間接免疫蛍光(IIF)のアッセイは伝統的に、ヒト血清中の抗核抗体(ANA)の検出のために使用されてきた。これらの抗体の存在が全身性自己免疫リウマチ性疾患(SARD)の診断を助けることができる。このプロトコルは、効果的に正確にこれらの自己抗体を検出するために、IIF法を実行する方法を示しています。
ANAのテストにリウマチのポジションステートメントのアメリカの大学は、全日空が1をスクリーニングするためのゴールドスタンダード方式としてIIFの使用を規定している。 IIFは、専門家の手の中に優れたスクリーニング検査ではあるが、加工、IIFを読み取る技術的な問題は、スライドさせる – このような労働集約型スライド処理、マニュアル読書、経験豊富なの必要性、訓練を受けた技術者や暗い部屋の使用など – IIFメソッドを作る近代的な、自動化された実験室のワークフローにフィットするのが難しい。
高品質のANAスクリーニングに向けた最初の重要なステップとは、慎重なスライド処理である。この手順では、労働集約的であり、完全なプロセスの理解だけでなく、細部や経験に注意を払う必要があります。
スライド読み出しが暗い部屋で蛍光顕微鏡によって行われ、細胞周期との関連で、様々なパターンに精通した技術者によって行われそして間期と分裂細胞の形態。 IIFは、SARDのための最初の行のスクリーニングツールであるという条件で、正確にこの手法を実行するための手順を理解することが重要です。
近年、デジタルイメージングシステムは、IIFスライドの自動読み取りのために開発されている。このような、NOVAビュー自動蛍光顕微鏡のようなこれらのシステムは、ルーチンのIIFのワークフローを合理化するために設計されています。 NOVAを表示することにより、読影からの画像取得を分離し、ウェルの高解像度デジタル画像を取得し、記憶する。画像は、高解像度のコンピュータモニタ上で解釈見られる。それは、今後の参考のために画像を格納し、画像上の蛍光強度データを提供することで、オペレータの解釈をサポートしています。また、予備的に正または負のような結果を分類し、陽性サンプルのためのパターン認識を提供しています。要約すると、IIF readiを暗室の必要性を排除し、自動化し、合理化NG /解釈ワークフロー。最も重要なことは、読者と読みの間の一貫性を向上させます。また、スライドバーコードを用いて、転写エラーがサンプルのトレーサビリティと、正の患者識別を提供することによって除去される。これは増加した患者データの整合性と安全性をもたらす。
このビデオの全体的な目標は、スライド処理、共通IIFパターンの識別、およびこの手法を簡素化し、調和させる新たな進歩の導入など、IIFの手順を示すことである。
長期抗核抗体(ANA)は、DNA、タンパク質およびリボ核タンパク質1、2を含む細胞核の成分と反応する自己抗体の様々を説明しています。 HEP-2細胞、抗原の何百もの天然のタンパク質配列は、全日空1の検出のための理想的な基板を提供する。ヒト血清中のANAの検出は、結合組織疾患のための重要なスクリーニングツールであり、IIFは、ANA 1を試験するための参照方法である。最近では、HEp-2細胞でのIIFは、抗原特異的免疫アッセイおよび多重方法でいくつかの研究室で置き換えられました。原因偽陰性の結果に対する懸念や臨床医への透明性の欠如のために、米国リウマチ学会は、HEp-2細胞を用いて、IIFは、ANAは1をスクリーニングするための「ゴールドスタンダード」であるべきと結論付けたタスクフォースを結成した。
ANAによるスクリーニングの主観的な性質のために、HEp-2細胞の品質である結果の正確かつ自信を持って報告にtegral。有糸分裂細胞の高い数が、最適な細胞形態、十分なコンフルエン、関連抗原の発現の存在は特に重要である。 IIFパターン認識は、患者の診断を支援するための重要なツールとして機能する。様々なパターンの重要性を理解することは、臨床医や検査技師が診断を確定するために、適切なフォローアップのテストを実行することができます。例えば、均質ANAパターンは、抗dsDNA又はクロマチン抗体の存在下で起こり得る、および全身性エリテマトーデス(SLE)3に関連付けることができる。反対側から、近年、一般に、ルーチンサンプルの最大12%において見られる、いわゆる緻密な微細な斑点模様(DFS)は、主に抗DFS70抗体と関連していることが記載されている。 (他の疾患特異的ANAずに)単独で見られるこれらの自己抗体は、全身性の自己免疫リウマチ性疾患と関連していない<> 4-9 SUP。それによって、抗DFS70抗体に対する確認検査は、不要な反射テストを減らす大幅なコスト削減を提供し、患者の不安を和らげることができます。
IIFは、自己抗体を検出するための最初の行のスクリーニング方法であることを考えると、ユーザは、試薬および組織基質の選択は結果に影響を与えることができる方法を理解することが最も重要である。 IIF技術は本質的に主観的であるので、使用する試薬は、最高品質の結果を提供することが重要である。
このビデオプロトコルのこの目標は、IIF法、ANAに関連する共通のパターンを実行するために必要な正しい手順をユーザに慣れるために、実験のワークフローを合理化し、結果を標準化することができる新しい進歩を導入することである。
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
私たちは彼女の専門家の技術検討のためのIIF実験·キャロルブフナーを実行するためのカサンドラブライアントに感謝します。
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |