Immunofluorescenza indiretta (IIF) saggi sono stati tradizionalmente utilizzati per il rilevamento di anticorpi antinucleo (ANA) nel siero umano. La presenza di questi anticorpi può aiutare nella diagnosi delle malattie autoimmuni sistemiche reumatiche (SARD). Questo protocollo viene illustrato come eseguire efficacemente la tecnica IIF di rilevare con precisione questi autoanticorpi.
L'American College of Rheumatology posizione dichiarazione sui test ANA prevede l'uso della IIF come metodo gold standard per lo screening ANA 1. Anche se IIF è un ottimo test di screening in mani esperte, le difficoltà tecniche di lavorazione e la lettura IIF scivoli – come il lavoro di elaborazione intensiva diapositiva, lettura manuale, la necessità di esperti, tecnici qualificati e l'uso di camera oscura – rendere il metodo IFI difficile da inserire nel flusso di lavoro dei laboratori moderni, automatizzati.
Il primo e fondamentale passo verso lo screening ANA di alta qualità è l'elaborazione di diapositive attenta. Questa procedura è laborioso, e richiede una piena comprensione del processo, così come l'attenzione ai dettagli e l'esperienza.
Lettura diapositiva viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza in stanze buie, ed è fatto da tecnici qualificati che hanno familiarità con i vari modelli, nel contesto del ciclo cellularee la morfologia di interfase e cellule in divisione. A condizione che IIF è il primo strumento di screening online per SARD, capire i passaggi per eseguire correttamente questa tecnica è fondamentale.
Recentemente, sistemi di imaging digitale sono stati sviluppati per la lettura automatica di diapositive IIF. Questi sistemi, come il NOVA Visualizza Automated fluorescente Microscopio, sono progettati per semplificare il flusso di lavoro di routine IIF. NOVA View acquisisce e memorizza ad alta risoluzione le immagini digitali dei pozzetti, separando così l'acquisizione di immagini da interpretazione; le immagini vengono visualizzate una interpretazione sui monitor dei computer ad alta risoluzione. Memorizza le immagini per riferimento futuro e sostiene l'interpretazione dell'operatore, fornendo dati di intensità di luce fluorescente sulle immagini. Inoltre categorizza preliminarmente risultati come positivi o negativi, e prevede il riconoscimento di forme per i campioni positivi. In sintesi, si elimina la necessità di camera oscura, e automatizza e semplifica la prontezza IIFworkflow ng / interpretazione. Ancora più importante, aumenta la coerenza tra i lettori e letture. Inoltre, con l'uso di diapositive barcode, errori di trascrizione sono eliminati fornendo tracciabilità campione e identificazione del paziente. Ciò si traduce in una maggiore integrità dei dati del paziente e la sicurezza.
L'obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare la procedura IIF, tra cui l'elaborazione di diapositive, l'identificazione di modelli comuni IIF, e l'introduzione di nuovi progressi per semplificare e armonizzare questa tecnica.
Il termine anticorpi antinucleo (ANA) descrive una varietà di autoanticorpi che reagiscono con costituenti dei nuclei delle cellule, tra cui DNA, proteine e ribonucleoproteine 1, 2. La cella HEp-2, una matrice proteina nativa con centinaia di antigeni, fornisce un substrato ideale per il rilevamento di ANA 1. Il rilevamento di ANA nel siero umano è un importante strumento di screening per le malattie del tessuto connettivo, e IIF è il metodo di riferimento per il test ANA 1. Recentemente, IFI su cellule HEp-2 è stato sostituito in alcuni laboratori con i dosaggi antigene-specifiche e metodi multiplex. A causa di preoccupazioni risultati falsi negativi e la mancanza di trasparenza ai clinici, l'American College of Rheumatology ha formato una task force che ha concluso che IIF utilizzando cellule HEp-2 dovrebbe essere il "gold standard" per ANA di screening 1.
A causa della natura soggettiva dello screening ANA, la qualità delle cellule HEp-2 è integrata di riferimento corretto e sicuro dei risultati. La presenza di un elevato numero di cellule mitotiche, morfologia ottimale delle cellule, confluenza sufficiente, e l'espressione di antigeni rilevanti sono particolarmente importanti. Pattern recognition IIF serve come uno strumento importante per aiutare nella diagnosi del paziente. Comprendere il significato dei vari modelli permette ai medici e personale di laboratorio per eseguire il test di follow-up adeguato per confermare la diagnosi. Ad esempio, omogeneo modello ANA può verificare in presenza di anti-dsDNA o anticorpi cromatina, e può essere associata a lupus eritematoso sistemico (SLE) 3. Dall'altro lato, è stato recentemente descritto che il cosiddetto modello denso bene a chiazze (DFS) che è comunemente visto in fino al 12% dei campioni di routine, è principalmente stata associata con anticorpi anti-DFS70. Questi autoanticorpi, quando si trova in isolamento (senza altri ANA malattia-specifica) non sono associati con malattie reumatiche autoimmuni sistemiche <sup> 4-9. In tal modo il test di conferma per gli anticorpi anti-DFS70 può aiutare a ridurre i test reflex inutili, offrire notevoli risparmi sui costi, e facilità l'ansia del paziente.
Dato che IIF è il primo metodo di screening linea per rilevare autoanticorpi, è fondamentale che l'utente capisce come la selezione dei reagenti e substrati tissutali possono influenzare i risultati. Poiché la tecnica IIF è intrinsecamente personale, è importante che i reagenti utilizzati forniscano risultati di ottima qualità.
Questo obiettivo di questo protocollo video è quello di familiarizzare l'utente con i passaggi corretti necessari per eseguire il metodo IFI, i modelli più comuni associati con ANA, e di introdurre nuovi progressi che possono semplificare il flusso di lavoro del laboratorio e standardizzare i risultati.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Cassandra Bryant per eseguire l'esperimento IIF e Carol Buchner per la sua esperta revisione tecnica.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |