.
Det overordnede mål med denne video er at demonstrere IIF proceduren, herunder slide behandling, identifikation af fælles IIF mønstre, og indførelsen af nye fremskridt for at forenkle og harmonisere denne teknik.
Udtrykket antinuclear antistof (ANA) beskriver en række autoantistoffer, som reagerer med bestanddele af cellekerner inklusive DNA, proteiner og ribonucleoproteiner 1, 2. Den HEp-2 celle, et nativt protein array med hundreder af antigener, tilvejebringer et ideelt substrat til påvisning af ANA 1. Påvisning af ANA i humant serum er et vigtigt screeningsværktøj til bindevævssygdomme, og IIF er referencemetoden for ANA test af 1.. For nylig har IIF om HEP-2 celler blevet erstattet i nogle laboratorier med antigen-specifikke immunanalyser og multiplex metoder. Grund af bekymring over falske negative resultater og den manglende gennemsigtighed for klinikere, American College of Rheumatology dannet en taskforce, der konkluderede, at IIF hjælp HEP-2 celler skal være "gold standard" for ANA screening 1.
På grund af den subjektive natur af ANA screening, kvaliteten af HEp-2-celler iTegral til nøjagtige og selvsikker rapportering af resultater. Tilstedeværelsen af et stort antal mitotiske celler, optimal cellemorfologi tilstrækkelig konfluens og ekspression af relevante antigener er særligt vigtige. IIF mønstergenkendelse fungerer som et vigtigt redskab til at støtte patientens diagnose. Forstå betydningen af forskellige mønstre gør det muligt for klinikere og laboratorie personale til at udføre den relevante opfølgning test for at bekræfte diagnosen. For eksempel kan homogen ANA mønster forekommer i tilstedeværelsen af anti-dsDNA eller kromatin antistoffer og kan være forbundet med systemisk lupus erythematosus (SLE) 3. Fra den anden side, er det for nylig blevet beskrevet, at den såkaldte tætte fine spættede mønster (DFS), der ofte ses i op til 12% af rutinemæssige prøver, for det meste har været forbundet med anti-DFS70 antistoffer. Disse autoantistoffer, da de blev fundet i isolation (uden anden sygdom-specifikke ANA) er ikke forbundet med systemiske autoimmune gigtsygdomme <sup> 4-9. Derved bekræftende test for anti-DFS70 antistoffer kan hjælpe med at reducere unødvendige refleks test, tilbyder betydelige omkostningsbesparelser, og lette patientens angst.
Da IIF er den første linje screening metode til at opdage autoantistoffer, er det altafgørende, at brugeren forstår, hvordan udvælgelsen af reagenser og væv substrater kan påvirke resultaterne. Da IIF teknik er i sagens natur subjektive, er det vigtigt, at de anvendte reagenser levere den højeste kvalitet.
Dette mål af denne video protokol er at gøre brugeren med de rigtige skridt, der er nødvendige for at udføre IIF-metoden, de fælles mønstre forbundet med ANA, og indføre nye fremskridt, som kan effektivisere arbejdsgangen laboratorium og standardisere resultater.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cassandra Bryant til at udføre IIF eksperimentet og Carol Buchner for hendes ekspert teknisk gennemgang.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |